2.7.1 Auxin
Auxin đƣợc khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đƣờng cong của loài Coléoptiles họ Graminées. Do có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào nên có tên nhƣ vậy. Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique.
2.7.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hòa khác. Các tác động của Auxin đƣợc thể hiện nhƣ sau:
- Kéo dài tế bào: làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nƣớc vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra.
- Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+, ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+
.
- Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp ARN robosomique.
- Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium. Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”.
- Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất ethylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở.
- Hoạt động trong các phản ứng về tăng trƣởng và trong các sự hỗ tƣơng giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ƣu thế của chồi non.
- Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái. - Có tác dụng kích thích tạo rễ.
2.7.1.2 Auxin trong cây trồng
Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất auxin sinh ra đƣợc hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non.
Auxin lƣu thông từ đỉnh xuống phần dƣới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng đƣợc thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhƣng trong quá trình chuyển vận này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng. Nhƣ vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trƣởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào.
2.7.1.3 Các chất auxin tổng hợp
Ngay từ khi auxin đƣợc nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hóa học đã đƣợc thí nghiệm. Một vài chất trong số này đã thể hiện những đặc tính tƣơng tự nhƣ đặc tính của auxin, nhƣng thƣờng với các liều lƣợng thấp hơn, hơn nữa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme, chúng có thể có một hoạt động kéo dài.
Trong số những chất đƣợc sử dụng, chúng ta có thể kể ra các chất chính sau: Acid indolylbutyrique (AIB)
Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng nhƣ: Acid naphtyloxyacetique (ANOA)
Acid naphtylacétamide (NAD)
Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4-D)
Trong thực tế, auxin có thể đƣợc sử dụng, nó ít độc nhƣng cũng ít hiệu quả bởi vì nó bị kiểm soát rất nhanh, chính vì vậy mà các chất tổng hợp đã thay thế chất auxin mặc dù chúng có những nguy hại về độc tính cao hơn.
Trong những ứng dụng thực tiễn, các chất có cấu trúc giống auxin đƣợc sử dụng để giâm cành, chúng đƣợc tìm thấy trong các ứng dụng quan trọng nhƣ: trong nghành cây ăn quả dùng để làm trống, sáng các quả, sự đậu quả hoặc còn để làm chậm sự thu hoạch quả.
Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống đƣợc sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng đƣợc nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn đƣợc dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả.
2.7.2 Cytokinine
Cytokinine đƣợc khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Ngƣời ta đã biết sự thêm nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập đƣợc một chất rất hoạt động mà ngƣời ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất.
Cytokinine là các chất adenine đƣợc thay thế, chất này đƣợc ngƣời ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:
Zeatine.
loại đƣợc sử dụng nhiều nhất là:
Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine).
Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine).
2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine
- Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhƣng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin: Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và Cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome.
- Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ.
- Hoạt động kích thích sự chuyển hóa, làm thuận lợi việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme li giải.
- Hiệu quả đối kháng của tính ƣu thế chồi non: các chồi nách đƣợc xử lí Cytokinine sẽ tăng trƣởng và cạnh tranh với chồi tận cùng.
- Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hóa.
2.7.2.2 Cytokinine trong cây trồng
Đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn Corynebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây.
2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
Dựa trên kỹ thuật chọn dòng đột biến in vitro, Steiner, đã chọn đƣợc dòng mía chống chịu bệnh mắt én (eyes spot), bệnh này do Helmintosporium sacchari, một loại nấm sản sinh ra độc tố Helmintosporoside gây hƣ hại lá. Những cây mía tái sinh chống chịu bệnh mắt én từ dòng tế bào bố mẹ CP-57-603 qua chọn dòng chống chịu độc tố Helmintosporoside, những cây mía này đƣợc trồng ra đồng và tiếp tục chọn lựa. Tƣơng tự, Krsishamarthi đã tạo ra dòng mía Pinda 70-31 chống chịu bệnh Fiji, một loại bệnh dự đoán là do virus gây ra. Do tính chống chịu bệnh Fiji tốt nên hiện nay Pinda 70-31 đã trở thành dòng thƣơng mại quan trọng ở Fiji. Ngƣời ta còn nhận thấy Pinda 70-31 còn chống chịu bệnh phấn trắng (Downy Wildew), loại bệnh này gây ra
bởi nấm Sclerospora sacchari. Tiếp theo là Gengenbach và Brettel thu đƣợc những dòng tế bào và cây ngô chống chịu độc tố.
Nhiều kết quả nghiên cứu chỉ cho thấy rằng ngay trên cây có khả năng kháng bệnh cũng cho thấy mô, tế bào hay protoplast cũng biểu hiện tính kháng khi nuôi cấy với độc tố. Cây phát sinh từ mô sẹo kháng độc tố đã đƣợc tái sinh thành công ở ngô, ở khoai tây ở lúa mì. Behnke (1980) ghi nhận rằng lá cây khoai tây tái sinh từ mô sẹo đƣợc chọn lọc tính kháng với dịch vô trùng (FP) Phytophthora infestans thể hiện tính kháng với FP này tốt hơn so với đối chứng. Tuy nhiên, không có sự liên hệ hoàn toàn về mặt tính kháng FP đƣợc quan sát ở cây tái sinh và cây đối chứng đƣợc xử lý bào tử nấm.
Cây kháng bệnh đầu tiên đƣợc thu nhận bởi Karlson (1973) khi xử lý mô nuôi cấy với độc tố. Kế đó tái sinh cây từ những dòng tế bào cho tính kháng ổn định. Cây kháng bệnh vàng lá đƣợc tái sinh sau khi xử lý tế bào đơn bội thuốc lá với các toxin của vi khuẩn.
Sau đó những kết quả tƣơng tự đƣợc ghi nhận khi sử dụng mô nhị bội nuôi cấy, với hệ thống nuôi cấy tế bào hay protoplast và mô sẹo, có hay không có chất xử lý đột biến, gần đây cây kháng bệnh đã đƣợc tái sinh ở ngô và mía qua chọn lọc in vitro.
Solodkaya và ctv (1983) tái sinh cây thập tự từ dịch huyền phù tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa dịch nấm vô trùng Sclerotinia trifolium Erikss.
Khromova và cộng tác viên (1983) tái sinh cây khoai tây từ mô sẹo đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có dịch khuẩn vô trùng gây bệnh thối rễ. Tính kháng của cây còn đƣợc theo dõi cho đến ngày nay.
Đã tạo ra những dòng tiêu có tính chống chịu với nấm Phytophthora ở Ấn Độ, Malaysia, Indonesia (Kasim, 1981; Kueh và Sim, 1992; Anandaraji 2000). Và dòng tiêu Natar 1 là một trong những dòng tiêu thƣơng mại có khả năng chống chịu với nấm
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian thực hiện từ tháng 2 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006.
- Địa điểm thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trƣờng 3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trƣờng
- Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ
- Nồi hấp autolave: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy - Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ
- Bể rửa chai, ống nghiệm
- Bếp điện: để nấu môi trƣờng và hấp cách thủy hóa chất - Cân phân tích: để cân đƣờng, Agar, các hóa chất
- Máy khuấy từ - Máy đo pH
- Chai nƣớc biển 250ml: để cấy cây và mô sẹo
3.2.2 Phòng cấy cây
- Tủ cấy vô trùng - Đèn cực tím
- Giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy
- Các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng
3.2.3 Phòng cấy nấm
- Tủ cấy nấm - Đèn cực tím
3.2.4 Phòng nuôi cây
- Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy (0,6x2m), trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2m
- Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20C - Nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây
- Ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây
3.2.5 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm
Môi trƣờng dùng trong thí nghiệm là MS (Murashige & Skoog), gồm các thành phần sau:
Nguyên tố đa lượng
NH4NO3 1650 mg/L KNO3 1900 mg/L MgSO4.7H2O 370 mg/L KH2PO4 170 mg/L CaCl2.2H2O 440 mg/L Vitamins Inositol 100 mg/L Nicotinic 0,5 mg/L Pyridoxin HCl 0,5 mg/L Thiamin HCl 0,1 mg/L Glyxin 2 mg/L Nguyên tố vi lượng H3BO3 6,2 mg/L MnSO4.4H2O 22,5 mg/L ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L KI0,83 mg/L Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L CuSO4.5H2O 0,025 mg/L CoCl2.6H2O 0,025 mg/L Fe EDTA FeSO4.7H2O 27,8 mg/L Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/L
.3. Vật liệu nuôi cấy
Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu Vĩnh Linh in vitro có sẵn trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm
3.4.1 Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu
3.4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro
Tiến hành thí nghiệm
Sử dụng môi trƣờng nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá cây tiêu là môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA.
Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xày ra trong bóng tối, và mô sẹo sẽ hình thành từ những vết vết thƣơng trong quá trình cắt mẫu lá.
Sử dụng cây tiêu nuôi cấy in vitro, lấy mẫu lá cắt nhỏ thành những mẫu nhỏ (0.4 x 0.4cm). Đặt vào môi trƣờng, đặt mặt dƣới lá ở phía dƣới tiếp xúc với môi trƣờng. Mỗi chai cấy 6-7 mẫu lá nhỏ, thực hiện cấy 20 chai. Sau đó để vào trong bóng tối trong 2 tuần, khi từ những vết cắt bắt đầu xuất hiện sự hình thành mô sẹo. Sau đó lấy ra để ngoài ánh sáng nhẹ (50µmol/m2/s) 3 tuần để mô sẹo tiếp tục phát triển.
Lấy mô sẹo để tiến hành thí nghiệm. Điều kiện thí nghiệm
Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 30g/L Đƣờng saccharose + 1mg/L 2,4D + 3mg/L BA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút
pH môi trƣờng: 5,8
Thể tích môi trƣờng: 30ml
Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn trong 2 tuần đầu, 3 tuần sau đó cƣờng độ ánh sáng là 50µmol/m2/s
Nhiệt độ: 25 ± 20C Ẩm độ: 65 ± 5%
Thời gian theo dõi thí nghiệm: 5 tuần
3.4.1.2 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora
Tiến hành thí nghiệm
Giống nấmPhytophthora sử dụng trong thí nghiệm là giống nấm đã đƣợc phân lập tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Nấm Phytophthora đƣợc cấy và nuôi trong môi trƣờng PGA (môi trƣờng dinh dƣỡng cho nấm phát triển gồm: khoai tây, glucose và agar) 48 giờ. Sau đó đƣợc nuôi trong dung dịch nuôi cấy cà rốt 20%, để trong bóng tối từ 48-72 giờ. Rửa sạch và tiếp tục nuôi ngoài sáng trong nƣớc cất trong 3-4 ngày.
Lọc nấm bằng vải lọc lấy dịch nuôi cấy nấm để tiến hành thí nghiệm. Điều kiện thí nghiệm
Nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PGA: môi trƣờng gồm khoai tây, glucose và agar khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút
Thể tích môi trƣờng: 10ml Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Ẩm độ: 65 ± 5%
Thời gian theo dõi thí nghiệm: 10 ngày
3.4.2.3 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu cấy mô sẹo cây tiêu
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm thực hiện với môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA nồng độ dịch nấm.
Nồng độ dịch nấm với 4 mức độ:0%, 5%, 10%, 20% và vô trùng bằng hai cách là: hấp khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút bằng autoclave và lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thƣớc 0.45 m.
Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 15 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 1 chai, và mỗi chai gồm 2 mẫu mô sẹo.
Tổng số chai: 105
Tổng số mẫu của mỗi nghiệm thức: 30 Tổng số mẫu của thí nghiệm: 210 Tiến hành thí nghiệm
Ta sử dụng mô sẹo đã tạo ra ở thí nghiệm 1 để tiến hành thi nghiệm.
Lấy mô sẹo cấy vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu
Phƣơng pháp vô trùng Nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Số chai Số mẫu/chai Tổng số mẫu DC 0 15 2 30 Hấp khử trùng CC 5 15 2 30 CB 10 15 2 30 CA 20 15 2 30 Lọc vô trùng KC 5 15 2 30 KB 10 15 2 30 KA 20 15 2 30 Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%, CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng, CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng, CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng, KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng, KB: