Tài liệu KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ pptx

HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG T

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*****000*****

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora

capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH

TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA

CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*****000*****

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora

capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH

TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA

CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ

TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

*****000*****

EFFECTS OF Phytophthora capsici EXTRACT,

CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS

ON THE GROWTH AND MUTATION

OF IN VITRO BLACK PEPPER

(Piper nigrum L.)

GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

MSc NGUYEN THI KIM LINH TO THI NHA TRAM

Dr LE DINH DON TERM: 2003 - 2007

iii

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

- Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua

- TS Lê Đình Đôn và ThS Nguyễn Thị Kim Linh đã tận tình hướng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Các anh chị phụ trách phòng 118 và 105 Khu Phượng Vỹ thuộc Bộ Môn Bảo

Vệ Thực Vật - Đại học Nông Lâm TP HCM

- Cám ơn Thầy và các chị thuộc Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt đã hướng dẫn và giúp đỡ em tận tình

- Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP HCM

- Các bạn Nguyễn Thị Ngọc Tú, Lê Thị Bích Uyển, Nguyễn Hoàng Quân, Trần Nguyễn Mỹ Châu khoa Nông Học thực hiên đề tài ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, bạn Văn Đào, Quốc Dũng CNSH30 và Anh Khoa, Tuyết Nhung, Ngọc Lợi CNSH31 cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Sinh viên thực hiện

TÔ THỊ NHÃ TRẦM

iv

TÔ THỊ NHÃ TRẦM, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007

“KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora sp VÀ CÁC TÁC

NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN

CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ”

Giáo viên hướng dẫn:

ThS NGUYỄN THỊ KIM LINH

TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học Đại Học Nông Lâm

Tp HCM trên đối tượng hồ tiêu (Piper nigrum L.) in vitro

Những kết quả đạt được:

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến sinh

trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo

Ở nồng độ dịch nấm 30 và 40 % thì mô sẹo bị chết hoàn toàn Nồng độ 20 % tạo nhiều tế bào bất thường, mô vẫn còn khả năng sống sót và ở nồng độ này cho kết quả đột biến tế bào mô nhiều hơn

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sinh trưởng

phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo

Nồng độ 10 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l IBA và 20 mg/l BA với 1 mg/l IBA cho kết quả tạo chồi cao trong đó tối ưu nhất vẫn là BA sử dụng ở nồng độ 10 mg/l kết hợp với 1 mg/l IBA Mặt khác, nồng độ 20 mg/l IBA kết hợp với 1 mg/l BA và 1mg/l IBA kết hợp với 2 mg/l TDZ lại cho kết quả đột biến cao

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trưởng phát triển

và khả năng tạo đột biến của mô tiêu

Ở liều xạ 20 Gy thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo hơn nhưng để tạo đột biến thì ở liều xạ 40 Gy cho tỉ lệ biến dị cao hơn Trên chồi thì liều xạ 20 Gy kích thích tạo sẹo nhiều và cả mô xốp nhưng ở liều xạ 40

và 60 Gy cho nhiều thể đột biến hơn vì tạo được nhiều mô bất thường và cấu trúc tế bào thay đổi nhiều

v

The thesis titled “EFFECTS OF Phytophthora capsici EXTRACT,

CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS ON THE GROWTH AND

MUTATION OF IN VITRO BLACK PEPPER (Piper nigrum L.)” was carried out

at Biotechnology Department and Plant Protection Department – Nong Lam University, HCMC from March 2007 to August 2007 under the supervision of MSc Nguyen Thi Kim Linh and Dr Le Dinh Don

The thesis contents three experiments

The first experiment was “effects of Phytophthora capsici on the growth and mutation of in vitro black pepper” In vitro black pepper callus were cultured on MS medium with Phytophthora capsici extract at 20%, 30% and 40% for 21 days The results showed that: On the medium having Phytophthora capsici extract at 30%

and 40%, the mutation ratio were highter than that on the third medium on the day

14t after culture However, on these two mediums all black pepper callus were died

on the day 21st after culture

The second experiment was “effects of growth regulator on the growth and

mutation of in vitro black pepper” In vitro black pepper callus were cultured on MS

medium with BA (10 mg/l, 20 mg/l) combined with IBA (1 mg/l); IBA (10 mg/l, 20 mg/l) combined with BA (1 mg/l); and TDZ (1 mg/l, 2 mg/l) combined with IBA (1 mg/l) The results showed that: The medium supplemented with BA (10 mg/l) combined with IBA (1 mg/l) had highest shoot ratio The medium supplemented with IBA (1 mg/l) combined with TDZ (1 mg/l) gave highest mutation ratio

The last experiment was “effects of Gamma ray on the growth and mutation

of in vitro black pepper” In vitro black pepper callus and shoot were treated by

gamma ray at 20, 40 and 60 Gy The results showed that: Callus formation in 20

Gy treatment was higher than that the treatments of 40 and 60 Gy However, the mutation ratio in gamma ray at 40 and 60 Gy treatments were higher than that the treatments of 20 Gy

vi

Trang tựa i

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục vi

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Danh sách các chữ viết tắt xii

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 3

1.3 Giới hạn của đề tài 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu khái quát về cây tiêu 4

2.1.1 Đặc điểm của cây tiêu 4

2.1.2 Tình hình phân bố 5

2.1.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ trên thế giới và trong nước 5

2.1.3.1 Tình hình sản xuất 5

2.1.3.2 Tình hình tiêu thụ 6

2.1.4 Tình hình bệnh trên cây tiêu 9

2.1.4.1 Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophthora capsici gây ra 9

2.1.4.2 Bệnh tuyến trùng 10

2.1.4.3 Bệnh khô đầu ngọn thối trái 10

2.1.4.4 Bệnh vằn lá do virus 10

2.1.4.5 Các bệnh do dinh dưỡng bất thường 11

2.1.5 Nhu cầu về cây tiêu giống trong thực tế 11

2.2 Giới thiệu về nấm Phytophthora capsici 12

2.3 Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật 13

vii

2.3.3 Chất phóng xạ Coban (cobalt) 14

2.3.4 Cơ chế tác động của bức xạ ion trên cơ thể sống 14

2.3.5 Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa 15

2.3.6 Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ 16

2.3.6.1 Ngoài nước 16

2.3.6.2 Trong nước 17

2.4 Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào tực vật 18

2.4.1 Khái niệm 18

2.4.2 Ứng dụng 18

2.4.3 Phương pháp nhân phôi vô tính 19

2.4.3.1 Khái niệm 19

2.4.3.2 Ý nghĩa nuôi cấy mô phôi vô tính 19

2.4.3.3 Sự hình thành phôi vô tính 19

2.4.3.4 Các kiểu phát sinh phôi soma 20

2.5 Vai trò của chất điều hòa sinh truonwgr trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 21

2.5.1 Chất điều hòa sinh trưởng 21

2.5.2 Một số chất điều hòa sinh tưởng thường dùng trong nuôi cấy mô 21

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

3.1 Đối tượng nghiên cứu 24

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.3 Vật liệu nghiên cứu 24

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy 24

3.3.1.1 Phòng chuẩn bị môi trường 24

3.3.1.2 Phòng cấy 24

3.3.1.3 Phòng cấy nấm 24

3.3.1.4 Phòng tăng trưởng 24

3.3.2 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy 25

viii

3.4 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 28

3.4.2 Nội dung nghiên cứu 28

3.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nấn Phytophthora capsici đến sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu 28

3.4.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu 31

3.4.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu 32

3.5 Phân tích thống kê 33

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsicci đến sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu 34

4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro 34

4.1.2 Nuôi cấy mô sẹo tiêu trong môi trường có bổ sung dịch chiết nấm Phytophthora capsici 34

4.2 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu 42

4.3 Ảnh hưởng của tia phóng xạ gamma đến sự sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo, chồi tiêu 51

4.3.1 Ảnh hưởng của tia gamma đến sự sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu 51

4.3.2 Ảnh hưởng của tia gamma đến sự sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của chồi tiêu 58

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

5.1 Kết luận 64

5.2 Đề nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 69

ix

Bảng 21: Thị trường và số lượng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 đến 6 tháng đầu năm

2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) 6

Bảng 2.2: Sản lượng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 7

Bảng 2.3: Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 – 1999) 8

Bảng 2.4: Năng suất và sản lượng tiêu từ năm 1995 đến năm 1999 11

Bảng 3.1: Mô tả thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora capsici trong môi trường nuôi cấy mô sẹo cây tiêu 30

Bảng 3.2: Mô tả thí nghiệm của các môi trường có chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô sẹo tiêu 31

Bảng 3.3: Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến mô sẹo tiêu 32

Bảng 3.4: Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến chồi tiêu 33

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến tỉ lệ sống của mô sẹo 37

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của dịch nấm Phytophthora capsici lên mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy 38

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến tỉ lệ sống của mô sẹo 42

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạ o phôi của mô sẹo tiêu 43

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo chồi của mô sẹo tiêu 44

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia γ đến khả năng sống sót của mô sẹo tiêu 51

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của liều xạ gamma đến khả năng tạo phôi của mô sẹo 52

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của liều xạ gamma đến tỉ lệ sống của chồi tiêu 58

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của liều xạ gamma đến tỉ lệ tạo chồi của chồi tiêu 59

x

Hình 4.1: Mô sẹo hình thành từ lá cây tiêu in vitro trên môi trường MS bổ sung 3 mg/l

BA và 1 mg/l 2,4-D 34 Hình 4.2: Mô sẹo trên môi trường có bổ sung dịch nấm sau 1 tuần nuôi cấy 35 Hình 4.3: Mô sẹo trên môi trường có bổ sung dịch nấm sau 2 tuần nuôi cấy 36 Hình 4.4: Mô sẹo trên môi trường có bổ sung dịch nấm sau 3 tuần nuôi cấy 37 Hình 4.5: Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) 39 Hình 4.6: Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) 41 Hình 4.7: Mặt cắt mô sẹo trên môi trường đối chứng (P0) và môi trường P1 sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) 41 Hình 4.8: Mô sẹo trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng sau

2 tuần nuôi cấy 45 Hình 4.9: Mô sẹo trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng sau 3 tuần nuôi cấy 46 Hình 4.10: Mô sẹo trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng sau 4 tuần nuôi cấy 47 Hình 4.11: Mô xốp trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng sau

4 tuần nuôi cấy 48 Hình 4.12: Mặt cắt mô sẹo trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (độ phóng đại 40  10) 48 Hình 4.13: Mặt cắt mô sẹo tiêu trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) 49 Hình 4.14: Mặt cắt mô sẹo tiêu trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng sau 4 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) 50

xi

Hình 4.16: Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D

sau 3 tuần chiếu xạ gamma 54

Hình 4.17: Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D sau 4 tuần chiếu xạ gamma 55

Hình 4.18: Mặt cắt mô sẹo sau 2 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) 56

Hình 4.19: Mặt cắt mô sẹo sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) 57

Hình 4.20: Mặt cắt mô sẹo sau 4 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) 57

Hình 4.21: Chồi tiêu trên môi trường có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma 60

Hình 4.22: Chồi tiêu trên môi trường có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma 60

Hình 4.23: Chồi tiêu trên môi trường có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma 61

Hình 4.24: Mặt cắt chồi tiêu sau 2 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) 62

Hình 4.25: Mặt cắt chồi tiêu sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) 63

Hình 4.26: Mặt cắt chồi tiêu sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) 63

xii

BA: N6 – benzyladenine

2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid

Gy: đơn vị đo năng lƣợng hấp thụ

IBA: Indole – 3 – butyric Acid

MS: Murashige & Skoog, 1962

TDZ: Thidiazuron

Ctv: cộng tác viên

GA: Gibberellin A

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ, nhất là công nghệ gen và công nghệ tế bào đã đóng góp to lớn vào lĩnh vực cải tiến giống cây trồng nông nghiệp phục vụ cho nhu cầu của con người

Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) là một mặt hàng xuất khẩu trọng yếu, mang lại

nhiều lợi nhuận cho người nông dân Việt Nam Sau những năm 1998, 1999, khi giá hồ tiêu tăng cao (60.000 đồng/kg), nhiều địa phương đã tăng rất nhanh diện tích trồng hồ tiêu Đến năm 2003, Việt Nam có tổng diện tích cây tiêu cả nước tăng gần 5.000 ha so với năm 2002, dẫn đầu về sản lượng xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới với 85.000 tấn (IPC) Việt Nam chiếm tỷ trọng xuất khẩu cao nhưng chủ yếu là mặt hàng tiêu đen cấp thấp, bình quân năm 2003 xuất với giá 1.419 USD/tấn Tháng 4 đầu năm 2004, lượng tiêu xuất khẩu của Việt Nam giảm 28%

so với cùng kỳ năm 2003, đồng thời giá xuất khẩu cũng giảm mạnh (Phạm Thị Chín và Nguyễn Xuân Vinh, 2005)

Nguyên nhân là do những năm gần đây, năng suất hạt giảm đáng kể so với những năm trước, có khi mất trắng Mặt khác, giá tiêu khô cân tại vườn lại bấp bênh (khoảng từ 16.000 – 20.000 ngàn đồng/kg) làm người dân không tự tin để tiếp tục canh tác Do đó, nếu không có những giải pháp đúng đắn, kịp thời, mặt hàng tiêu xuất khẩu của Việt Nam sẽ ngày càng giảm sút về số lượng lẫn chất lượng

Nhìn chung, hiện trạng trồng tiêu của Việt Nam đang gặp phải một số hạn chế cần được khắc phục Trong số đó, quan trọng nhất là khâu giống, vì hiện nay phần lớn các giống tiêu đang được trồng ở nước ta đã lâu đời, chưa được phục tráng tuyển chọn nên không ổn định về năng suất và khả năng kháng bệnh kém Bên cạnh

đó, kỹ thuật chọn và nhân giống còn tự phát, đơn điệu, trồng dựa vào truyền thống

là chủ yếu, chưa áp dụng được tiến bộ khoa học kỹ thuật (Trần Văn Hòa, 2001) Tuy vậy đối với cây tiêu, tạo giống theo cách cổ điển là phương pháp chủ đạo ở nước ta và nhiều nước trên thế giới

Biện pháp tạo giống cổ điển dựa trên các biến dị di truyền do tổ hợp hoặc do đột biến Các biến dị có lợi cho sản xuất được chọn lọc, duy trì và củng cố qua hàng loạt thế hệ để phát triển thành giống mới Đặc điểm nổi bậc về hình thái, sinh trưởng, năng suất, chất lượng, tính chống chịu, đặc tính thích nghi, tính kháng bệnh,

ổn định là những tiêu chuẩn quan trọng được định tính hay định lượng bằng phương pháp chuẩn để đưa một giống tiêu mới ra sản xuất hoặc xác nhận bản chất di truyền làm nguồn vật liệu cho công tác cải tiến giống

Ứng dụng những phương pháp trong nuôi cấy mô bằng cách sử dụng dịch

nấm (Phytopthora capsici), sử dụng chất kích thích sinh trưởng và chiếu xạ gamma

tạo đột biến để khai thác biến dị có lợi từ nguồn tài nguyên di truyền thực vật bản địa nhằm mong muốn tạo ra giống tiêu có kiểu di truyền mới chứa những đặc tính tốt về sinh trưởng và phát triển cũng như khả năng thích nghi, tính chống chịu bệnh và cho năng suất cao

Để tiến xa hơn trong công tác giống, cung cấp số lượng lớn cây giống tiêu có những đặc điểm tốt và nhu cầu sản xuất – xuất khẩu giống tiêu này bằng cách áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật đồng thời cùng với sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hướng dẫn tận

tình TS Lê Đình Đôn và ThS Nguyễn Thị Kim Linh, chúng tôi tiến hành đề tài:

“KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC

TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT

BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

Mục đích

Tìm ra những cá thể lạ trong điều kiện nuôi cấy bất thường

Yêu cầu

Theo dõi sự sinh trưởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo được nuôi

cấy trong dịch nấm Phytophthora capsici

Theo dõi sự sinh trưởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo đựơc nuôi cấy trong môi trường có chất kích thích sinh trưởng ở nồng độ cao Theo dõi sự sinh trưởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo và chồi tiêu được chiếu xạ tia gamma

1.3 Giới hạn của đề tài

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chỉ chiếu xạ chưa kết hợp với các hóa chất khác để tăng hiệu quả gây đột biến

Chưa thực hiện kiểm tra sinh học phân tử để xác định loại biến dị

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu khái quát về cây tiêu

2.1.1 Đặc điểm của cây tiêu

Cây tiêu (Piper nigrum) thuộc họ Piperaceae, có nguồn gốc ở vùng Ghats miền

Tây Ấn Độ, ở đây có nhiều giống tiêu hoang dại, mọc rất lâu đời Sau đó, tiêu được người Hindu mang tới Java (Indonesia) vào khoảng 600 năm sau công nguyên Cuối thế kỷ 12, tiêu được trồng ở Mã Lai Đến thế kỷ 18, tiêu được trồng ở Srilanka và Campuchia Vào đầu thế kỷ 20 thì tiêu được trồng nhiều ở các nước nhiệt đới như Châu Phi với Mandagasca, Nigieria, Congo và Châu Mỹ với Brazil, Mexico Tiêu

du nhập vào Đông Dương từ thế kỷ 17 nhưng mãi đến thế kỷ 18 mới bắt đầu phát triển mạnh (Trần Văn Hòa, 2001)

Tiêu thuộc loại thân thảo mềm dẻo được phân thành nhiều đốt, tại mỗi đốt có một lá đơn, hình trái tim, mọc cách Ở nách lá có các mầm ngủ có thể phát sinh thành các cành tược, cành lươn, cành ác (cành cho trái) tùy theo từng giai đoạn phát triển của cây tiêu Hệ thống rễ thường gồm từ 3 – 6 rễ cái và một chùm rễ phụ ở dưới mặt đất, trên đốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn)

Tiêu là loại cây trồng có thể sống lâu năm và có giá trị kinh tế cao Tiêu được sử dụng làm gia vị, trong y dược, trong công nghiệp hương liệu và làm chất trừ côn trùng Chất gia vị: Hạt tiêu có vị nóng, cay, có mùi thơm hấp dẫn nên rất thích hợp cho việc chế biến các món ăn Vì vậy mà tiêu đã trở thành gia vị được dùng rất phổ biến trên thế giới

Trong y dược: Do có sự hiện diện của chất piperin, tinh dầu và nhựa có mùi thơm, cay, nóng đặc biệt, tiêu có tác dụng kích thích tiêu hóa, làm cho ăn ngon miệng

2.1.2 Tình hình phân bố

Tiêu là một loại cây đặc trưng của miền nhiệt đới Nhiệt độ thích hợp cho cây tiêu là từ 10 – 35 0C Ánh sáng tán xạ nhẹ phù hợp với yêu cầu sinh lý về sinh trưởng và phát dục, ra hoa đậu quả của cây tiêu và kéo dài tuổi thọ của vườn Tiêu

ưa thích điều kiện khí hậu nóng ẩm, lượng mưa trong năm cần từ 1500 – 2500 mm Tiêu cũng cần một giai đoạn hạn tương đối ngắn sau vụ thu hoạch để phân hóa mầm hoa tốt và ra hoa đồng loạt vào mùa mưa năm sau

Do đó, ở Việt Nam tiêu được trồng chủ yếu ở Nghệ An, Quảng Bình, Kiên Giang (Phú Quốc), Đồng Nai (Long Khánh), Bình Phước (Lộc Ninh)

2.1.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ tiêu trên thế giới và trong nước

2.1.3.1 Tình hình sản xuất

Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng 70 nước trồng tiêu Tổng sản lượng tiêu hột tăng dần theo thời gian: năm 1954 toàn thế giới có khoảng 64.000 tấn tiêu hột, năm 1978 là 160.000 tấn tiêu hột và 1983 là 180.000 tấn tiêu hột Sau 1982 sản lượng tiêu trên thế giới giảm dần do sâu bệnh và thời tiết Đồng thời một phần cũng do sự ô nhiễm môi trường gây ảnh hưởng tới sự thụ phấn của hoa tiêu

Trước những năm 90, các nước có sản lượng tiêu lớn là Brazil, Indonesia và Malaysia Đến năm 2000, Ấn Độ đã vươn lên đứng vị trí thứ nhất, kế đến là Việt Nam (FAO, 2000) Đến năm 2001, Việt Nam đã vượt lên Ấn Độ để trở thành nước

có sản lượng tiêu lớn nhất thế giới Với tốc độ sản xuất tiêu nhanh chóng ở Việt Nam và Ấn Độ, lượng cung trên thế giới đã vượt quá lượng cầu khiến giá tiêu trên thị trường thế giới giảm mạnh hơn 50% từ 3.000 – 4.000 USD/tấn còn 1.500 – 1.800 USD/tấn (Bảng 2.2) Theo thống kê của Cộng đồng hạt tiêu thế giới IPC, lượng cung năm 2003 giảm 4% trong bối cảnh giá thấp và điều kiện canh tác không thuận lợi Ngoài Việt Nam, nước sản xuất hàng đầu, tăng 13% đạt mức 85.000 tấn, sản lượng lại giảm mạnh tại các nước như Ấn Độ, Brazil và Malaysia do sâu bệnh và thời tiết So với năm 2002 sản lượng và xuất khẩu của 6 nước sản xuất

hạt tiêu chính trên thế giới Trong những năm gần đây Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam là những nước có diện tích trồng tiêu lớn nhất thế giới

Ở Việt Nam, năm 1997 - 1999 diện tích tiêu tăng từ 9.777 lên 15.461 ha Diện tích tiêu tăng nhanh nhất ở vùng Đông Nam Bộ từ 5.893 ha tăng lên 9.115 ha (chiếm 60,27% diện tích tiêu của cả nước) Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam chủ trương tập trung thâm canh, cải tạo các vườn cây già cỗi, loại bỏ những giống tiêu kém hiệu quả và thay vào đó là các giống tiêu năng suất cao, chất lượng tốt (trồng giống tiêu Ấn Độ tại Vĩnh Linh, Quảng Trị, đẩy mạnh thâm canh tiêu tại các vùng Đông Nam Bộ), giữ ổn định diện tích từ 45.000 ha đến 50.000 ha và chỉ phát triển trên các vùng đất được xác định thích hợp cũng như khuyến khích nhân rộng

mô hình sản xuất tiêu sạch (Bảng 2.3)

2.1.3.2 Tình hình tiêu thụ

Nước ta chủ yếu sản xuất mặt hàng tiêu đen, thị trường tiêu thụ trong nước hàng năm chỉ đạt khoảng 3.500 - 4.000 tấn/năm, còn phần lớn sản lượng tiêu dành cho xuất khẩu Thị trường tiêu xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam (1996 - 6/2000) là các nước:

Mỹ, các nước EU, Singapore

Bảng 2.1 Thị trường và số lượng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 đến 6 tháng đầu năm 2000

(Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh)

Mỹ, Ấn Độ, Singapore, EU, Hà Lan, Pháp,

Ai Cập, Hồng Kông, Malaysia, Sudan, UAE, Bulgaria, Pakistan, Kuwait, Israel,

Hy lạp, Đức, Hungari, Nga, Tây Ban Nha

Nguồn: Kiểm dịch - Cục BVTV, năm 2000

Bảng 2.2 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn)

Quốc gia 1991 1992 1993 1994 1995 1996 Trung

bình Asia & Pacific 182,016 183,721 144,976 158,028 169,189 153,988 165,320 India 55,000 60,000 55,000 50,000 55,000 60,000 55,833 Indonesia 61,000 62,000 23,500 42,500 59,000 39,200 47,867 Malaysia 29,000 26,000 17,600 16,000 13,000 12,000 18,933 Vietnam 8,900 7,830 18,500 20,000 20,000 20,000 15,872 China P.R 13,108 12,321 10,461 12,409 5,000 8,000 10,217 Thailand 10,443 10,500 9,000 10,104 10,949 9,773 10,128 Sri Lanka 2,850 3,255 9,000 5,000 3,725 3,000 4,472 Cambodia 1,700 1,800 1,900 2,000 2,500 2,000 1,983 Brunei Darus 15 15 15 15 15 15 15 South Pacific 158 159 164 168 168 168 197 Fiji 140 145 145 150 150 150 176 Samoa 5 5 6 6 6 6 7 Micronisea 13 9 13 12 12 12 14 Latin America 51,774 30,615 26,427 25,303 21,940 21,690 29,625 Brazil 50,000 27,500 25,000 23,000 20,000 19,500 27,500 Mexico 894 2,395 734 1,363 1,000 1,250 1,273 Guatemala 360 370 380 380 380 380 375 Honduras 420 160 213 400 400 400 332 Saint Lucia 100 190 100 160 160 160 145 Africa 5,427 4,543 4,665 4,565 4,565 4,565 5,833 Madagasca 2,160 2,000 2,300 2,300 2,500 2,500 2,327 Malawi 1,000 900 700 700 700 700 900 Zimbabue 700 800 900 700 700 700 750 Benin 894 150 150 150 150 150 299 Kenya 200 300 400 300 300 300 300 Cote di Voire 100 100 100 100 100 100 100 Cameroon 63 63 65 65 65 65 64 Ethiopia 100 200 50 Zambia 30 30 50 50 50 50 43 Tổng 239,038 219,038 176,232 188,064 195,862 180,411 199,975

Nguồn: Proc Peper Tech Meet, 1997

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) Đơn vị tính: DT (ha); NS (tấn/ha); SL (tấn)

Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, năm 2000

DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng

DT tổng

số

DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng DT tổng số

DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng

2.1.4 Tình hình bệnh trên cây tiêu

Tiêu là một loại cây rất dễ bị bệnh, nhất là tại những vùng đã trồng tiêu lâu năm Các bệnh chủ yếu thường gặp trên cây tiêu gồm (Mai Văn Quyền và ctv, 1996)

2.1.4.1 Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophothra gây ra

Thành phần bệnh hại trên tiêu rất đa dạng và phong phú như: thán thư

(Colletotrichum gloeosprioides), đen lá (Lansiondiplodia theobromce), đốm lá (Rosellina sp.), khô vằn (Rhizoctonia solani), bệnh chết nhanh dây tiêu (Phytophthora parasitica), bệnh chậm lớn cây lùn, bệnh tiêu điên và bệnh do

tuyến trùng gây ra, chúng làm cho cây suy yếu, héo vàng rồi làm chết cây hay làm cho cây không phát triển Trong đó bệnh chết nhanh dây tiêu thật sự là một tai họa cho nhà vườn, bệnh xuất hiện và lây lan rất nhanh, thường làm tiêu chết hàng loạt

gây mất trắng hay làm giảm năng suất trầm trọng Bệnh thường do nấm Phytophthora

capsici sống trong đất gây ra, đôi khi còn kết hợp với các nấm khác như Fusarium

sp., Pythium sp., Rhizoctonia solami cùng tấn công làm cây tiêu chết nhanh chóng

Bệnh thường xảy ra trong mùa mưa khi thời tiết ẩm (Trần Văn Hòa, 2001)

Theo kết quả nghiên cứu của bộ môn Bảo Vệ Thức vật, Viện Kỹ Thuật Khoa Học Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên năm 1999 thì bệnh này xuất hiện với tỷ lệ thấp (0,11% ở Gia Lai), chưa được coi là bệnh nguy hiểm cho cây tiêu ở vùng Tây Nguyên nhưng đến năm 2000 - 2001 bệnh đã gây thành dịch ở một số vùng EaHLeo, Easup, CưM’gar thuộc tỉnh Đắc Lắc Ở tỉnh Gia Lai, vùng bị thiệt hại nặng là Mang Yang (Tạp chí thông tin khoa học kỹ thuật Nông Lâm Nghiệp, số 1/2001)

Từ khi cây tiêu rũ lá vàng và rụng hàng loạt chỉ trong 5 - 7 ngày Bệnh lây lan rất nhanh, qua đất, qua nước tưới, cả vườn tiêu bị hại chỉ trong vòng vài tuần hay vài tháng Khi thấy triệu chứng héo dây thì bộ rễ đã bị nấm tấn công trước 1,5 - 2 tháng, do

đó bệnh rất khó phòng trị (Trần Văn Hòa, 2001) Bệnh này hại hầu hết các bộ phận của cây tiêu: thân, rễ, lá, cổ rễ, trái Bộ phận rễ và phần thân ngầm bị nấm tấn công thối đen, vỏ bong ra khỏi rễ, phần dây trên mặt đất bị héo, lá chuyển sang màu vàng và rụng hàng loạt trong 7 - 14 ngày, để lại cành trơ trụi và khô đi, sau đó toàn cây bị

héo đen và chết Vào mùa mưa bệnh xuất hiện ở lá dưới những vòng nâu đen, tập trung ở đầu lá, các đốm lớn dần, có màu nâu sậm và rất dễ rụng

Đến nay chưa có biện pháp hữu hiệu để trị nấm Phytophthora capsici khi

đã bị xâm nhập vào cây tiêu Khi bệnh đã biểu hiện thì không còn chữa trị được nữa, cho nên hiện nay phòng bệnh là biện pháp chủ yếu để làm giảm tối thiểu

thiệt hại do nấm Phytophthora capsici gây ra

Tác nhân gây bệnh gồm có: nhóm tuyến trùng nội ký sinh gây bệnh bướu rễ,

phổ biến là hai giống tuyến trùng có tên là Meloidogyne arenaria và Meloidogyne

incognita Hai loại này đục lỗ chui vào trong rễ để sống, chích hút dịch cây làm cho

cây không hút được thức ăn, cây khô héo tạo thành bướu rễ Nhóm tuyến trùng

ngoại ký sinh chích hút rễ cây thường gặp nhất là Pratylenchus, sống trong đất,

chích rễ non hút chất dinh dưỡnglàm cây suy yếu, mở đường cho các loại vi sinh vật khác xâm nhập vào (Mai Văn Quyền và ctv, 1996)

Cách phòng trị tuyến trùng: có thể dùng Furadan để giới hạn bệnh

2.1.4.3 Bệnh khô đầu ngọn thối trái

Bệnh này do Collextotrichum sp gây ra làm cây ngưng phát triển, các lá trên

cùng úa vàng, trên lá và trái tiêu non xuất hiện những chấm và đốm đen làm lá, trái rụng sớm Cây bị mất sức suy yếu (Plakidas A.G, 1954)

2.1.4.4 Bệnh vằn lá do virus

Bệnh này do virus gây ra, trên lá nổi những vết xanh đậm xen kẽ với những đường gân xanh nhạt bản lá bị cong, vẹo lại, rõ nhất là ở các lá non Bệnh này thường do rầy truyền từ cây bị bệnh sang Khi cây bị bệnh này, tốt nhất là nhổ bỏ để

khỏi lây lan sang cây khác đồng thời phun thuốc diệt rầy để cắt môi giới truyền bệnh cho các cây còn lại (Mai Văn Quyền và ctv, 1996)

2.1.4.5 Các bệnh do dinh dưỡng bất thường

Phần lớn các triệu chứng thiếu dinh dưỡng ở cây tiêu đều bắt đầu bằng sự đổi thành màu vàng nhiều hoặc ít ở các lá non, khoảng giữa các gân lá (Phan Hữu Thịnh và ctv, 1987)

2.1.5 Nhu cầu về cây tiêu giống trong thực tế

Tiêu là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị cao, do đó mà diện tích trồng tiêu của nước ta trong các năm qua đã không ngừng gia tăng, nhất là trên các vùng đất ở miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Sự gia tăng qua các năm từ 1995 đến năm

1999 theo niên giám thống kê 1999 được ghi nhận ở bảng 2.4

Bảng 2.4 Năng suất và sản lượng tiêu từ năm 1995 đến năm 1999

Năm Diện tích (*1.000 ha) Năng suất (tấn/ ha) Sản lượng (*1.000 tấn)

Năng suất bình quân trên 1 ha của Việt Nam là 1,24 tấn còn thấp so với một

số nước trồng tiêu trên thế giới Vì tiêu là mặt hàng có giá trị cao so với các nông sản khác nên diện tích trồng tiêu của nước ta trong các năm qua đã không ngừng gia tăng từ 9.800 ha năm 1997 đã lên 12.800 ha năm 1998 (niên giám thống kê, 1998) Tuy nhiên nhìn chung hiện trạng trồng tiêu của nước ta đang gặp phải một số hạn chế phải được khắc phục, nhất là về vấn đề khâu giống trồng của nước ta đã lâu đời, chưa được phục tráng tuyển chọn để tìm ra các giống tốt ổn định về mặt năng suất

và kháng sâu bệnh Kỹ thuật chọn và sản xuất giống còn tự phát và đơn điệu Còn

kỹ thuật trồng dựa vào truyền thống là chủ yếu, truyền từ đời này sang đời khác, chưa áp dụng được các tiến bộ khoa học kỹ thuật Việc chăm sóc còn nhiều giới hạn như việc bón phân chưa cân đối, thời kỳ bón chưa hợp lý Về mặt phòng trừ sâu

bệnh nông dân cũng chưa quan tâm đúng mức, trong lúc đó bệnh là đối tượng nguy hại nhiều nhất cho tiêu (Trần Văn Hòa, 2001) Từ đó, vấn đề cây tiêu ngày càng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm hơn đặc biệt là vấn đề giống Để tạo ra giống tiêu đạt yêu cầu về mặt năng suất cũng như phòng trừ sâu bệnh thì phương pháp nuôi cấy mô được quan tâm nhiều hơn cả Trong đó, phương pháp tạo phôi vô tính cây tiêu nhằm nhân nhanh giống và tạo ra giống tiêu sạch bệnh để đáp ứng nhu cầu thực tế của các nhà sản xuất

2.2 Giới thiệu về nấm Phytophthora

Phytophthora (Gr Phyton: Thực vật; phthora: phá hoại), được đặt bởi Bary

(1876) Nấm Phytophthora là loại khá phổ biến của lớp Oomycetes thuộc họ

Pythiacea, bộ Pernoporales, sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thước không đều, túi bào tử có hình trứng và hình quả chanh, trên đầu có nuốm hoặc không có nuốm, không màu, trong suốt Bào tử hình cầu hoặc hình thận có hai lông roi, di chuyển rất nhanh trong nước, nhiệt độ thích hợp để nấm sinh trưởng và phát triển từ 25 - 30oC, pH 6 - 7

Các loài Phytophthora tấn công một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác nhân

gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới – điển hình như bệnh mốc sương mai (hay tàn lụi muộn) trên khoai tây đã gây ra nạn đói ở Châu Âu những năm

1840, nguyên nhân do nấm P infestans (Bourke, 1964) Bệnh Phytophthora đã

được nghiên cứu sâu tại Châu Âu Tuy nhiên, bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới

ẩm và gây nhiều nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này; như bệnh thối rễ, thối cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái Nấm

P palmivora đã gây rất nhiều bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau: đen vỏ

cacao; thân và trái đu đủ; thối rễ và tàn lụi trên cam quýt; thối chồi trên cọ; sọc đen trên cao su; thối rễ loét thân sầu riêng; chết nhanh trên tiêu Trên cây tiêu dòng nấm

Phytophthora gây hại được xác định là nấm Phytophthora capsici gây hại chủ yếu

trong mùa mưa, nhất là vào cuối mùa mưa khi có khí hậu ấm và ẩm Nấm

Phytophthora sp có thể tấn công riêng lẻ nhưng đa số có sự kết hợp với các nấm

khác như Fusarium, Pythium và Rhizoctonia

Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế giới

và có hơn 1.000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983) Trong khi P cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì P

palmivora, P paracitica (P nicotianae) và P citrophthora là đặc trưng ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới; P infestans, P syringae và P fragariae xuất hiện

phổ biến ở vùng ôn đới

Điều kiện phát sinh bệnh, phát triển bệnh

Bệnh héo nhanh do nấm Phytophthora sp tấn công trên cây tiêu thường xảy

ra trong mùa mưa, khi có khí hậu nóng và ẩm Bệnh xảy ra trên những vườn thoát nước kém, đất bị úng nước hoàn toàn là điều kiện cho nấm phát triển Nấm

Phytophthora sống trong đất dưới hình thức các sợi nấm (mycelium) hoặc các bào

tử có vách dày gọi là noãn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại hàng năm trong đất Khi đất ẩm, các noãn bào tử nảy mầm cho ra các sợi nấm (mycelia), các sợi nấm sinh ra các bào tử nang (sporangia), các bào tử nang chứa các cá thể gây bệnh gọi là động bào tử (zoospores) Các động bào tử chỉ phóng thích ra ngoài bào

tử nang để đi gây bệnh khi đất bị úng nước hoàn toàn Khi ra ngoài các động bào tử dùng roi (flagella) bơi tới các rễ cây để gây bệnh hay bơi theo dòng nước mưa để tới các nơi khác trong vườn, làm bệnh lây lan rất nhanh Vườn bị ngập úng nước càng lâu thì áp lực bệnh càng lớn Ngoài ra tuyến trùng cũng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển, tuyến trùng xâm nhập vào rễ tạo vết thương hở cho nấm xâm nhập vào gây bệnh (Trần Văn Hòa, 2001)

2.3 Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật

2.3.1 Khái niệm bức xạ

Bức xạ là sự phát năng lượng vào môi trường dưới dạng tia (tia bức xạ) Bất

kỳ bức xạ nào có khả năng ion hóa các nguyên tử hay phân tử mà nó gặp trên đường

đi đều coi là tia ion hóa

Tia ion hóa được chia làm 2 loại: Sóng điện từ: tia Roentgen (tia X), tia Gamma (tia γ) Các hạt cơ bản: α, β, Proton, Neutron (Cục kiểm soát và An toàn Bức xạ, 2005)

2.3.2 Bức xạ Gamma

Bức xạ gamma là bức xạ điện từ Nó đi được khoảng cách lớn trong không khí và có độ xuyên mạnh Khi đi vào cơ thể, chúng sẽ tương tác với các chất có trong cơ thể và tạo ra các điện tử thứ cấp Các điện tử thứ cấp này là các hạt mang điện nên sẽ gây ra hiện tượng ion hoá dẫn đến việc phá hủy các tế bào sống trong cơ thể Xác suất tạo ra các điện tử thứ cấp tỉ lệ với năng lượng của bức xạ gamma theo hàm mũ

2.3.3 Chất phóng xạ Coban (cobalt)

Coban (Co60) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và y học Đây là kim loại phóng xạ dùng trong xạ trị Kim loại này có đặc tính tạo ra bụi mịn Nguồn Co60hữu dụng trong vòng khoảng 5 năm, nhưng ngay cả sau thời điểm này, mức độ phóng xạ vẫn rất cao

Nhiều sinh vật sống (kể cả người) phải cần đến một lượng nhỏ coban trong cơ thể để tồn tại Coban là một thành phần trung tâm của vitamin cobalamin, hoặc vitamin B12 Tên gọi Coban (cobalt) có xuất xứ từ tiếng Đức kobalt hoặc kobold, nghĩa là linh hồn của quỷ dữ Tên này do những người thợ mỏ đặt ra vì nó mang tính độc hại, gây ô nhiễm môi trường

2.3.4 Cơ chế tác động của bức xạ ion trên cơ thể sống

Bức xạ là một trong những tác nhân gây ra sự tổn thương bức xạ ở mức phân

tử, tế bào và hệ thống cơ quan của cơ thể sinh vật

Các nguyên tử bị ion hóa sẽ làm cho các phân tử cấu tạo nên cơ thể sinh vật

có những biến đổi về hóa học Khi bị tác động thì gene bị biến đổi Tùy theo mức

độ tác động của bức xạ mà gene bị thay đổi ở những mức độ khác nhau

Sau khi nhận năng lượng của bức xạ ion hóa thì các tổ chức tế bào của cơ thể sinh vật sẽ chịu những biến đổi qua hai giai đoạn:

 Giai đoạn hóa lý

Giai đoạn này rất ngắn (10-13

- 10-16 giây), trong giai đoạn này các phân tử sinh học chịu tác dụng gián tiếp và trực tiếp của bức xạ ion hóa

Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp gây ion hóa và kích thích các phân tử trong tế bào làm tổn thương các phân tử đó, đứt gãy liên kết trong các gene, các nhiễm sắc thể, làm sai lệch cấu trúc và tổn thương đến chức năng của tế bào

Tác dụng gián tiếp: khi phân tử nước trong cơ thể bị ion hóa sẽ tạo ra các gốc

tự do, các gốc này có hoạt tính hóa học mạnh sẽ hủy hoại các thành phần hữu cơ như các enzyme, protein, lipit trong tế bào và phân tử DNA, làm tê liệt các chức năng của các tế bào lành khác Khi số tế bào bị hại, bị chết vượt quá khả năng phục hồi của mô hay cơ quan thì chức năng của mô hay cơ quan sẽ bị rối loạn hoặc tê liệt, gây ảnh hưởng đến cơ thể sinh vật

Trong giai đoạn hóa lý một số phân tử sinh học quan trọng như enzyme, nucleoprotein đã bị tổn thương, người ta gọi đó là những tổn thương hóa sinh

 Giai đoạn sinh học

Nếu những tổn thương hóa sinh không phục hồi được, những tổn thương chuyển hóa dẫn đến những tổn thương hình thái và chức năng Đó là giai đoạn sinh học của tác dụng bức xạ ion hóa Giai đoạn sinh học có thể kéo dài từ vài ngày đến hàng chục năm sau khi chiếu xạ

2.3.5 Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa

Theo các kết quả nghiên cứu của Rapport (1961), Feitz (1964) và Heis (1965) thì khi tia phóng xạ vào cơ thể sinh vật sẽ tác động vào nhân tố di truyền trong tế bào theo các dạng sau:

Tác động lên nhiễm sắc thể, gây ra hiện tượng đột biến nhiễm sắc thể

Tác động lên các nguyên tử của phân tử DNA, làm biến đổi cấu tạo gene, khi gene tự tái sinh tạo nên gene đột biến và hình thành nên những tính trạng mới

Sự tác động của tia phóng xạ lên nhân tố di truyền theo các cơ chế sau:

Tác động lên phân tử DNA nghỉ, ngoài thời kì nhân đôi: Làm biến tính base trên DNA nhưng không phá hủy DNA Làm tách base khỏi khung ribose phosphate của DNA gây đứt chuỗi polynucleotide Tạo các cầu nối đồng hóa trị giữa các base tương xứng từ hai mạch của DNA, làm đứt đoạn DNA và gây ngắn chuỗi DNA

Tác động lên phân tử DNA đang trong thời kì nhân đôi: Tạo các chất tương tự base của DNA Tạo các chất gây ngừng nhân đôi DNA hoặc gây loại trừ các base Gây sự giao động tại chỗ do chuyển động nhiệt của các nguyên tử trong các base của DNA, gây rối loạn các phản ứng sinh lý, sinh hóa

Tác động lên hệ thống tổng hợp và sửa chữa DNA: Làm rối loạn chuỗi phản ứng sinh tổng hợp các base DNA, enzyme và làm biến đổi enzyme DNA polymerase Ảnh hưởng phối hợp

Tác nhân gây ảnh hưởng lên hệ thống sửa chữa DNA, làm tăng dần số đột biến tự nhiên Bức xạ ion hóa gây tác động tổng hợp tạo các mảnh đứt DNA hoặc tạo sự khâu mạch giữa hai chuỗi polynucleotide gần nhau và đối với vài trường hợp

có thể gây sắp xếp lại trật tự trên nhiễm sắc thể

2.3.6 Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ

2.3.6.1 Ngoài nước

Phương pháp gây đột biến gene bằng tia phóng xạ đã được nghiên cứu từ lâu Năm 1925, Muller đã tiến hành thành công những công trình nghiên cứu thực nghiệm bằng tia X trên thực vật và trên vi khuẩn và đã tìm ra được những sinh vật biến dị nổi bật Vì vậy năm 1925 được xem là năm ra đời ngành di truyền học phóng xạ

Ở Mỹ, Humphrey (1951), Rauling (1958), William (1960) và ở Đức, Jashchariss (1956) sau khi nghiên cứu xử lý tia phóng xạ trên cây trồng đều đi đến kết luận: "Tia phóng xạ đã làm thay đổi các đặc điểm sinh trưởng, phát dục, hình thái tế bào, vật chất di truyền, đồng thời làm xuất hiện những biến dị có hại, có lợi hoặc trung tính trên nhiều loại cây trồng" Đa số các thí nghiệm đã chọn và thu các biến dị có lợi như: rút ngắn thời gian sinh trưởng, tăng năng suất, tăng tính kháng sâu bệnh, ít đổ ngã, thấp cây, phân cành nhiều, tăng số lượng hoa, đổi màu hoa, tăng trọng lượng hoa

Năm 1964, tổ chức phối hợp FAO/IAEA (Cơ quan lương nông liên hiệp quốc/ Cơ quan nguyên tử năng quốc tế) được thành lập và tổ chức này đã công bố 1.019 giống đột biến ở những cây có hạt được đưa vào sản xuất và 523 giống đột

biến ở những cây sinh sản vô tính và các cây làm cảnh khác nhau Nhiều loại cây trồng quan trọng có số đột biến lớn như: Đại mạch, Lúa, Lúa mì mềm, Đậu phộng, Đậu nành, Lúa mì cứng, Đậu Hà Lan, Bông vải, Kiều mạch và rất nhiều giống hoa khác nhau

Năm 2002, nhóm khoa học của Jammala Machaiah và Mrinal Pednekar, tại Trung tâm Nguyên tử Bhabha (Ấn Độ), đã dùng tia gamma yếu khử gần hết các thành tố axit oligosacharide dưới vỏ đậu Hà Lan và còn rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về ảnh hưởng của tia gamma trên thực vật

2.3.6.2 Trong nước

Tại Việt Nam từ năm 1965 – 1970 các nghiên cứu chọn giống đột biến cây trồng được bắt đầu thực hiện ở Đại học Tổng Hợp Hà Nội Sau đó, các cơ sở nghiên cứu khác như: Viện khoa học Việt Nam, Viện khoa học nông nghiệp, Viện di truyền học, Viện cây lương thực và thực phẩm, các trường Đại học nông nghiệp tiến hành thí nghiệm với tia gamma trên những đối tượng cây trồng khác nhau

Năm 1968, Đại học nông nghiệp I (Hà Nội) đã xử lý phóng xạ Co60 trên đậu nành, thu được một số dòng có triển vọng như: M103, A75, A9 có năng suất cao Năm 1977, Đại học nông nghiệp IV xử lý tia γ (Co60) trên giống đậu nành Santamaria tạo được hai giống: A1, A5 có năng suất cao, rút ngắn thời gian sinh trưởng Gần đây, Việt Nam có nhiều nghiên cứu đáng chú ý về ảnh hưởng của tia gamma lên cây trồng như các nghiên cứu:

Nguyễn Văn Vinh, 2002 Nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến hom mía

(Viện Khoa Học Kỹ Thuật Hạt Nhân)

Hoàng Hưng Tiến, 2003 Nghiên cứu phóng xạ kích thích hạt giống

sắn mì (Trung Tâm Kỹ Thuật Hạt Nhân)

Nguyễn Tiến Thịnh, 2004 Nghiên cứu chiếu xạ gamma liều thấp lên

mẫu khoai tây giống (Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt)

Ở Viện Khoa Học Miền Nam, 2004 Nghiên cứu gây đột biến giống

Lan bằng tia gamma

Nguyễn Thị Lang và Lê Xuân Thám, 2004 Nghiên cứu chiếu xạ gây

đột biến giống lúa khô

Một số nghiên cứu về chiếu xạ kích thích hạt giống hoa Kiết Tường; ảnh hưởng tia phóng xạ γ trên hoa Lily

Trần Thanh Hân, 2005 Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo cây khoai tây và

ảnh hưởng kích thích sinh trưởng của bức xạ gamma liều thấp

Lê Văn Hòa , 2006 Nghiên cứu : "Xác đi ̣nh khả năng gây đột biến

giống hoa lan cắt cành (Dendrobium sp.) bằng colchicine và tia gamma" (Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng)

Hiện nay, các đề tài khoa học nghiên cứu về ảnh hưởng của tia gamma đến kiểu hình, khả năng kích thích sinh trưởng trên đậu nành, lúa, bắp và những cây trồng khác đang tiếp tục được nghiên cứu Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu thử

nghiệm áp dụng phương pháp chiếu xạ tạo đột biến đa dạng trên hệ nuôi cấy in vitro

nhiều cây trồng như khoai lang, khoai tây, dâu tằm, chuối, hoa cẩm chướng, hoa hồng, địa lan, cúc Tuy nhiên kết quả thu được còn hạn chế (tài liệu của Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt năm 2002 – 2006)

2.4 Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Khái niệm

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi sinh vật, được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống

2.4.2 Ứng dụng

Kỹ thuật này thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng: Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh, tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh, cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến, sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, lai xa qua nuôi cấy phôi và noãn, lai tế bào soma và tạo dòng protoplast, cải biến tính thực vật qua hấp thụ DNA ngoại lai, cố định nitrogen, cải thiện hiệu quả quang tổng hợpvà bảo quản nguồn gen quý

Trong giai đoạn hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Các vấn đề cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn trong môi trường nhân tạo, nhu cầu về khoáng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng ngày càng được hiểu sâu sắc hơn

2.4.3 Phương pháp nhân phôi vô tính

2.4.3.1 Khái niệm

Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình, qua đó một hay vài tế bào soma, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật), có thể dấn thân vào một sự phân chia theo một trật

tự nhất định để cho một phôi, theo kiểu giống hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử (Bùi Trang Việt, 1994)

2.4.3.2 Ý nghĩa nuôi cấy mô phôi vô tính

Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lượng lớn thực vật bằng bioreactor Tạo hạt nhân tạo, là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật và mở ra nhiều triển vọng mới trong công nghệ nuôi cấy tế bào

2.4.3.3 Sự hình thành phôi vô tính

Sự tạo phôi soma được thực hiện lần đầu tiên vào năm 1958 bởi Steward và Reinert Tuy nhiên khoảng 20 năm sau mới có những nghiên cứu để có thể làm rõ

cơ chế của sự sinh phôi vì sự phát sinh phôi soma chỉ xảy ra invitro với tần suất

thấp và không đồng nhất trong những hệ thống nuôi cấy Để có thể nghiên cứu sự phát sinh phôi soma ở mức độ phân tử cần phải thiết lập một hệ thống nuôi cấy đồng nhất và có hiệu suất cao

Sự hình thành phôi vô tính là quá trình tạo ra tế bào có khả năng sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực vật một cách nhanh chóng Trong quá trình này, một

tế bào đơn có thể được cảm ứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành cây nguyên vẹn (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào đẳng kín, nhân to, tế bào chất đậm đặc và nhiều hạt tinh bột Những tế bào này có hàm lượng protein và RNA cao (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Sự hình thành phôi vô tính trải qua hai giai đọan:

Sự hình thành phôi vô tính có thể qua 2 con đường là trực tiếp và gián tiếp: Phôi vô tính trực tiếp: được hình thành từ một tế bào hay một nhóm tế bào mà không thông qua sự hình thành callus Phôi vô tính gián tiếp: được hình thành chủ yếu từ callus

Có 2 bước dẫn đến sự hình thành phôi: Sự biệt hóa của tế bào có khả năng phát sinh phôi và sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành thông qua các giai đoạn sau: phôi hình cầu, phôi hình trái tim và phôi hình cá đuối

2.4.3.4 Các kiểu phát sinh phôi soma

Sự phát sinh phôi soma bất định

Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của một số loài thực vật nhiệt đới Các phôi bất định có thể được tạo trực tiếp từ tế bào đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này Phương pháp này được sử dụng trong chương trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn như: cứu các phôi bị chết non do lai tạo

Sự phát sinh đa phôi vô tính

Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần Các khối mô có khả năng tạo phôi cao, khi được cấy chuyển sang môi trường mới sẽ phát triển và tăng trưởng thành phôi Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể được phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hóa đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine Dưới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể phát huỳnh quang màu xanh lá cây

Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng

Hiện tượng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi Người ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên nhiều lọai thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan sát khả năng tạo thành mô sẹo

2.5 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.5.1 Chất điều hoà sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật

Về đại cương các chất điều hòa sinh trưởng được chia làm hai nhóm: các chất

kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy in vitro thì sự

cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng với nhau là điều cần thiết

2.5.2 Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng trong nuôi cấy mô

Hiện nay 3 nhóm chất điều hòa sinh trưởng thường được dùng: auxin, cytokinin và gibberellin

Auxin

Auxin tự nhiên là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu

rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào Auxin bị phân hủy bởi ánh sáng, có tính phân cực Ví dụ như: IAA (indolacetic acid), IBA (indolbultyric acid), NAA (napthtalene acetic acid), 2,4D (dichlophenoxy acetic acid) (Vũ Văn Vụ, 2000)

Chức năng của auxin: Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to

ra, làm tăng kích thước của các cơ quan, ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào như cellolose, pectin Điều chỉnh tính hướng động của cây: quang hướng động và địa hướng động Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn được giải thích bằng việc ức chế sinh trưởng của chồi bên khi auxin được vận chuyển từ ngọn xuống dưới Kích thích sự hình thành rễ Kích thích

sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kiềm hãm sự rụng lá, hoa, quả Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù

Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý

và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, RNA và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý

Một đặc trưng quan trọng của auxin là tác động chủ yếu lên vách tế bào (Torry và csv, 1981) Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+

, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Roger Prat, 1993)

Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981; Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Cytokinin

Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003) Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô Những cytokinin thường gặp nhất là: Kinetin (6 Furfuril aminopurin), BA (6-Benzyl aminopurin), TDZ (thidiazuron) Đặc điểm của cytokinin: Cytokinin được vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể hướng ngọn và hướng gốc Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng như các phytohormone khác Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA, và PBA

Chức năng của cytokinin: Vai trò sinh lý đặc trưng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào Ảnh hưởng lên sự hình thành và phân hóa cơ quan đặc biệt là phân hóa chồi Kìm hãm quá trình hóa già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân hủy của diệp lục, protein và acid nucleic

Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa Điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn Ảnh hưởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó

có ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trưởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bướu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L và csv, 1991) Trong những nghiên cứu gần đây về tạo phôi vô tính thực vật người ta thấy rằng việc kết hợp nồng độ auxin và cytokinin ở những nồng độ và tỷ lệ thích hợp sẽ

có khả năng khích thích tạo thành phôi vô tính Hiện nay nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ (chất điều hoà tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin) có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001)

Gibberellin

Gibberellin là nhóm phytohoocmon thứ 2 được phát hiện sau auxin, từ việc nghiên cứu bệnh lý “bệnh lúa von” Năm 1926, Kurosawa (Nhật bản) đã thành công trong thí nghiệm gây bệnh von nhân tạo cho cây lúa và ngô Yabuta (1934-1938) tách được 2 chất dưới dạng tinh thể từ nấm lúa von gọi là gibberellin A và B, nhưng chưa xác định được bản chất hoá học của chúng Năm 1955, hai nhóm nghiên cứu Anh và Mỹ phát hiện ra axit gibbellic ở cây lúa von và xác định công thức hoá học của nó (C19H22O6) Năm 1956, West, Phiney, Radley tách được gibberellin từ thực vât bậc cao và phát hiện trên 50 gibberellin và kí hiệu A1, A2, … A52 hoặc GA1,

GA2, …GA52, trong đó A3 có hoạt tính mạnh nhất Các gibberellin khác nhau chủ yếu ở vị trí nhóm –OH trong phân tử GA được tổng hợp ở trong phôi đang sinh trưởng, trong các cơ quan đang sinh trưởng khác nhau như lá non, rễ non, quả non Vai trò sinh lý: Kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự vươn dài của lóng cây họ lúa, ảnh hưởng lên sự sinh trưởng các đột biến lùn Sử dụng GA ngoại sinh để cây phát triển bình thường Kích thích sự nẩy mầm của hạt và củ Kích thích sự ra hoa, ảnh hưởng đặc trưng lên sự ra hoa là sự sinh trưởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa Ảnh hưởng sự phân hoá giới tính: ức chế sự phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực Làm tăng kích thước của quả, tạo quả không hạt

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng được dùng để thí nghiệm là cây tiêu giống Vĩnh Linh in vitro có

sẵn trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Học – Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh và Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt trong thời gian từ tháng 3 năm 2007 đến tháng 8 năm 2007

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy

3.3.1.1 Phòng chuẩn bị môi trường

Nồi hấp: hấp vô trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy, tủ lạnh bảo quản hóa chất và môi trường dự trữ, bể rửa chai, ống nghiệm, bếp điện, cân phân tích, máy khuấy từ, máy đo pH và bình 250 ml

Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20C, nhiệt

kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây, ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây

3.3.2 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy

Mẫu cấy: Mô sẹo và chồi của cây tiêu Vĩnh Linh

Điều kiện nuôi cấy: cường độ ánh sáng 50 µmol/m2/s Nhiệt độ 26 2oC và

ẩm độ 60 – 80% Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày

3.3.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm là:

MS (Murashige và Skoog, 1962), gồm các thành phần sau:

Nguyên tố đa lượng

Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l

Fe EDTA FeSO4.7H2O 27,8 mg/l

Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/l

Các chất khác:

Đường sucrose: 30 g/l, agar: 8,5 g/l và pH môi trường trước khi hấp: 5,8

Các chất điều hòa sinh trưởng: BA (N6-benzyladenine), IBA butyric acid), TDZ (Thidiazuron), 2,4D (Dichlophenoxy acetic acid)

(Indole-3-3.3.4 Các công thức xử lý chiếu xạ

Đồng vị phóng xạ nhân tạo Co60 được sử dụng là nguồn phát xạ gamma tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt

Tia γ có bản chất sóng điện từ, có bước sóng ngắn nên không bị lệch hướng khi đi qua điện từ trường và có khả năng đâm xuyên rất lớn

Trong xử lý phóng xạ người ta dùng hai đơn vị để đo lường phóng xạ:

Rad: để đo năng lượng hấp thụ Rad là liều lượng bức xạ bất kỳ loại nào tạo ra trong môi trường vật chất mà tia phóng xạ đó truyền qua

Roentgen (Г): đơn vị dùng để đo năng lượng phát xạ của tia ion có bản chất là sóng điện từ (tia X và tia γ)

Tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt vào thời điểm tiến hành thí nghiệm cuối tháng 06/2007 máy phát xạ tia γ hoạt động với các thông số sau:

Suất liều phát xạ tại chỗ:

Liều đỉnh : 13,38 rad/giây

Liều trung tâm : 19,22 rad/giây

Liều đáy : 18,78 rad/giây

Liều dịch chuyển

Liều đỉnh : 246,27 rad/giây

Liều trung tâm : 396,27 rad/giây

Liều đáy : 346,27 rad/giây

Dung tích buồng chiếu là 4 lít Chiều cao 24 cm, đường kính 15 cm

Các ứng dụng và tính toán được dựa trên cơ sở suất liều phát xạ trung tâm và liều dịch chuyển trung tâm, công thức tính thời gian xử lý mẫu như sau:

T = Liều cần chiếu (rad) – Liều dịch chuyển (rad) / Suất liều phát xạ (rad/ giây) T: thời gian mẫu cần được xử lý (giây)

Trong đó:1 Gy = 100 rads Vậy khi chiếu liều xạ:

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Pha môi trường MS (Murashige & Skoog) bổ sung nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA, IBA, TDZ, 2,4-D khác nhau tùy theo từng nghiệm thức

Môi trường được cho vào bình nuôi cấy có dung tích là 250 ml, mỗi bình chứa

30 ml môi trường hấp ở 121oC; 1,2 atm trong 25 phút

3.4.2 Nội dung nghiên cứu

3.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsici đến sinh

trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu

 Phương pháp thí nghiệm

Phương pháp tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro

Tạo mô sẹo từ lá cây tiêu trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D

và 3 mg/l BA Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xảy ra trong bóng tối và mô sẹo được tạo thành từ những vết thương trong quá trình cắt mẫu lá

Sử dụng cây tiêu nuôi cấy in vitro, lấy mẫu lá cắt nhỏ thành những mẫu nhỏ

(0,4 cm x 0,4 cm) Đặt vào môi trường sao cho mặt dưới lá tiếp xúc với môi trường Mỗi chai cấy 4 - 5 mẫu lá nhỏ Sau đó, để vào trong bóng tối trong 2 tuần, khi từ những vết cắt bắt đầu xuất hiện sự sùi mô sẹo thì lấy ra để ngoài ánh sáng nhẹ (50 µmol/m2/s) để mô sẹo tiếp tục phát triển

Lấy mô sẹo để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Quá trình tạo mô sẹo được tiến hành trong điều kiện: Mẫu được nuôi trên môi trường: khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar và 8,5 g/l đường saccharose, 1 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BA Môi trường đã được khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút pH môi trường trước khi hấp: 5,8 Thể tích môi trường: 30 ml Cường độ ánh sáng: Tối hoàn toàn trong 2 tuần đầu, 3 tuần sau đó cường độ ánh sáng là 50 µmol/m2

/s Nhiệt độ: 25 ± 20C và ẩm độ: 65 ± 5%.Thời gian theo dõi thí nghiệm: 5 tuần