2.6.1 Sự hình thành mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không có lớp nhu mô. Mô sẹo đƣợc hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Điều quan trọng đƣợc nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là.: mô sẹo phát triển không theo quy luật nhƣng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Đặc điểm sinh trƣởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trƣờng nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa.
(1) Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô đƣợc đƣa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
(3) Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đƣờng trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Aitchison và ctv, 1977). Mô sẹo thƣờng có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Sự biệt hóa tế bào hình thành chất liệu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây, hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm sự tạo nên chồi và rễ.
Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo đƣợc tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dƣỡng (Street, 1969). Hildebrandt và ctv (1963) cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lƣợng đƣờng bổ sung trong môi trƣờng và cƣờng độ ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng quang tự dƣỡng của những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) nhƣ: cƣờng độ ánh sáng mạnh, ánh sáng màu xanh cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzyme, đƣờng thấp, auxin thấp, CO2 cao và tăng hàm lƣợng phosphate (Barz và Husemanm, 1982), và những tế bào quang tự dƣỡng này có khả năng cố định 14CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 cacbon (Yamada, Sato và Watanabe, 1982). Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này xảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội có số lƣợng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy, thành phần môi trƣờng nhất là hormon (Earle và Demarly, 1982). (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003)
Để tạo mô sẹo trong môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất sinh trƣởng, đôi khi có dịch chiết (Kordan, 1959). Phụ thuộc vào loại mô nuôi cấy mà chất sinh trƣởng thêm vào có khác nhau (Yeoman và Macleod, 1977). Chất hormon thƣờng tổ hợp thành 4 nhóm:
(1) Auxin (2) Cytokinin
(3) Auxin + Cytokinin (4) Dịch chiết
Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo đƣợc cấy chuyền. Môi trƣờng cấy chuyền cũng giống nhƣ môi trƣờng tạo mô sẹo nhƣng chất sinh trƣởng đƣợc giảm nồng độ. Kích thƣớc tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thƣờng cụm mô sẹo có kích thƣớc 5-10mm và có trọng lƣợng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy
chuyền là 20-30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thƣờng xuất hiện hai loại tế bào:
(1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng. (2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc. Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm.
2.6.2 Sự hình thành chồi từ mô sẹo
Sự hình thành chồi từ mô sẹo đƣợc kích thích bởi: - Các chất sinh trƣởng đƣa vào môi trƣờng. - Chất đƣợc sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo. - Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy.
Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài và sự hình thành tế bào xốp.
Sự hình thành chồi đƣợc điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944). Theo Trần Thanh Vân & Trinh (1978) sự hình thành chồi đƣợc điều khiển bằng:
- Tỷ lệ cytokinin / auxin từ 10-100.
- Cacbohydrate nhƣ sucrose và các chất hữu cở nhƣ casein hydrolysate. - Điều kiện nuôi cấy.
- Dịch chiết
Tạo rễ cần auxin, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng. Adenine sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi. Sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môi trƣờng không sinh trƣởng (Walker, Wendeln và Jaworski, 1979), hay có cytokinin và không có auxin (Gresshoff, 1978). Để tạo ra rễ thƣờng dùng phlorolgucinol + IBA có hiệu quả hơn chỉ dùng auxin. (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003)
2.7 Các nhóm chất kích thích ảnh hƣởng lên quá trình tạo mô sẹo 2.7.1 Auxin 2.7.1 Auxin
Auxin đƣợc khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đƣờng cong của loài Coléoptiles họ Graminées. Do có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào nên có tên nhƣ vậy. Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique.
2.7.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hòa khác. Các tác động của Auxin đƣợc thể hiện nhƣ sau:
- Kéo dài tế bào: làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nƣớc vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra.
- Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+, ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+
.
- Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp ARN robosomique.
- Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium. Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”.
- Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất ethylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở.
- Hoạt động trong các phản ứng về tăng trƣởng và trong các sự hỗ tƣơng giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ƣu thế của chồi non.
- Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái. - Có tác dụng kích thích tạo rễ.
2.7.1.2 Auxin trong cây trồng
Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất auxin sinh ra đƣợc hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non.
Auxin lƣu thông từ đỉnh xuống phần dƣới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng đƣợc thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhƣng trong quá trình chuyển vận này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng. Nhƣ vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trƣởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào.
2.7.1.3 Các chất auxin tổng hợp
Ngay từ khi auxin đƣợc nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hóa học đã đƣợc thí nghiệm. Một vài chất trong số này đã thể hiện những đặc tính tƣơng tự nhƣ đặc tính của auxin, nhƣng thƣờng với các liều lƣợng thấp hơn, hơn nữa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme, chúng có thể có một hoạt động kéo dài.
Trong số những chất đƣợc sử dụng, chúng ta có thể kể ra các chất chính sau: Acid indolylbutyrique (AIB)
Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng nhƣ: Acid naphtyloxyacetique (ANOA)
Acid naphtylacétamide (NAD)
Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4-D)
Trong thực tế, auxin có thể đƣợc sử dụng, nó ít độc nhƣng cũng ít hiệu quả bởi vì nó bị kiểm soát rất nhanh, chính vì vậy mà các chất tổng hợp đã thay thế chất auxin mặc dù chúng có những nguy hại về độc tính cao hơn.
Trong những ứng dụng thực tiễn, các chất có cấu trúc giống auxin đƣợc sử dụng để giâm cành, chúng đƣợc tìm thấy trong các ứng dụng quan trọng nhƣ: trong nghành cây ăn quả dùng để làm trống, sáng các quả, sự đậu quả hoặc còn để làm chậm sự thu hoạch quả.
Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống đƣợc sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng đƣợc nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn đƣợc dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả.
2.7.2 Cytokinine
Cytokinine đƣợc khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Ngƣời ta đã biết sự thêm nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập đƣợc một chất rất hoạt động mà ngƣời ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất.
Cytokinine là các chất adenine đƣợc thay thế, chất này đƣợc ngƣời ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:
Zeatine.
loại đƣợc sử dụng nhiều nhất là:
Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine).
Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine).
2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine
- Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhƣng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin: Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và Cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome.
- Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ.
- Hoạt động kích thích sự chuyển hóa, làm thuận lợi việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme li giải.
- Hiệu quả đối kháng của tính ƣu thế chồi non: các chồi nách đƣợc xử lí Cytokinine sẽ tăng trƣởng và cạnh tranh với chồi tận cùng.
- Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hóa.
2.7.2.2 Cytokinine trong cây trồng
Đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn Corynebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây.
2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
Dựa trên kỹ thuật chọn dòng đột biến in vitro, Steiner, đã chọn đƣợc dòng mía chống chịu bệnh mắt én (eyes spot), bệnh này do Helmintosporium sacchari, một loại nấm sản sinh ra độc tố Helmintosporoside gây hƣ hại lá. Những cây mía tái sinh chống chịu bệnh mắt én từ dòng tế bào bố mẹ CP-57-603 qua chọn dòng chống chịu độc tố Helmintosporoside, những cây mía này đƣợc trồng ra đồng và tiếp tục chọn lựa. Tƣơng tự, Krsishamarthi đã tạo ra dòng mía Pinda 70-31 chống chịu bệnh Fiji, một loại bệnh dự đoán là do virus gây ra. Do tính chống chịu bệnh Fiji tốt nên hiện nay Pinda 70-31 đã trở thành dòng thƣơng mại quan trọng ở Fiji. Ngƣời ta còn nhận thấy Pinda 70-31 còn chống chịu bệnh phấn trắng (Downy Wildew), loại bệnh này gây ra
bởi nấm Sclerospora sacchari. Tiếp theo là Gengenbach và Brettel thu đƣợc những dòng tế bào và cây ngô chống chịu độc tố.
Nhiều kết quả nghiên cứu chỉ cho thấy rằng ngay trên cây có khả năng kháng bệnh cũng cho thấy mô, tế bào hay protoplast cũng biểu hiện tính kháng khi nuôi cấy với độc tố. Cây phát sinh từ mô sẹo kháng độc tố đã đƣợc tái sinh thành công ở ngô, ở khoai tây ở lúa mì. Behnke (1980) ghi nhận rằng lá cây khoai tây tái sinh từ mô sẹo đƣợc chọn lọc tính kháng với dịch vô trùng (FP) Phytophthora infestans thể hiện tính kháng với FP này tốt hơn so với đối chứng. Tuy nhiên, không có sự liên hệ hoàn toàn về mặt tính kháng FP đƣợc quan sát ở cây tái sinh và cây đối chứng đƣợc xử lý bào tử nấm.
Cây kháng bệnh đầu tiên đƣợc thu nhận bởi Karlson (1973) khi xử lý mô nuôi cấy với độc tố. Kế đó tái sinh cây từ những dòng tế bào cho tính kháng ổn định. Cây kháng bệnh vàng lá đƣợc tái sinh sau khi xử lý tế bào đơn bội thuốc lá với các toxin của vi khuẩn.
Sau đó những kết quả tƣơng tự đƣợc ghi nhận khi sử dụng mô nhị bội nuôi cấy, với hệ thống nuôi cấy tế bào hay protoplast và mô sẹo, có hay không có chất xử lý đột biến, gần đây cây kháng bệnh đã đƣợc tái sinh ở ngô và mía qua chọn lọc in vitro.
Solodkaya và ctv (1983) tái sinh cây thập tự từ dịch huyền phù tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa dịch nấm vô trùng Sclerotinia trifolium Erikss.
Khromova và cộng tác viên (1983) tái sinh cây khoai tây từ mô sẹo đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có dịch khuẩn vô trùng gây bệnh thối rễ. Tính kháng của cây còn đƣợc theo dõi cho đến ngày nay.
Đã tạo ra những dòng tiêu có tính chống chịu với nấm Phytophthora ở Ấn Độ, Malaysia, Indonesia (Kasim, 1981; Kueh và Sim, 1992; Anandaraji 2000). Và dòng tiêu Natar 1 là một trong những dòng tiêu thƣơng mại có khả năng chống chịu với nấm
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian thực hiện từ tháng 2 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006.
- Địa điểm thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trƣờng 3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trƣờng
- Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ
- Nồi hấp autolave: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy - Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ
- Bể rửa chai, ống nghiệm
- Bếp điện: để nấu môi trƣờng và hấp cách thủy hóa chất - Cân phân tích: để cân đƣờng, Agar, các hóa chất
- Máy khuấy từ - Máy đo pH
- Chai nƣớc biển 250ml: để cấy cây và mô sẹo
3.2.2 Phòng cấy cây
- Tủ cấy vô trùng - Đèn cực tím
- Giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy
- Các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng
3.2.3 Phòng cấy nấm
- Tủ cấy nấm - Đèn cực tím
3.2.4 Phòng nuôi cây
- Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy (0,6x2m), trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2m
- Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20C - Nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây
- Ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây
3.2.5 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm