Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây lùng nghệ an bằng phương pháp vi nhân giống in vitro

... tài Tạo vật liệu khởi đầu bước đầu tái sinh Lùng Nghệ An phương pháp vi nhân giống in vitro Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cứu Tạo vật liệu khởi đầu bước đầu tái sinh Lùng Nghệ. .. KHOA SINH - KTNN PHẠM THỊ HUYỀN TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU TÁI SINH CÂY LÙNG NGHỆ AN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh. .. tiêu sinh trưởng 32 3.2.1 Tái sinh nhân nhanh Lùng Nghệ An phương pháp tạo cụm chồi từ cành 32 3.2.2 Tái sinh nhân nhanh Lùng Nghệ An phương pháp tạo cụm chồi từ đốt than

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ------------------------ PHẠM THỊ HUYỀN TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU TÁI SINH CÂY LÙNG NGHỆ AN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI, 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ------------------------ PHẠM THỊ HUYỀN TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƯỚC ĐẦU TÁI SINH CÂY LÙNG NGHỆ AN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dấn khoa học ThS. LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến ThS. La Việt Hồng đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận. Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Huyền LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in vitro”: là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do ThS. La Việt Hồng hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả của tác giả khác. Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Huyền DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6 - benzyl amino purin CT Công thức ĐC Đối chứng Kn Kinetin H2O2 Hydro peroxide (nước oxy già) HgCl2 Thủy ngân Clorua MS Murashige and Skoog, 1962 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các công thức tạo vật liệu khởi đầu ........................................ 23 Bảng 2.2. Công thức nghiên cứu tạo cụm chồi mẫu cành và đốt thân cây Lùng ..... 25 Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu giống cây Lùng ....................... 27 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, nước dừa, Kinetin đến hệ số nhân chồi, số lá, chiều dài mẫu cành cây Lùng ...................................... 32 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, nước dừa, Kinetin đến hệ số nhân chồi, số lá, chiều dài mẫu đốt thân cây Lùng................................. 35 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây Lùng (Bambusa sp.) ............................................................ 4 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tạo vật liệu in vitro ở cây Lùng ........................ 22 Hình 3.1. Sơ đồ thể hiện tỷ lệ mẫu sống của cây Lùng ................................. 28 Hình 3.2. Mẫu cành vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) ....30 Hình 3.3. Mẫu cành vô trùng sống phát sinh chồi ......................................... 30 Hình 3.4. Mẫu thân vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết)30 Hình 3.5. Mẫu thân vô trùng( mẫu sống) .................................................. 30 Hình 3.6. Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ cành có chứa mắt ngủ của cây Lùng ..................................................................................... 31 Hình 3.7. Sơ đồ ảnh hưởng của BAP, nước dừa và Kinetin đến hệ số nhân nhanh chồi mẫu cành cây Lùng ............................................................... 33 Hình 3.8. Mẫu cành sau 2 tuần nuôi cấy ....................................................... 34 Hình 3.9. Mẫu cành sau 3 tuần nuôi cấy ....................................................... 34 Hình 3.10. Mẫu cành sau 5 tuần nuôi cấy ..................................................... 34 Hình 3.11. Chồi mới tạo ra chết ................................................................ 34 Hình 3.12. Sơ đồ ảnh hưởng của BAP, nước dừa và Kinetin đến hệ số nhân nhanh chồi mẫu đốt thân cây Lùng ....................................... 35 Hình 3.13. Mẫu đốt thân sau 2 tuần nuôi cấy................................................ 37 Hình 3.14. Mẫu đốt thân sau 3 tuần nuôi cấy................................................ 37 Hình 3.15. Mẫu đốt thân sau 5 tuần nuôi cấy................................................ 37 Hình 3.16. Mẫu đốt thân sau 7 tuần nuôi cấy................................................ 37 MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................. 2 2.1. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 2 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 3 3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3 NỘI DUNG ................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................. 4 1.1. Giới thiệu về cây Lùng (Bambusa sp.) ..................................................... 4 1.1.1. Phân loại............................................................................................... 4 1.1.2. Mô tả ................................................................................................... 4 1.1.3. Phân bố................................................................................................. 5 1.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro .......................................................... 5 1.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào .......................................................... 5 1.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................. 5 1.2.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro ......................... 6 1.2.4. Các giai đoạn vi nhân giống (nhân giống in vitro) ................................ 8 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật .......... 10 1.3.1. Vật liệu nuôi cấy................................................................................. 10 1.3.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................... 10 1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy...................................................... 15 1.4. Các nghiên cứu vi nhân giống về họ tre trên thế giới và ở Việt Nam ..... 16 1.4.1. Vi nhân giống họ tre trên thế giới ....................................................... 16 1.4.2. Vi nhân giống họ tre ở Việt Nam ........................................................ 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP................................... 20 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................... 20 2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 20 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 20 2.2.2. Trang thiết bị và dung cụ .................................................................... 20 2.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 21 2.4. Điều kiện nuôi cấy................................................................................. 21 2.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 22 2.5.1. Bố trí thí nghiệm................................................................................. 22 2.5.2. Phương pháp nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu ................................... 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 26 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu ................................................................................................ 26 3.2. Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi và đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng ......................................... 32 3.2.1. Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi từ cành ................................................................................................. 32 3.2.2 Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi từ đốt than ................................................................................... 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 39 PHỤ LỤC.................................................................................................... 44 MỞ ĐẦU 2. Lý do chọn đề tài Cây Lùng (Bambusa sp.) thuộc họ Tre – Bambusoideae là một loại cây trồng quan trọng được quan tâm trong nhiều lĩnh vực nông nghiệp, lâm nghiệp và công nghiệp tại Việt Nam và nhiều nước khác. Tại rừng Nghệ An có gần 20 loài tre trúc các loại, trong đó Lùng là loại có giá trị kinh tế đặc biệt nhất với các tính năng ưu việt như: độ dẻo, màu sáng bóng, thớ mịn, lóng dài (dài nhất trong các loài tre trúc của Việt Nam). Trong điều kiện đất tốt, mật độ thích hợp, Lùng có thể cho lóng dài tới 1,5m, cho phép đan những vật dụng có kích thước lớn, đảm bảo độ thẩm mỹ cao, hoặc sản xuất nhiều mặt hàng thủ công mỹ nghệ xuất khẩu hiện đang rất được ưa chuộng 42. Lùng có giới hạn bền khi nén dọc thớ và giới hạn bền khi kéo dọc thớ, hơn hẳn nhiều loại gỗ. Chính vì vậy dùng Lùng làm cột chống, xà đỡ trong xây dựng, giao thông vận tải, chèn hầm lò, sản xuất giấy là rất tốt. Mặt khác với hình dáng đẹp, màu sáng bóng, long dài, độ bền cao Lùng được ưa chuộng dùng làm nhà ở, cửa hàng,... Những ngôi nhà được làm từ Lùng rất bền lại có vẻ đẹp trang nhã, thích hợp cho những khách sạn, nhà hàng, hay những quán ăn,… hơn nữa nếu kết hợp toàn bộ đồ nội thất, mỹ nghệ cũng được làm từ Lùng như: Bàn, ghế, tủ đựng hàng, đèn chiếu sáng thậm chí là cả lọ cắm hoa,… sẽ tạo nên một khung cảnh cực kì lãng mạng và sang trọng, chính vì vậy những đồ nội thất, mỹ nghệ làm từ Lùng đang là mặt hàng xuất khẩu rất có giá trị. Ngoài ra, trong nông nghiệp, trong sinh hoạt hàng ngày cây Lùng cũng được sử dụng khá rộng rãi như: làm neo, giá đỡ cho nhiều cây lương thực, làm chiếu, mành, đũa, xiên thịt, ván sàn, than hoạt tính, mây tre đan, tăm, chân hương,… 1 Lùng cũng thể hiện nhiều ưu điểm như sinh trưởng phát triển nhanh, dễ trồng, dễ khai thác. Được sử dụng làm cây trồng phủ xanh rừng ở Việt Nam và một số nước khác. Với những lợi ích kinh tế to lớn cây Lùng đang dần dần xóa đói giảm nghèo cho nhiều hộ nông dân nghèo ở Nghệ An và một số tỉnh khác trong cả nước, từ những người trồng Lùng, người thu hoạch và thợ thủ công, tuy nhiên chính những lợi ích kinh tế này hiện người dân với mục đích thu được lợi nhuận kinh tế cao đã khai thác quá mức, không đúng kĩ thuật, dẫn đến các khu rừng Lùng đang đứng trước nguy cơ giảm về diện tích cũng như sản lượng và chất lượng. Chính vì vậy việc đưa Lùng vào trồng trọt và khai thác hợp lí là một giải pháp lâu dài và cực kì cấp thiết 42, 43. Nhưng với các kĩ thuật nhân giống hiện nay như: Ươm, chiết, không đáp ứng được nhu cầu cung cấp giống cho trồng trọt. Để góp phần đẩy mạnh sử dụng có hiệu quả nguồn nguyên liệu, vật liệu trong nước và xuất khẩu. Đáp ứng nhu cầu về giống cây Tre nói chung và cụ thể là cây Lùng nói riêng. Một hướng nghiên cứu mới đã và đang được quan tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất, năng suất cao. Việc tạo ra cây Lùng ổn định và đồng nhất là vấn đề cần thiết để phục vụ cho nhu cầu trồng trọt và nghiên cứu khai thác, sử dụng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in vitro”. 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1. Mục đích nghiên cứu Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in vitro. 2 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu. - Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi. - Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, số lá, chiều cao của chồi cây Lùng in vitro. 3. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Nhằm góp phần bổ sung vào tài liệu nghiên cứu nhân giống in vitro về cây Lùng. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong nuôi cây mô tế bào cây gỗ. Góp phần sản xuất cây giống đồng bộ có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu khai thác nguyên liệu, vật liệu và măng từ cây Lùng. 3 NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Lùng (Bambusa sp.) 1.1.1. Phân loại Bộ: Poales (Hòa thảo) Họ: Bambusoideae Tông: Bambuseae Loài: Bambusa sp. 1.1.2. Mô tả Lùng là loại tre to, không gai, lá nhỏ, mọc cụm – thân ngầm dạng củ, thưa cây, thân khí sinh có ngọn cong ngắn. Thân tre cao, ngọn cong, đường kính lớn (40-50 cm), lóng dài (ngắn nhất là 1m), vách thân dầy. Phiến lá thuôn hình ngọn giáo, hai mép có răng sắc rất nhỏ, đầu nhọn đuôi hình nêm hay gần tù. Lá khi non mầu xanh thẫm, mềm mại; khi già mầu xanh nhạt có những chấm nhỏ mầu gỉ sắt. Bẹ mo hình chuông. Tai mo phát triển và có nhiều lông mầu nâu. Thìa lìa xẻ răng sâu thành dạng lông. Lá mo hình mũi giáo, có lông cả 2 mặt, hơi lật ngửa – cụp về phía ngoài. Mo sớm rụng, khi cây măng toả đuôi én thì mo trên thân cũng rụng gần hết. Măng ở giai đoạn thấp có mầu tím Hình 1.1. Cây Lùng (Bambusa sp.) 4 nâu, lên cao có mầu tím hồng hay tím đỏ; lên cao hơn nữa có mầu tím da cam hay đỏ hồng; khi cây măng vượt ra ánh sáng măng có mầu xanh vàng hay xanh xám nhạt. Hoa tự cành nhiều chuỳ, các bông chét tập hợp thành cụm thành hình cầu ở các đốt của trục hoa tự. Bông chét hình trái xoan nhọn. 1.1.3. Phân bố Lùng là một loài cây bản địa thuộc bộ tre trúc, ở Việt Nam Lùng phân bố tương đối hẹp ở 5 xã của huyện Quỳ Châu, 3 xã của huyện Quế Phong (Nghệ An) và một số xã của huyện Thường Xuân (Thanh Hóa), hiện nay đang được trồng mở rộng thêm ở một số địa phương khác 42. 1.2. Sơ lược về nhân giống cây in vitro 1.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các hoocmon các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau. 1.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Năm 1902, Haberlandt (Đức) là người đầu tiên đề xướng học thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào đều mang trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh. Vì vậy khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một cơ thể”. Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ 5 những cơ quan, bộ phận của cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng thời về mặt di truyền giống với cây mẹ. 1.2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào Sự phân hóa là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hóa để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hóa khác nhau. Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toán năng của tế bào thực vật. 1.2.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 1.2.3.1. Ưu điểm Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà các phương pháp khác thường gặp, sau đây là những ưu điểm chính: - Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng và phát triển cao. - Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. - Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao. - Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội). - Bảo quản và lưu trữ tập đoàn gen. - Có khả năng sản xuất quanh năm. - Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém. - Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà. 6 Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Thí dụ: Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này. Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất 10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500.000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm. 1.2.3.2. Nhược điểm Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác. Ngoài ra, phương pháp này còn có những nhược điểm sau: - Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây non có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm. - Cây có thể có những đặc tính không mong muốn. - Khả năng tạo đột biến tăng. - Khả năng tái sinh có thể mất đi do cấy truyền callus, hay huyền phù tế bào nhiều lần. - Cây giống có thể nhiễm bệnh đồng loạt. Tuy nhiên phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ những mục đích sau: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liêu cho công tác chọn giống. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo. 7 - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ. - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. - Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống, nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen. 1.2.4. Các giai đoạn vi nhân giống (nhân giống in vitro) Vi nhân giống (Micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro (in vitro propagation) là phương pháp ứng dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc các loại bình nuôi cấy khác. Sự thành công của việc nhân giống in vitro đạt được khi trải qua các giai đoạn sau: 1.2.4.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Khử trùng mô thực vật, người ta thường dùng một số chất hoá học như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2. Tùy thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp. 1.2.4.2. Giai đoạn 2: Tái sinh và nhân nhanh chồi Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này được xem là giai đoạn then chốt của quá trình. 8 Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, xytokynin, gibberellin,...). Các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thủy phân casein,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. 1.2.4.3. Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 2 sang môi trường tạo rễ. Thường sau từ 1 - 2 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin vì auxin là hoocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này, các chất IAA, IBA,  - NAA và 2,4 - D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất. 1.2.4.4. Giai đoạn 4: Đưa cây ra đất Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc. Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng. Do đó, để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ 10 - 15 ngày. Lúc này rễ mới được sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường. 9 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.1. Vật liệu nuôi cấy Cơ thể thực vật đa bào đều có tính toàn năng nghĩa là đều có khả năng phân hóa tái sinh thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo và môi trường có điều kiện thích hợp. Do vậy về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụng làm vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực vật nguyên vẹn như cây con, mầm non, các mô sẹo, các tế bào đơn, tế bào trần,. . . Tuy nhiên, khả năng này phụ thuộc vào từng loài, có loài dễ tái sinh từ mô nuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá,… có loài rất khó như hoa đồng tiền, trầm hương,. . . Thông thường các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của mô cũng như các bộ phận khác nhau của cây, khi nuôi cấy sẽ cho những kết quả khác nhau. Điều đáng chú ý là những mô nuôi cấy có nguồn gốc từ cây in vitro có khả năng phát sinh, phát triển tốt hơn so với những mô nuôi cấy có nguồn gốc là những cây ngoài tự nhiên hay trong nhà kính. Nhìn chung, tất cả các bộ phận như thân, lá, rễ, cuống lá,. . . đều có thể sử dụng để nuôi cấy, nhưng các cơ quan này do có sự chuyển hoá khác nhau nên quá trình giải mã các thông tin di truyền trong đó để tạo mô, tạo chồi, tạo rễ, tái sinh cây,. . . là cũng rất khác nhau. Kích thước mô nuôi cấy khác nhau sẽ cho các phản ứng không giống nhau và có liên quan mật thiết với tỷ lệ sống, cũng như mức độ ổn định về mặt di truyền của mô cấy. Do đó, tuỳ từng đối tượng, từng loại mô và mục đích sử dụng mà người ta nuôi cấy mô có kích thước khác nhau cho phù hợp. 1.3.2. Môi trường nuôi cấy Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng. Vì vậy, để cho mô tồn tại và phân hóa thì trong các giai đoạn nuôi cấy phải tạo ra được môi trường có đủ các chất dinh dưỡng mà cây cần thiết. Thành 10 phần hoá học của môi trường dinh dưỡng gồm chủ yếu là muối khoáng, nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trưởng,. . . Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (l962) 26 viết tắt là MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1965) [23], môi trường Gamborg (1968) [15]… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải biến ra nhiều loại môi trường khác nhau cho phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó, môi trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số loài thực vật 2. Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo từng loại thực vật, loại tế bào, mô, cơ quan được nuôi cấy, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy cũng như mục đích nuôi cấy. Tuy nhiên môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau: - Các nguyên tố đa lượng (muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali, lưu huỳnh) là thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các cơ quan tử trong cơ thể thực vật. - Các nguyên tố vi lượng (muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban, molipden, bo, iot). Các nguyên tố này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn xuân hóa, ngoài ra chúng còn là thành phần của enzym, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong cơ thể. Ví dụ thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu bo gây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh nhưng lại xốp, mọng nước và tái sinh kém, molipđen tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật 1. - Nguồn cabon: khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có khả năng quang hợp nên đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon để tạo năng lượng cho các quá trình sinh lí, sinh hóa diễn ra bình thường trong tế bào. Đường sucrose là nguồn cacbon tốt nhất thường được sử dụng với nồng độ 2 - 3%. 11 Đường có thể bị caramen hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất melanoidin, một chất sẫm màu có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào 2. - Các vitamin: mô và các tế bào nuôi cấy tuy có tổng hợp được vitamin nhưng không đủ nên thường phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là: thiamin (B1) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxi hóa khử dehydrogenase xúc tác việc tách hydro ra khỏi các axit hữu cơ; pyridoxin (B6) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit amin; myo - insitol giúp cải thiện sự tăng trưởng của mô, có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào. Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng trưởng của mô nuôi cấy, vitamin được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp tế bào 1. - Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nước dừa, dịch chiết muối, dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân cazein,… cũng được sử dụng trong nuôi cấy in vitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc đẩy tăng trưởng tế bào và mô nuôi cấy. Nước dừa bổ sung vào môi trường các loại đường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin, các chất kích thích sinh trưởng, các vitamin và các chất quan trọng khác có tác dụng tốt trong tăng trưởng của mô 5. - Các chất làm rắn môi trường: agar là một polysaccarit thu được từ một số tảo thuộc ngành tảo đỏ. Agar được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo giá thể nâng đỡ cây. Tùy đặc điểm nuôi cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử dụng thay đổi từ 0,8 - 1,0%. Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuếch tán cũng như hấp thụ dinh dưỡng của mô, tế bào. Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Agar có thể ảnh hưởng 12 đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể có những tác động sinh lí trên mô thực vật. Ngoài agar, một số hợp chất khác cũng đã được thử nghiệm thành công để làm rắn môi trường như Gerlit (là một polysaccarit tinh và trong suốt được hình thành trong quá trình lên men của Pseudomonas 5. - Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: phytohoocmon là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy. Nhờ những chất này mà các nhà nghiên cứu có thể điều chỉnh quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Trong nuôi cấy mô tế bào hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là auxin và xytokynin: *Auxin là chất điều khiển sinh trưởng chủ yếu kích thích sinh trưởng tế bào làm tăng phân bào, gây hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành rễ 1. Nhóm auxin bao gồm IAA, IBA,  - NAA, 2,4 - D có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp kích thích ra rễ, ở liều lượng cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo và thường gây nên các đột biến 5. 2,4 - D thường được sử dụng rộng rãi trong việc phát sinh mô sẹo; IAA, IBA,  - NAA thường được sử dụng trong việc phát sinh rễ 2. *Xytokynin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenin nó liên quan chặt chẽ đến quá trình phân bào, kích thích phân hóa chồi từ mô cấy. Các xytokynin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BA, zeatin giúp tạo số lượng chồi nhiều nhưng có kích thước nhỏ 2, có thể gây ra hiện tượng mọng nước (thủy tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ). Theo Skoog và Miller, tỷ lệ auxin/xytokynin cao thường có xu thế kích thích quá trình tạo rễ bất định, kéo dài chồi, ngược lại tỷ lệ trên thấp thì sẽ đẩy mạnh biệt hóa chồi và ức chế sự phát triển chồi, nếu tỷ lệ trung bình thì mô sẹo sẽ được hình thành 5. Ngoài ra trong nuôi cấy mô tế bào người ta còn sử dụng nhóm phytohoocmon khác là GA (Gibberellic axit). Gibberelin điển hình là GA3 có 13 tác dụng kích thích kéo dài lóng đốt và sự sinh trưởng của cây, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của cây,… Nhưng so với auxin và xytokynin thì nhóm GA rất ít được sử dụng vì có biểu hiện ức chế sinh trưởng và phát sinh hình thái thực vật in vitro, đặc biệt là với mô thực vật một lá mầm, GA3 được đưa vào môi trường trong những trường hợp cần thiết để kéo dài những chồi bất định hoặc kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật 5. *pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH của môi trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ các chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH môi trường là NAA, gibberellin và các vitamin. Sự hấp thụ các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH. pH môi trường thường ở 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng 4. Giá trị pH đầu tiên của môi trường ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và tổng hợp của tế bào. Khi pH môi trường thấp sẽ hoạt hóa các enzym hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy 3. Giá trị pH đầu tiên của môi trường nuôi cấy luôn luôn ở trong khoảng 5,5 - 5,9. Vì hầu hết trong môi trường nuôi cấy đều không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đổi trong quá trình khử trùng môi trường và trong quá trình nuôi cấy. Giá trị pH giảm nhanh chóng xuống 4,0 4,5 trong vòng 24 - 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi trường nuôi. Những thay đổi này liên quan đến sự hấp thụ amonium của tế bào. Tuy nhiên, giá trị pH sẽ tăng lên sau vài ngày và giữ ở mức độ ổn định 5,0 - 5,5 do có liên quan đến sự hấp thụ nitrate. *Ảnh hưởng của than hoạt tính Nồng độ thường dùng là từ 0,2 – 3%. Than hoạt tính có các tác dụng sau: - Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không màu khác. 14 - Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn…). - Thúc đẩy sự tạo phôi soma. - Ổn định độ pH. 1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mô nuôi cấy, ảnh hưởng đến sự phát triển của từng tế bào riêng lẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy. Nhiệt độ thích hợp sẽ ảnh hưởng tích cực đến quá trình sinh trưởng của đa số các loại thực vật nuôi cấy. Nhiệt độ rất thấp còn được sử dụng làm chậm hay ngừng sinh trưởng hẳn của mầm nuôi cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro. Trong thực tế, nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định 250C  10C, điều này là do nhiệt độ thật của các mô nuôi cấy trong bình nuôi cấy có thể cao hơn 2 - 40C so với nhiệt độ của phòng. Thông thường, người ta điều chỉnh nhiệt độ phòng nuôi cấy trung bình. Các loại cây sống ở vùng ôn đới thường quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính vì vậy mà người ta sẽ có lợi hơn khi có những phòng nuôi cấy có nhiệt độ 200C  10C dành cho cây nhiệt đới 2. Ánh sáng: bao gồm cường độ, thời gian và chất lượng ánh sáng. Khi chuẩn bị cho cây con ra ngoài vườn ươm nếu gia tăng cường độ ánh sáng thì sẽ “tăng sức “cho cây con. Trong thực tế ở phần lớn các phòng thí nghiệm thời gian chiếu sáng 16 - 18 giờ/ngày được coi là tốt nhất cho nuôi cấy mô 2. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hoocmon nội sinh. Các kết quả này cùng với các kết quả nghiên cứu khác cho thấy quá trình phát sinh hình thái của thực vật được điều chỉnh bởi các sắc tố nhận ánh sáng: chất phytochrom và các chất khác. 15 Không khí: Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi cấy in vitro bao gồm oxy, carbon dioxide và ethylene. Các nhà trồng cây thương mại không nỗ lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên tất cả sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí được ở một vài mức độ khác nhau, thường có sự thúc đẩy tăng trưởng qua lỗ không khí bị đóng kín hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí (Hartmann và ctv, 1997). 1.4. Các nghiên cứu vi nhân giống về họ tre trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1. Vi nhân giống họ tre trên thế giới Trong khi một loạt các phương pháp có thể sử dụng để nhân giống tre, hầu hết các phương pháp chủ yếu là hạn chế với các loài cụ thể và điều kiện địa phương (vi dụ như về nguồn hạt giống). Nói chung thì không thể áp dụng được phương pháp này. Ngoài ra để phổ biến giống với quy mô lớn (> 500.000 cây/1 năm) kĩ thuật cổ điển chủ yếu là không đủ và không hiệu quả. Hầu hết các kĩ thuật cổ điển nhân giống vô tính chỉ hữu ích cho việc sản xuất trên quy mô nhỏ hơn (lên đến 100.000 cây/1 măm) mặc dù tối ưu hóa hoặc các kĩ thuật như nhân giống phổ biến vi mô (Adarsh Kumar, 1991) 6 có thể cho năng suất sản xuất cao hơn nhiều khi phụ thuộc vào sự sẵn có của cây mẹ. Nhân giống quy mô lớn (từ 10.000 và 500.000 cây mỗi năm) đòi hỏi kĩ thuật cao và rất nhiều cây mẹ. Cho nên nuôi cấy mô nhân giống quy mô lớn (> 500.000 cây mỗi năm) là phương pháp duy nhất khả thi. Do vậy, vật liệu khởi đầu đóng vai trò quan trọng đối với vi nhân giống (Gielis, 1998. Subramaniam, 1994) 16, 35. Kể từ 4 thập kỉ qua, nhiều nhà khoa học và các công ty trên thế giới đã thực hiện nghiên cứu để phát triển công nghệ vi nhân giống hiệu quả cho tre nhiệt đới và ôn đới. 16 Đầu tiên bài báo về nuôi cấy mô tre là sự nảy mầm của hạt giống trong ống nghiệm (Alexander và Rao, 1968) 7. Trong bài báo cổ điển của Vasil về việc sử dụng 2,4-D trong khởi phát phôi soma, đầu thập niên 80 của thế kỷ 20 vi nhân giống đã thành công dựa trên phôi soma của tre nhiệt đới từ hạt của cây Dendrocalamus strrictus và Bambusa bambos (Metha et al., 1982) 24. Đối với những loài tương tự cũng trồng bằng nách nhánh đã thành công (Nadgir et al.,1984) 29. Trong đó nhóm thập kỷ đã sản xuất tre thông qua nách nhánh, sinh cơ quan hoặc các phôi, từ chi như Bambusa, Phyllostachys và Sasa kết quả đã được đăng trong hàng loạt 5 bài báo cổ điển của Huang và đồng nghiệp, Guadua angustifolia (Manzur, 1988) 25, Bambusa beecheyana và Bambusa oldhamii (Yeh và Chang, 1986) 37, 38. Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào phôi soma cây tre nhiệt đới (INBAR, 1991) 20. Một thống kê (BIC, 1994) cho thấy rằng ít nhất 21 phòng thí nghiệm ở Đông Nam Á đã tham gia vào nuôi cấy mô tre, chủ yếu là ở Ấn Độ. Còn các nước khác như Singapore (Dekkers và Rao, 1987) 12 và Thái Lan (Prutpongse và Gavinlertvatana, 1992) 30, nghiên cứu nuôi cấy mô tre rất tích cực. Ở châu Âu và châu Mỹ nhiều nghiên cứu và phòng thí nghiệm thương mại đã cố gắng phát triển các công thức vi nhân giống bằng cành tre. Trong nuôi cấy mô thời gian gần đây là không chỉ được sử dụng để nhân giống tre, những nghiên cứu cũng bao gồm nuôi cấy tế bào, lựa chọn mô sẹo chịu mặn và cảm ứng ra hoa. Đặc biệt nuôi cấy mô hoa của tre mở ra hướng nghiên cứu hớp dẫn vì nó mở đường, ít nhất là về mặt lí thuyết cho lai tre (Gielis, 1999; Nadgauda et al, 1990) 17, 27. Bây giờ ít nhất có 130 bài viết về vi nhân giống tre đã được xuất bản, bài viết gốc cũng như đánh giá và một số trong đó nuôi cấy mô được mô tả trong một khía cạnh tổng quát hơn (Compendium của nghiên cứu trên tre, 1970-2003, Fernandez và Goelis, 2003) 14. Đánh giá khác về nuôi 17 cấy mô tre có thể tìm thấy trong Gielis, 1999; INBAR, 1991; Nadgauda et al., 1997; Saxena và Dhawan, 1994 và Zamora năm 1994; năm 2001) 17, 20, 28, 34, 39, 40. Ít nhất có 50 bài viết có chi tiết rất cụ thể về phương pháp phát triển. Các tài liệu tham khảo có thể tìm thấy trong danh sách tham khảo, đó là danh sách đầy đủ nhất về nuôi cấy mô tre ngày nay. Khi xem xét những dữ liệu này một số xu hướng được quan sát liên quan đến thương mại nhân giống: 1. Mục tiêu chính đã đạt được trên tre nhiệt đới của các chi Bambusa và Dendrocalamus. Các loài nguyên liệu là Bambusa bambos (trong hầu hết các bài viết như B. arundinaceae), B. balcooa, B. oldhamii, B. ventricosa, B. vulgaris, B.tulda, Dendrocalamus asper, D. giganteus, D. hamiltonii, D. latiflorus, D. longispathus, D.membranaceus và D. strictus, với Bambusa bambos và Dendrocalamus strictus đều thích hợp. 2. Các loài khác như Guadua angustifolia (Manzur, 1989) 25. đã được thử nghiệm, nhưng các chi tre quan trọng như Gigantochloa, Schizostachyum, Melocanma, hoặc tre châu Phi là các đối tượng đã không được nghiên cứu thành công. Chỉ có ba nhóm tập trung vào tre ôn đới và tre bán khỏe mạnh, với Thamnocalamus spathiflorus (Bag et al., 2000); Phyllostachys aurea (Huang và Huang, 1989) và Sasa pygmaea (Pleioblastus pygmaeus; Huang và Huang, 1989; Watanabe và cộng sự, 2000) 8, 18, 19, 36. Ngoài ra, nghiên cứu đã tập trung vào chỉ một hoặc hai loài. Rất ít nhóm có tập trung vào nhiều hơn một loài. Chỉ có một bài viết đề cập đến một phạm vi rộng lớn của các loài thử nghiệm (Prutpongse và Gavinlertvatana, 1992) 30. 3. Rất ít các công thức có được đủ thành công để chuyển sang thương mại. Phương án sản xuất, đặc biệt là đối với nách nhánh. Vấn đề có thể 18 là dễ. Chỉ trong trường hợp Dendrocalamus asper nhân giống thông qua nách nhánh đã rất thành công. 4. Phôi soma đã thành công ở một số các chi loài, chủ yếu là bắt đầu từ hạt giống. Ít nhiều thành công đã đạt được trong gây phôi soma ở tre trưởng thành. Tuy nhiên trong một số trường hợp, phôi soma cũng liên quan đến cảm ứng ra hoa (Lin và Chang, 2003; Rao và Raghav, 2002) 21, 31, một hiện tượng không mong muốn trong sản xuất. Khi xem xét tất cả các dữ liệu này, kết luận là ở mức độ nghiên cứu, nhiều công việc phải làm hơn nữa để phát triển phương pháp nhân giống tốt, sử dụng nuôi cấy mô. Trong cuối năm vừa qua, qua tìm hiểu thông tin cho thấy số lượng các bài báo nuôi cấy mô tre đăng trên tạp chí quốc tế cũng đã tăng lên đáng kể. Sau đây là một số quy trình nghiên cứu về tre đã được công bố từ năm 1991 cho đến năm 2004: 1. Bambusa balcooa callus thu được từ Luồng trưởng thành nuôi trên môi trường 1/2 MS + saccarose (6%) + BAP (4.10-6 M) + Kn (1.10-5 M) nảy mầm sau 3-4 tuần đạt nhiều chồi từ 4-15 (trung bình 6) Roohi et al. (1991) 32. 2. Bambusa bambos bề mặt tuyệt trùng nuôi cấy trên môi trường MS + BAP (8.10-6M – 10-5M); pH=5.5 chiếu sáng liên tục và ở nhiệt độ 250C nảy mầm sau 1 tuần nuôi cấy, cho 30 chồi sau 8-10 tuần nuôi cấy Rao và Raghav (2002) 31. 3. Bambusa tulda nách nhánh vô trùng nuôi trên môi trường chất lỏng (vô trùng) 1/2MS + BAP (8.10-6M) + Kn (4.10-6M) + saccarose (2%), cho 4-5 chồi sau 3 tuần nuôi cấy Saxena & Bhojwani (1993) 33. 1.4.2. Vi nhân giống họ tre ở Việt Nam Tại Việt Nam tính đến nay mới có Công Ty cổ phần Công nghệ sinh học Rừng Hoa ở Đà Lạt thông báo đã nhân giống thành công với cây tre bằng phương pháp in vitro. 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 7/2014 đến tháng 4/2015 tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2. 2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Cây Lùng (Bambusa sp.), họ Tre – Bambusoideae được thu ở Nghệ An do Công ty TNHH Đức Phong Nghệ An cung cấp, gồm củ măng non, ngọn măng non, cành bánh tẻ chứa mắt ngủ, đốt thân bánh tẻ. 2.2.2. Trang thiết bị và dung cụ 2.2.2.1. Thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Cân kĩ thuật GM612, Đức Tủ lạnh sâu FRIGO Máy đo Ph HM30G/TOA, Đức Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAYAMA, Nhật Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan Máy cất nước hai lần Trung Quốc Buồng cấy vô trùng AV – 110/TELSTAR Máy khuấy từ gia nhiệt ARE/VELP, Italia Cân phân tích CP224S, Đức Tủ ấm UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức 2.2.2.2. Dụng cụ Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, nút bông, giấy thấm, đèn cồn, vỉ xốp nuôi cấy,… 20 2.3. Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) 20: MS + 30g/l đường saccarose + 7,5g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng. pH môi trường: 5,8. Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1170C trong 15 phút. 2.4. Điều kiện nuôi cấy Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo: - Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 2000 lux. - Quang kì: 12 giờ sáng / 12 giờ tối. - Nhiệt độ phòng: 250C – 270C. - Độ ẩm trung bình: 70% - 74%. - Mẫu được để trên máy lắc (150 – 200 vòng/ 1 phút) và trên giàn nuôi cấy. 21 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Bố trí thí nghiệm Thí nhiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, 30 mẫu / công thức. 2.5.2. Phương pháp nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu Sơ đồ nghiên cứu: Nhận mẫu cây Lùng Phân loại Xử lý sơ bộ mẫu Lùng Hiệu quả khử trùng đến mẫu cây Lùng (Cefotaxim, cồn I ốt, Javen) Đánh giá sinh trưởng mẫu Lùng in vitro (Nuôi cấy mẫu trên môi trường MS cơ bản, theo dõi chỉ tiêu sau 25 ngày nuôi cấy mẫu) Quy trình tạo mẫu Lùng in vitro Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tạo vật liệu in vitro ở cây Lùng 22 2.5.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu khởi đầu Tạo vật liệu khởi đầu theo công thức ở bảng sau: Bảng 2.1. Các công thức tạo vật liệu khởi đầu Công thức ĐC CT1 Loại nguyên liệu Củ măng non Phương pháp khử trùng Xử lý sơ bộ Xử lý sơ bộ, lau bằng Etanol, bóc bỏ bẹ, cắt và cấy lên môi trường MS CT2 Ngọn non Xử lý sơ bộ, lau bằng Etanol, bóc lớp, cắt và cấy lên môi trường MS CT3 Ngọn non Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 1% (v/v)/2 phút CT4 Ngọn non Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 1% (v/v)/3 phút CT5 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 2% (v/v)/10 phút CT6 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 2% (v/v)/20 phút CT7 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 2% (v/v)/30 phút CT8 Cành bánh tẻ Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 5% (v/v)/10 phút Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 5% (v/v)/20 phút Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 5% (v/v)/30 phút CT9 CT10 23 CT11 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 10% (v/v)10 phút CT12 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 10% (v/v)/20 phút CT13 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 10% (v/v)/30 phút CT14 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 15% (v/v)/10 phút CT15 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 15% (v/v)/20 phút CT16 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 15% (v/v)/30 phút CT17 Đốt thân bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 10% (v/v)/20 phút Mẫu cấy sau khi được khử trùng trong tủ cấy sẽ được cắt đều nhau dài khoảng 1 – 3 cm, thấm khô rồi cấy vào các bình tam giác chứa môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962). Đặt trên giàn nuôi cấy theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống sau 25 ngày cấy. Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ mẫu nhiễm (%):(Tổng số mẫu nhiễm / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - Tỷ lệ mẫu sống (%): (Tổng số mẫu sống / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - Tỷ lệ mẫu chết (%): (Tổng số mẫu chết / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - Quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro cây Lùng. 24 2.5.2.2. Thi nghiệm 2: Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi Sau khi tạo được vật liệu cây Lùng in vitro và nuôi cấy trong môi trường MS ở thí nghiệm, chúng tôi cấy sang môi trường ở bảng 2, để đánh giá khả năng tái sinh chồi cây Lùng (đánh giá sau 7 tuần nuôi cấy) theo các công thức nghiên cứu sau: Bảng 2.2. Công thức nghiên cứu tạo cụm chồi mẫu cành và đốt thân cây Lùng Công thức Thành phần môi trường CT1 1/2MS (Đối chứng) CT2 1/2 MS + 1,0 mg/l BAP + ND 10% (môi trường đặc) CT3 1/2 MS + 1,0 mg/l BAP + ND 10% (môi trường lỏng) CT4 1/2 MS + 2,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l Kn (môi trường đặc) Chỉ tiêu theo dõi: - Hệ số nhân nhanh chồi = Tổng chồi tạo thành / Tổng chồi đưa vào - Chiều cao chồi (cm) - Số lá / chồi 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu Đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy ngoài tự nhiên vào điều kiện nuôi cấy in vitro. Đối với mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải xác định phương thức khử trùng khác nhau cho thích hợp. Có loại chỉ cần bóc sạch các lớp bên ngoài để lấy đỉnh sinh trưởng và rửa lại bằng cồn 700 (như mía, gừng...), có loại phải sử dụng hoá chất khác nhau như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2,… với nồng độ và thời gian thích hợp. Cây Lùng vì là cây thuộc họ tre được lớp bẹ bảo vệ nên khá sạch và dễ khử trùng. Để có vật liệu cây Lùng vô trùng chỉ cần bóc sạch lớp bẹ và rửa lại bằng cồn 700 đối với củ măng non và ngọn măng non. Đối với cành, đốt thân cần sử lý bằng Javen nồng độ 1% - 15% trong thời gian 2 - 30 phút. Giai đoạn này cần đạt các tiêu chuẩn: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại phân hoá và sinh trưởng tốt. Do đó, việc xác định phương thức khử trùng có ý nghĩa quyết định đối với sự thành công ban đầu và cả quá trình nhân giống tiếp theo. Đề tài đã sử dụng nguồn mô ban đầu để tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm là: củ măng non, ngọn măng non, đốt thân bánh tẻ chứa mắt ngủ, cành bánh tẻ chứa mắt ngủ của giống Lùng. Tỷ lệ mẫu sống sạch khuẩn, nấm trong ống nghiệm là chỉ tiêu đánh giá kết quả khử trùng mẫu. Sau hai tuần theo dõi kết quả được trình bày trong bảng sau: 26 Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu giống cây Lùng Công thức Tỷ lệ mẫu Mẫu sạch nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) ĐC 100 0 0 CT1 38,89 0 61,11 CT2 100 0 0 CT3 100 0 0 CT4 100 0 0 CT5 100 0 0 CT6 100 0 0 CT7 100 0 0 CT8 94,45 3,33 2,22 CT9 87,78 8,89 3,33 CT10 83,34 12,22 4,44 CT11 76,66 17,78 5,56 CT12 52,23 41,1 6,67 CT13 70,0 22,22 7,78 CT14 72,22 18,89 8,89 CT15 73,33 16,67 10,0 CT16 76,67 12,22 11,11 CT17 64,44 32,22 7,78 27 Tỷ lệ mẫu sống (%) 45 41,1 40 35 32,22 30 25 22,22 18,89 17,78 20 15 16,67 12,22 12,22 8,89 10 3,33 5 0 0 0 0 0 0 0 0 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 0 ĐC CT 8 CT 9 CT 10 CT 11 CT 12 CT 13 Hình 3.1. Sơ đồ thể hiện tỷ lệ mẫu sống của cây Lùng 28 CT 14 CT 15 CT 16 CT 17 Kết quả cho thấy, mẫu khử trùng ở các công thức ĐC (xử lý sơ bộ), CT1 (lau bằng etanol), các mẫu củ đều bị chết trong vòng 5 ngày nuôi cấy. Đối với ngọn măng non CT2 (lau bằng etanol) tỉ lệ mẫu sạch cao nhưng đều chết sau 2 tuần nuôi cấy. Khi khử trùng ngọn măng non với Javel ở nồng độ 1% (CT3 và CT4), các mẫu đều chết trong vòng 5 ngày nuôi cấy. Đối với cành bánh tẻ khử trùng với Javel ở nồng độ 2% (CT5 đến CT7), các mẫu cũng đều chết trong vòng 5 ngày nuôi cây. Các công thức từ CT8 đến CT16 cho thấy Javen có tác dụng khử trùng mẫu in vitro. Tuy nhiên có sự khác nhau về hiệu quả, có thể xếp thành 3 nhóm: tác dụng khử trùng tốt nhất ở công thức CT12 (đạt 41,1%), tiếp theo là CT13, CT14, CT11, CT15 và tác động thấp là CT8, CT9, CT10, CT16. Đối với mẫu thân bánh tẻ khử trùng với Javen 10% ở công thức CT17 có tỷ lệ mẫu sống cũng khá cao (đạt 32,22%). Kết quả này cho thấy ở cành bánh tẻ, khi sử dụng nồng độ Javen thấp thì hiệu quả khử trùng không rõ rệt (công thức CT8), nhưng nếu tăng về thời gian hiệu quả khử trùng có thể tăng lên (CT9, CT10). Sự gia tăng về nồng độ Javen sử dụng cũng đưa lại hiệu quả tạo mẫu sạch, nhưng mang lại tác dụng phụ đó là tỉ lệ mẫu sạch nhưng không thể sống được trong môi trường in vitro cũng tăng lên. Có thể do Javen nồng độ cao thì ngoài tác dụng diệt vi khuẩn, bào tử nấm còn gây phá hủy các tế bào làm cho cây không thể sinh trưởng được và bị chết do các tế bào bị tổn thương nghiêm trọng. 29 Hình 3.2. Mẫu cành vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) Hình 3.3. Mẫu cành vô trùng sống phát sinh chồi Hình 3.4. Mẫu thân vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) Hình 3.5. Mẫu thân vô trùng (mẫu sống) 30 Từ kết quả này chúng tôi đưa ra sơ đồ quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro từ cành bánh tẻ có chứa mắt ngủ của cây Lùng ở hình 3.6 và tương tự đối với mẫu đốt thân. Bước 1. Thu mẫu cây Lùng (mẫu cành chứa mắt ngủ) Bước 2. Thu cành chứa mắt ngủ trong phòng thí nghiệm (1015cm) Bước 3. Rửa sạch cành chứa mắt ngủ dưới vòi nước sạch với xà phòng Bước 4. Xử lý bằng cồn 70% -1 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 3-4 lần, lắc trong Javen 10% - 20 phút, rửa lại 3-4 lần nước cất Bước 5. Thấm khô mẫu trên giấy lọc khô đã khử trùng Bước 6. Nuôi cấy trên môi trường MS vô trùng Hình 3.6. Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ cành có chứa mắt ngủ của cây Lùng 31 3.2. Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi và đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng Việc nhân chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lượng lớn cây con in vitro làm nguyên liệu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Đây là quá trình quan trọng và cũng có thể nói đây là nhiệm vụ của nhân giống vô tính. Ở giai đoạn này chúng tôi sử dụng môi trường 1/2MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP 1,0 mg/l BAP kết hợp với nước dừa 10% ở môi trường đặc và lỏng, BAP 2,5 mg/1BAP và 1,0 mg/l Kn môi trường đặc, nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh, tạo ra số chồi nhiều, có chất lượng tốt trong thời gian nuôi cấy ngắn nhất. 3.2.1. Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi từ cành Kết quả vi nhân giống từ cành được thể hiện ở bảng sau: Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, nước dừa, Kinetin đến hệ số nhân chồi, số lá, chiều dài mẫu cành cây Lùng Chồi/ bình Công Chiều dài Hệ số chồi (cm) nhân chồi 0–1 1–2 1,00 10,0 3–5 4–6 3,33 3 6,0 2–3 3–4 2,00 3 4,0 1–2 2–3 1,33 Ban đầu Sau 7 tuần CT1 3 3,0 CT2 3 CT3 CT4 thức 32 Số lá 3,33 3.5 Hệ số nhân chồi 3 2.5 2,0 2 1.5 1,33 1,0 1 0.5 0 CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.7. Sơ đồ ảnh hưởng của BAP, nước dừa và Kinetin đến hệ số nhân nhanh chồi mẫu cành cây Lùng Kết quả ở bảng trên cho thấy: Mẫu cành cây giống khi đưa vào môi trường nuôi cấy ở môi trường dinh dưỡng 1/2MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng, không tạo chồi mới mà chỉ tiếp tục phát triển. Ta thấy tỉ lệ tạo chồi lớn nhất ở môi trường 1/2MS + 1,0 mg/1BAP + 10% ND (đặc) đạt 3,33 sau 7 tuần, sau đó đến môi trường 1/2MS + 1.0 mg/1BAP + 10% ND (lỏng), 1/2MS + 2,5 mg/1BAP + 1,0 mg/1Kn (đặc). Qua bảng 3.2 ta cũng thấy chiều cao chồi mới, số lá cũng có sự khác nhau ở các môi trường khác nhau. Chiều cao chồi và số lá lớn nhất ở môi trường 1/2MS +1,0 mg/1BAP + 10% ND (đặc) đạt tử 4 đến 6 cm (chồi), 3 đến 5 lá, sau đó đến môi trường 1/2MS + 1,0 mg/1BAP + 10% ND (lỏng), 1/2 MS + 2,5 mg/1BAP + 1,0 mg/l Kn (đặc) có chiều cao chồi và số lá gần bằng nhau. Vậy môi trường 1/2MS + 1,0 mg/1BAP + 10% ND (đặc) là môi trường thích hợp nhất cho việc nhân nhanh mẫu cành cây Lùng. 33 Hình 3.8. Mẫu cành sau 2 tuần nuôi cấy Hình 3.9. Mẫu cành sau 3 tuần nuôi cấy Hình 3.10. Mẫu cành sau 5 tuần nuôi cấy Hình 3.11. Chồi mới tạo ra chết 34 3.2.2. Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi từ đốt thân Kết quả vi nhân giống đốt thân được thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, nước dừa, Kinetin đến hệ số nhân chồi, số lá, chiều dài mẫu đốt thân cây Lùng Chồi/ bình Công Ban đầu Sau 7 tuần Số lá thức Chiều dài Hệ số chồi (cm) nhân chồi CT1 3 3,0 0–1 1–2 1,00 CT2 3 11,0 2–3 4–5 3,67 CT3 3 22,0 4–5 7–8 6,67 CT4 3 9,0 1–2 3–4 3,00 7 6,67 Hệ số nhân chồi 6 5 3,67 4 3,0 3 2 1,0 1 0 CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.12. Sơ đồ ảnh hưởng của BAP, nước dừa và Kinetin đến hệ số nhân nhanh chồi mẫu đốt thân cây Lùng 35 Kết quả ở bảng trên cũng cho thấy: Mẫu đốt thân cây giống khi đưa vào môi trường nuôi cấy ở môi trường dinh dưỡng 1/2MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng, không tạo chồi mới mà chỉ tiếp tục phát triển. Đối với mẫu đốt thân ta thấy tỉ lệ tạo chồi lớn nhất ở môi trường 1/2MS + 1,0 mg/1BAP + 10% ND (lỏng) đạt 6,67 sau 7 tuần, sau đó đến môi trường 1/2MS + 1,0 mg/1BAP + 10% ND (đặc), 1/2MS + 2,5 mg/1BAP + 1,0 mg/l Kn (đặc). Qua bảng 3.3 ta cũng thấy chiều cao chồi mới, số lá cũng có sự khác nhau ở các môi trường khác nhau. Chiều cao chồi và số lá lớn nhất ở môi trường 1/2MS +1,0 mg /1BAP + 10% ND (lỏng) đạt 7 đến 8 cm (chồi), 4 đến 5 lá, sau đó đến môi trường 1/2MS + 1,0 mg/1BAP + 10% ND (đặc), 1/2 MS + 2,5 mg/1BAP + 1,0 mg/l Kn (đặc) có chiều cao chồi và số lá gần bằng nhau. Vậy môi trường 1/2MS + 1,0 mg/1BAP + 10% ND (lỏng) là môi trường thích hợp nhất cho việc nhân nhanh chồi mẫu đốt thân cây Lùng. 36 Hình 3.13. Mẫu đốt thân sau 2 tuần nuôi cấy Hình 3.14. Mẫu đốt thân sau 3 tuần nuôi cấy Hình 3.15. Mẫu đốt thân sau 5 tuần nuôi cấy Hình 3.16. Mẫu đốt thân sau 7 tuần nuôi cấy 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua những thí nghiệm đã thực hiện chúng tôi đã rút ra được những kết luận sau về việc nhân giống in vitro cây Lùng:  Bước đầu nhân thành công cây Lùng (Bambusa sp.) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.  Tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Lùng xử lý từ mẫu cành, đốt thân, lau cồn 90%, rửa mẫu bằng cồn 70%/1 phút, lắc mẫu trong Javen 10%/20 phút, rửa lại bằng nước cất 3-4 lần, làm khô cho hiệu quả mẫu sống đối với mẫu cành đạt 41,1%, mẫu đốt mẫu thân đạt 32,22%.  Tạo cụm chồi giống cây Lùng Nghệ An từ cành bánh tẻ thích hợp trên môi trường 1/2MS + 10 g/l saccarose + 1,0 mg /1 BAP + 10% ND (đặc) đạt hệ số nhân chồi là 3,33 và đối với đốt thân thích hợp trên môi trường 1/2MS + 10 g/l saccarose + 1,0 mg /1 BAP + 10% ND (lỏng) với hệ số nhân chồi là 6,67.  Với cường độ ánh sáng là (2000 lux) sử dụng trên máy lắc 3 ngày thay môi trường 1 lần thích hợp nuôi cấy mẫu đốt thân cây Lùng in vitro, đối với mẫu cành là sử dụng trên giàn nuôi cấy, phần lớn các chồi đều mập, xanh, phát triển tốt, cây không bị biến dị. Kiến nghị  Tiếp tục nghiên cứu nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau để thích hợp cho việc nhân nhanh chồi và ra rễ của cây Lùng.  Xây dựng quy trình hoàn chỉnh nhân giống in vitro cây Lùng. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, (Giáo trình cao học nông nghiệp), Nxb Nông nghiệp Hà Nội. 2. Dương Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô thực vật II, Nxb Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 3. Trần Văn Minh (1995), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Giáo trình Đại học, Viện Đại học mở bán công TP. Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học Nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 5. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giáo dục. Tài liệu tiếng Anh 6. Adaresh Kumar (1991) Mass production of field planting stock Dendrocalamus strictus through macroproliferation – a technology. Indian Forester 177, 1046-4052. 7. Alexander, M. P., Rao, T. C (1968) “In vitro culture of bamboo embryo”. Current Science 37, 415. 8. Bag-N; Suman-Chandra; Palni-LMS; Nandi-SK; Bag-N; Chandra-S (2000) “Micropropagation of dev-ringal (Thamnocalamus spathiflorus (Trin) Munro) – a temperate bamboo, and comparison between in vitro propagated plants and seedlings”. Plant-Science 2, 125-135. 9. Banik, R. L. (1987). “Techniques of bamboo propagation with special reference to prerooted and prerhizomed branch cuttings and tissue 39 culture”. In: A. N. Rao, Dhamarjan and C. B. Sastry (eds.) Recent Research on Bamboos, CAF/IDRC: 160-169. 10. Chambers,-SM; Heuch,-JHR; Pirrie,-A (1991) “Micropropagation and in vitro flowering of the bamboo Dendrocalamus hamiltonii Munro”. Plant-Cell,-Tissue-and-Organ-Culture 27: 1, 45-48. 11. Chang,-W,-C.; Lan,-T.-H. (1995) “Somatic embryogenesis and plant regeneration and plant regeneration trom roots of bamboo (Bambusa beecheyana Munro var. beecheyana)”. Journal-of-plant-physiology 145 (4) p. 535-538. 12. Dekkers,-AJ; Rao,-AN (1989) “Tissue culture of four bamboo genera”. Proceedings of the Seminar on Tissue Culture of Forest Species, Kuala Lumpur, 15-18 June 1987, Eds: Rao,-AN & Yusoff,-AM, 83-90. 13. Dekkers, A., J., A. N. Rao and C. S. Loh. (1985) “In vitro callus in bamboos Schizostachyum and Thyrsostachys species”. In: Recent Recent Research on Bamboo. CAF/IDRC; 170-174. 14. Fernandez E., Gielis J., Editors, (2003) Compendium of research on bamboo 1970-2003. Bamboo Thematic Network, Rijkevorsel, 2003. 15. Gamborg, L.; Murashige, T.; Thorpe T.A.; Vasil I.K.; (1968), Plant Tissue Culture Media In vitro, 12: 473 - 478. 16. Gielis, J., Oprin, J., (1998) “Biotechnological approaches to germplasm improvement in woody bamboos”. In. EI Bassam, N., et al. (Eds) Sustainable agriculture for food, industry and energy. James and James, London. 17. Gielis J. (1999) “Strategic role of biotechnology in germplasm improvement of bamboo”. In: Raychaudhuri S.P., Maramorosch K. (Eds.) Biotechnology and Plant Protection in Forestry Science. Science Publishers, Inc., Enfield, NH, USA, 13-38. 40 18. Huang,-LC; Chen,-WL; Huang,-BL; (1989) “Tissue culture investigations of bamboo: III. A method for viable protoplast isolation from Bambusa cells of liquid suspension culture”. Botanical-Bulletinof-Academia-Sinica 30 (1): 49-58. 19. Huang, L.C., Huang, B.L., Chen, W.L., (1989) “Tissue culture investigations of bamboo V- Organogenesis leading to adventitious shoots and plants excised from shoot apices”. Environmental and Experimental Botany 29 (3), 307-315. 20. INBAR, (1991), Rao, I.V. Ramanuja, Yusoff, A.M., Rao, A.N., Sastry, C.B (Eds.) Propagation of bamboo and rattan through tissue culture, INBAR (Delhi. IDRC, 1991), 60 PP. 21. Lin,-CS; Chang, WC (2003) “In vito flowering of Bambusa edulis and subsequent plantlet survival”. Plant Cell Tissue and Organ Culture 72: (1) 71-78. 22. Lin, C. -S., Lin, C. -C. & Chang, W. -C. (2004) “Effect of thidiazuron on vegetative tissue-derived somatic embryogenesis and flowering of bamboo Bambusa edulis”. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 76, 75-82. CrossRef. 23. Linsmainer, E.M. and Skoog, F. (1965), "Organic growth factor requirements of tobacco tissue culture", Physiol. Plant, 18: 100 - 127. 24. Mehte, U. Ramanuja Rao, I.V. and H.Y. Mohan Ram (1982) “Somatic embryogenesis in bamboo. In A. Fujiwara, (Editor)”, Plant Tissue Culture 1982, Jpn. Assoc. Plant Tissue Cult., Tokyo. 109-110. 25. Manzur, D. (1989) Propagacion vegetative de Guadua angustifolia Kunth. Agronomia 2(3), 14-19. 26. Murashige T. and Skoog F. (1962), “A revised medium for rupid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol. Plant 15: 473 – 479. 41 27. Nadgauda,-RS; Parasharami,-VA; Mascarenhas,-AF (1990) “Precocious flowering and seeding behavior in tissue-cultured bamboos”. Nature 344: 6264, 335-336. 28. Nadgauda, R.S., John, C.K., Joshi, M.S., Parasharami, V.A., Mascarenhas, A.F., (1997) “Application of in vitro techniques for bamboo improvement”. In: Chapman, G (Ed) The Bamboos (Academic Press), 163-177. 29. Nadgir, A.L., Phadke, C.H., Gupta, P.K., Parsharam, V.A., Nair, S., Mascarenhas, A., (1984) “Rapid multiplication of bamboo by tissue culture”. Silvae Genet. 33, 219-223. 30. Prutpongse, P., Gavinlertvatana, P., (1992) “In vitro micropropagation of 54 species from 15 genera of bamboos”. HortScience 27, 453-454. 31. Rao,-IU; Raghav,-R (2002) “Control of in vitro flowering in Bambusa bambos from multiple shoots and somatic embryos Bamboo for Sustainable Development”, Proceedings of the Vth International Bamboo Congress and the VIth International Bamboo Workshop, San Joser, Costa. 32. Roohi,-FN; Shamsi,-FQ; Rao,-IVR;-IU (1991) Clonal propagation of mature Bambusa balcooa in vitro. Presented at the IVth International Bamboo Workshop, Chiangmai, Thailand, 27-30 November 1991. 33. Saxena S; Bhojwani S.S. (1993) “In vitro clonal multiplication of 4year-old plants of the bamboo, Dendrocalamus longispathus Kurz”. In vitro Cellular & Developmental Biology 29P (3): 135-142. 34. Saxena, S. and V. Dhawan. 1994. “Micropropagation research in South Asia”. In: Constraints to Production of Bamboo and Rattan. INBAR Technical. 5. 245: 101-114. 35. Subramanlam, K.N., (1994) Bamboos – Demand and supply of planting stock. INBAR Newslett N05, 24-25. 42 36. Watanabe et al. (2000) “A new micropropagation system for Pleioblastus pygmaeus Nakai. In Bamboo”. Proceedings of the International Symposium by the Royal Project Foundation. Chiang Mai, Thailand, August 2000, 94-101. 37. Yeh ML, Chang WC (1986) “Plant regeneration through somatic embryogenesis in callus culture of green bamboo (Bambusa oldhamii Munro)”. Theoretical and Applied Genetics 73 (2): 161-163. 38. Yeh ML, Chang WC (1986) “Somatic embryogenesis and subsequentplant regeneration from inflorescence callus of Bambusa beecheyana Munro var beecheyana”. Plant Cell Reports 5: 409-411. 39. Zamora, A.B. (1994) “Review of micropropagation research on bamboos. Constraints to production of bamboo and rattan”. INBAR Technical Report 5 (Delhi), 4540. Zamora A.B. (2001) “Micropropation of Bamboo”. Training Manual. INBAR Technical Report No27. Tài liệu từ Internet 41. http: //dalat-info. vn/. . . 25084. gpside. 1. san-xuat-tre-giong-bangphuong-phap-in-vitro-mo-. . . 42. http://www.ngheandost.gov.vn/JournalDetail/ar1331_Giai_phap_bao_ ve_va_phat_trien_rung_lung_o_Nghe_An.aspx 43. http://baonghean.vn/mien-tay-nghe-an/201211/quy-chau-cay-lungkeu-cuu--358190/ 43 PHỤ LỤC Một số hình ảnh minh họa khi làm thí nghiệm Hình a: Thao tác trong box cấy vô trùng Hình b: Kiểm tra mẫu nuôi cấy trong phòng cây tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 44 Hình c: Các chỉ tiêu theo dõi qua các tuần phát triển của mẫu cây Lùng 45 [...]... nghiên cứu đề tài Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in vitro 2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cứu Tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp vi nhân giống in vitro 2 2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu - Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi - Nghiên... giản tạo vật liệu in vitro cây Lùng 24 2.5.2.2 Thi nghiệm 2: Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng phương pháp tạo cụm chồi Sau khi tạo được vật liệu cây Lùng in vitro và nuôi cấy trong môi trường MS ở thí nghiệm, chúng tôi cấy sang môi trường ở bảng 2, để đánh giá khả năng tái sinh chồi cây Lùng (đánh giá sau 7 tuần nuôi cấy) theo các công thức nghiên cứu sau: Bảng 2.2 Công thức nghiên cứu tạo. .. Nhận mẫu cây Lùng Phân loại Xử lý sơ bộ mẫu Lùng Hiệu quả khử trùng đến mẫu cây Lùng (Cefotaxim, cồn I ốt, Javen) Đánh giá sinh trưởng mẫu Lùng in vitro (Nuôi cấy mẫu trên môi trường MS cơ bản, theo dõi chỉ tiêu sau 25 ngày nuôi cấy mẫu) Quy trình tạo mẫu Lùng in vitro Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tạo vật liệu in vitro ở cây Lùng 22 2.5.2.1 Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu khởi đầu Tạo vật liệu khởi đầu theo... kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus - Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống, nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen 1.2.4 Các giai đoạn vi nhân giống (nhân giống in vitro) Vi nhân giống (Micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro (in vitro propagation) là phương pháp ứng dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu từ nhiều... giống mới vào sản xuất đại trà 6 Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt Thí dụ: Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này Đặc biệt, cây Cọ dầu thường phải mất 10 – 15 năm mới cho thu hoạch, vi c chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới... trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liêu cho công tác chọn giống - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo 7 - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ - Nhân nhanh... mô tế bào thực vật được xem là giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung Trên môi trường nhân tạo, từ các hoocmon các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau 1.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2.1 Tính... một giống mới rất khó khăn Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500.000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm 1.2.3.2 Nhược điểm Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác Ngoài ra, phương pháp này còn có những nhược... dụng có hiệu quả nguồn nguyên liệu, vật liệu trong nước và xuất khẩu Đáp ứng nhu cầu về giống cây Tre nói chung và cụ thể là cây Lùng nói riêng Một hướng nghiên cứu mới đã và đang được quan tâm đó là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn giống đồng nhất, năng suất cao Vi c tạo ra cây Lùng ổn định và đồng nhất là vấn đề cần thiết để phục vụ cho nhu cầu trồng trọt và nghiên cứu khai thác, sử... thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toán năng của tế bào thực vật 1.2.3 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 1.2.3.1 Ưu điểm Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà các phương pháp khác thường gặp, sau đây là những ưu điểm chính: - Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng và phát