thành chồi từ mô sẹo tiêu
4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro
Sau 2 tuần nuôi cấy trong bóng tối tại những vết cắt (ở mép lá) bắt đầu xuất hiện những vết sần, là dấu hiệu mô sẹo bắt đầu hình thành.
Sau 3 tuần tiếp tục phát triển ở điều kiện chiếu sáng (cƣờng độ ánh sáng 50µmol/m2/s), mô sẹo đã phát triển ở toàn bộ mẫu lá.
4.1.2 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu
Quá trình theo dõi thí nghiệm chúng tôi nhận thấy sự tái sinh chồi của các nghiệm thức khác so với nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo tiêu có một số đặc điểm sau:
- Khả năng bật chồi kém.
- Số chồi rất ít (chỉ 1 – 2 chồi trên mỗi cụm mô).
- Chồi có màu hơi tái, chồi hình thành đơn lẻ, chỉ có một đến hai chồi có khả năng phát triển. Điều này cho thấy sự khác biệt rất lớn nếu so sánh với số chồi hình thành trên nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo.
Bảng 4.1 Kết quả tái sinh chồi và hệ số tăng trƣởng mô sẹo sau 90 ngày cấy Phƣơng pháp vô trùng Nghiệm thức Nông độ dịch nấm (%) Số chồi HSTTMS (g/ngày) Hệ số nhân chồi (chồi/tháng) DC 0 2,10a 0,0173 0,68a Hấp khử trùng CC 5 0,87b 0,0151 0,28 b CB 10 0,33b 0,0153 0,11b CA 20 0,67b 0,0141 0,22b Lọc vô trùng KC 5 1,27ab 0,0152 0,42a KB 10 0,80b 0,0154 0,26b KA 20 0,93b 0,0155 0,31b Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%; CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng; CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng; CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng; KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng; KB: nồng độ dịch nấm 10% lọc vô trùng; KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng; HSTTMS: hệ số tăng trưởng của mô sẹo
Các ký tự giống nhau theo sau các chữ số trong cùng một cột thì không có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,01< P ≤ 0,05.
Kết quả của Bảng 4.1 cho thấy có một sự khác biệt có ý nghĩa về khả năng tái sinh chồi của nghiệm thức không chủng dịch nấm và nghiệm thức có chủng dịch nấm với nồng độ 10% vô trùng dịch nấm bằng màng có kích thƣớc 0,45μm so với các nghiệm thức còn lại. Trong đó, nghiệm thức không chủng dịch nấm cho kết quả tái sinh chồi cao nhất (2,1 chồi/chai). Kết quả này cho thấy rằng dịch nấm đã có những ảnh hƣởng nhất định đến khả năng bật chồi của mô sẹo, nó làm ức chế khả năng tái sinh chồi của mẫu mô.
Kết quả Bảng 4.1 cho thấy là không có sự khác biệt có ý nghĩa trong quá trình tăng trƣởng mô sẹo. Tuy nhiên hệ số tăng sinh mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm là cao nhất (0,0173g/ngày). Nó cho thấy rằng dịch nấm không có ảnh hƣởng rõ rệt tới khả năng tăng trƣởng của mô sẹo.
Sau 6 tuần nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy rằng những cụm mô sẹo của những nghiệm thức có chủng dịch nấm đã có sự biến đổi. phần mô sẹo tiếp xúc với môi trƣờng có dấu hiệu bị đen, và phần môi trƣờng nuôi cấy xung quanh cũng chuyển
thành màu đen hơn. Thông thƣờng hiện tƣợng đen của mô sẹo và sự thay đổi màu (bị đen) của môi trƣờng có thể là do hết chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy hay là do nuôi cấy mô sẹo dƣới cƣờng độ ánh sáng cao. Ở đây cả hai nguyên nhân trên đều không phải vì thời gian nuôi cấy chỉ mới 6 tuần (sau khi nuôi cấy khoảng 10 tuần thì dinh dƣỡng trong môi trƣờng mới bắt đầu hết) và điều kiện chiếu sáng vào khoảng 50µmol/m2.s (cƣờng độ ánh sáng khá yếu). Mặt khác, ở cùng điều kiện thì ở nghiệm thức không có bổ sung dịch nấm thì hiện tƣợng mô sẹo bị đen và môi trƣờng chuyển màu không xảy ra. Có thể kết luận hiện tƣợng trên là do dịch nấm bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đã ảnh hƣởng đến quá trình phát triển của mô sẹo.
Dịch nuôi cấy nấm Phytophthora chứa các trao đổi chất của nấm Phytophthora, các hợp chất đó bao gồm các độc tố của loại nấm này đối với ký chủ của loại nấm này. Nhƣ ta biết mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, các tế bào mô sẹo phân chia liên tục, đặc biệt ở các tế bào còn non hiện tƣợng phân chia tế bào rất mạnh mẽ. Trong quá trình phân chia tế bào sẽ làm cho cấu trúc tế bào kém ổn định. Rất có thể độc tố nấm có trong dịch nấm đã tác động và làm ảnh hƣởng tới quá trình phân bào của mô sẹo. Có thể các tế bào tiếp xúc với môi trƣờng bị đen (các tế bào chết) là do các tế bào này đã tiếp xúc và chịu ảnh hƣởng trực tiếp từ dịch nấm.
Vậy thì có hay không có các phản ứng của tế bào mô sẹo đối với độc tố của nấm? Các tế bào mô sẹo sẽ có các phản ứng để chống lại với sự ảnh hƣởng của độc tố nấm. Tế bào sẽ sản sinh ra những chất để chống lại độc tố của nấm. Cơ chế phòng vệ của tế bào mô sẹo có thể là do 2 cơ chế: (1) các chất chống lại tác động của độc tố nấm là do các phản ứng sinh hóa phòng vệ của tế bào để chống chịu lại với các điều kiện bất lợi; (2) các chất chống lại tác động của độc tố nấm đƣợc sinh ra là do sự điều khiển của một gene nào đó. Sự tác động của độc tố nấm lên quá trình phân chia tế bào có thể
tạo ra một đột biến giúp tế bào có khả năng chống chịu với độc tố nấm. Kết quả thu đƣợc qua thí nghiệm cho thấy rằng với phƣơng pháp vô trùng bằng
cách sử dụng đầu lọc kích thƣớc 0,45µm cho kết quả tái sinh chồi cao hơn so với phƣơng pháp hấp khử trùng ở 121oC trong 25 phút. Có thể ở nhiệt độ cao dịch nấm có thể bị phân hủy tạo thành những chất ức chế sự tái sinh chồi từ mô sẹo, hay nhiệt độ đã làm giảm tính độc của độc tố nấm.
Hình 4.2: Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.3 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.5 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 4.4 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.6 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.7 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy.