3. Ý nghĩa của đề tài
1.4. Các nghiên cứu vi nhân giống về họ tre trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Vi nhân giống họ tre trên thế giới
Trong khi một loạt các phương pháp có thể sử dụng để nhân giống tre, hầu hết các phương pháp chủ yếu là hạn chế với các loài cụ thể và điều kiện địa phương (vi dụ như về nguồn hạt giống). Nói chung thì không thể áp dụng được phương pháp này.
Ngoài ra để phổ biến giống với quy mô lớn (> 500.000 cây/1 năm) kĩ thuật cổ điển chủ yếu là không đủ và không hiệu quả.
Hầu hết các kĩ thuật cổ điển nhân giống vô tính chỉ hữu ích cho việc sản xuất trên quy mô nhỏ hơn (lên đến 100.000 cây/1 măm) mặc dù tối ưu hóa hoặc các kĩ thuật như nhân giống phổ biến vi mô (Adarsh Kumar, 1991) 6
có thể cho năng suất sản xuất cao hơn nhiều khi phụ thuộc vào sự sẵn có của cây mẹ. Nhân giống quy mô lớn (từ 10.000 và 500.000 cây mỗi năm) đòi hỏi kĩ thuật cao và rất nhiều cây mẹ. Cho nên nuôi cấy mô nhân giống quy mô lớn (> 500.000 cây mỗi năm) là phương pháp duy nhất khả thi. Do vậy, vật liệu khởi đầu đóng vai trò quan trọng đối với vi nhân giống (Gielis, 1998. Subramaniam, 1994) 16, 35.
Kể từ 4 thập kỉ qua, nhiều nhà khoa học và các công ty trên thế giới đã thực hiện nghiên cứu để phát triển công nghệ vi nhân giống hiệu quả cho tre nhiệt đới và ôn đới.
Đầu tiên bài báo về nuôi cấy mô tre là sự nảy mầm của hạt giống trong ống nghiệm (Alexander và Rao, 1968) 7. Trong bài báo cổ điển của Vasil về việc sử dụng 2,4-D trong khởi phát phôi soma, đầu thập niên 80 của thế kỷ 20 vi nhân giống đã thành công dựa trên phôi soma của tre nhiệt đới từ hạt của
cây Dendrocalamus strrictus và Bambusa bambos (Metha et al., 1982) 24. Đối với những loài tương tự cũng trồng bằng nách nhánh đã thành công (Nadgir et al.,1984) 29. Trong đó nhóm thập kỷ đã sản xuất tre thông qua
nách nhánh, sinh cơ quan hoặc các phôi, từ chi như Bambusa, Phyllostachys và Sasa kết quả đã được đăng trong hàng loạt 5 bài báo cổ điển của Huang và đồng nghiệp, Guadua angustifolia (Manzur, 1988) 25, Bambusa beecheyana và Bambusa oldhamii (Yeh và Chang, 1986) 37, 38. Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào phôi soma cây tre nhiệt đới (INBAR, 1991) 20. Một thống kê (BIC, 1994) cho thấy rằng ít nhất 21 phòng thí nghiệm ở Đông Nam Á đã tham gia vào nuôi cấy mô tre, chủ yếu là ở Ấn Độ. Còn các nước khác như Singapore (Dekkers và Rao, 1987) 12 và Thái Lan (Prutpongse và Gavinlertvatana, 1992) 30, nghiên cứu nuôi cấy mô tre rất tích cực. Ở châu Âu và châu Mỹ nhiều nghiên cứu và phòng thí nghiệm thương mại đã cố gắng phát triển các công thức vi nhân giống bằng cành tre. Trong nuôi cấy mô thời gian gần đây là không chỉ được sử dụng để nhân giống tre, những nghiên cứu cũng bao gồm nuôi cấy tế bào, lựa chọn mô sẹo chịu mặn và cảm ứng ra hoa. Đặc biệt nuôi cấy mô hoa của tre mở ra hướng nghiên cứu hớp dẫn vì nó mở đường, ít nhất là về mặt lí thuyết cho lai tre (Gielis, 1999; Nadgauda et al, 1990) 17, 27. Bây giờ ít nhất có 130 bài viết về vi nhân giống tre đã được xuất bản, bài viết gốc cũng như đánh giá và một số trong đó nuôi cấy mô được mô tả trong một khía cạnh tổng quát hơn (Compendium của nghiên cứu trên tre, 1970-2003, Fernandez và Goelis, 2003) 14. Đánh giá khác về nuôi
cấy mô tre có thể tìm thấy trong Gielis, 1999; INBAR, 1991; Nadgauda et al.,
1997; Saxena và Dhawan, 1994 và Zamora năm 1994; năm 2001) 17, 20,
28, 34, 39, 40.
Ít nhất có 50 bài viết có chi tiết rất cụ thể về phương pháp phát triển. Các tài liệu tham khảo có thể tìm thấy trong danh sách tham khảo, đó là danh sách đầy đủ nhất về nuôi cấy mô tre ngày nay. Khi xem xét những dữ liệu này một số xu hướng được quan sát liên quan đến thương mại nhân giống:
1. Mục tiêu chính đã đạt được trên tre nhiệt đới của các chi Bambusa và Dendrocalamus. Các loài nguyên liệu là Bambusa bambos (trong hầu hết các bài viết như B. arundinaceae), B. balcooa, B. oldhamii, B. ventricosa, B. vulgaris, B.tulda, Dendrocalamus asper, D. giganteus, D. hamiltonii, D. latiflorus, D. longispathus, D.membranaceus và D. strictus, với Bambusa bambos và Dendrocalamus strictus đều thích
hợp.
2. Các loài khác như Guadua angustifolia (Manzur, 1989) 25. đã được
thử nghiệm, nhưng các chi tre quan trọng như Gigantochloa, Schizostachyum, Melocanma, hoặc tre châu Phi là các đối tượng đã
không được nghiên cứu thành công. Chỉ có ba nhóm tập trung vào tre
ôn đới và tre bán khỏe mạnh, với Thamnocalamus spathiflorus (Bag et al., 2000); Phyllostachys aurea (Huang và Huang, 1989) và Sasa pygmaea (Pleioblastus pygmaeus; Huang và Huang, 1989; Watanabe
và cộng sự, 2000) 8, 18, 19, 36. Ngoài ra, nghiên cứu đã tập trung vào chỉ một hoặc hai loài. Rất ít nhóm có tập trung vào nhiều hơn một loài. Chỉ có một bài viết đề cập đến một phạm vi rộng lớn của các loài thử nghiệm (Prutpongse và Gavinlertvatana, 1992) 30.
3. Rất ít các công thức có được đủ thành công để chuyển sang thương mại. Phương án sản xuất, đặc biệt là đối với nách nhánh. Vấn đề có thể
là dễ. Chỉ trong trường hợp Dendrocalamus asper nhân giống thông
qua nách nhánh đã rất thành công.
4. Phôi soma đã thành công ở một số các chi loài, chủ yếu là bắt đầu từ hạt giống. Ít nhiều thành công đã đạt được trong gây phôi soma ở tre trưởng thành. Tuy nhiên trong một số trường hợp, phôi soma cũng liên quan đến cảm ứng ra hoa (Lin và Chang, 2003; Rao và Raghav, 2002)
21, 31, một hiện tượng không mong muốn trong sản xuất. Khi xem xét tất cả các dữ liệu này, kết luận là ở mức độ nghiên cứu, nhiều công việc phải làm hơn nữa để phát triển phương pháp nhân giống tốt, sử dụng nuôi cấy mô. Trong cuối năm vừa qua, qua tìm hiểu thông tin cho thấy số lượng các bài báo nuôi cấy mô tre đăng trên tạp chí quốc tế cũng đã tăng lên đáng kể.
Sau đây là một số quy trình nghiên cứu về tre đã được công bố từ năm 1991 cho đến năm 2004:
1. Bambusa balcooa callus thu được từ Luồng trưởng thành nuôi trên môi
trường 1/2 MS + saccarose (6%) + BAP (4.10-6 M) + Kn (1.10-5 M) nảy mầm sau 3-4 tuần đạt nhiều chồi từ 4-15 (trung bình 6) Roohi et al. (1991) 32.
2. Bambusa bambos bề mặt tuyệt trùng nuôi cấy trên môi trường MS +
BAP (8.10-6M – 10-5M); pH=5.5 chiếu sáng liên tục và ở nhiệt độ 250C nảy mầm sau 1 tuần nuôi cấy, cho 30 chồi sau 8-10 tuần nuôi cấy Rao và Raghav (2002) 31.
3. Bambusa tulda nách nhánh vô trùng nuôi trên môi trường chất lỏng (vô
trùng) 1/2MS + BAP (8.10-6M) + Kn (4.10-6M) + saccarose (2%), cho 4-5 chồi sau 3 tuần nuôi cấy Saxena & Bhojwani (1993) 33.
1.4.2. Vi nhân giống họ tre ở Việt Nam
Tại Việt Nam tính đến nay mới có Công Ty cổ phần Công nghệ sinh học Rừng Hoa ở Đà Lạt thông báo đã nhân giống thành công với cây tre bằng
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 7/2014 đến tháng 4/2015 tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2.
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Lùng (Bambusa sp.), họ Tre – Bambusoideae được thu ở Nghệ An
do Công ty TNHH Đức Phong Nghệ An cung cấp, gồm củ măng non, ngọn măng non, cành bánh tẻ chứa mắt ngủ, đốt thân bánh tẻ.
2.2.2. Trang thiết bị và dung cụ 2.2.2.1. Thiết bị 2.2.2.1. Thiết bị
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Cân kĩ thuật GM612, Đức
Tủ lạnh sâu FRIGO
Máy đo Ph HM30G/TOA, Đức
Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAYAMA, Nhật
Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan
Máy cất nước hai lần Trung Quốc
Buồng cấy vô trùng AV – 110/TELSTAR
Máy khuấy từ gia nhiệt ARE/VELP, Italia
Cân phân tích CP224S, Đức
Tủ ấm UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức
2.2.2.2. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, nút bông, giấy thấm, đèn cồn, vỉ xốp nuôi cấy,…
2.3. Môi trường nuôi cấy
Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng
cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) 20: MS + 30g/l đường saccarose + 7,5g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng.
pH môi trường: 5,8.
Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1170C trong 15 phút.
2.4. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo:
- Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 2000 lux.
- Quang kì: 12 giờ sáng / 12 giờ tối. - Nhiệt độ phòng: 250C – 270C. - Độ ẩm trung bình: 70% - 74%.
- Mẫu được để trên máy lắc (150 – 200 vòng/ 1 phút) và trên giàn nuôi cấy.
2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Bố trí thí nghiệm 2.5.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nhiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, 30 mẫu / công thức.
2.5.2. Phương pháp nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu Sơ đồ nghiên cứu: Sơ đồ nghiên cứu:
Nhận mẫu cây Lùng Phân loại
Xử lý sơ bộ mẫu Lùng
Hiệu quả khử trùng đến mẫu cây Lùng (Cefotaxim, cồn I ốt, Javen)
Đánh giá sinh trưởng mẫu Lùng in vitro
(Nuôi cấy mẫu trên môi trường MS cơ bản, theo dõi chỉ tiêu sau 25 ngày nuôi cấy mẫu)
Quy trình tạo mẫu Lùng in vitro
2.5.2.1. Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu khởi đầu
Tạo vật liệu khởi đầu theo công thức ở bảng sau:
Bảng 2.1. Các công thức tạo vật liệu khởi đầu Công thức Loại nguyên liệu Phương pháp khử trùng ĐC Xử lý sơ bộ CT1 Củ măng non
Xử lý sơ bộ, lau bằng Etanol, bóc bỏ bẹ, cắt và cấy lên môi trường MS
CT2 Ngọn non Xử lý sơ bộ, lau bằng Etanol, bóc lớp, cắt và cấy lên môi trường MS
CT3 Ngọn non Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 1% (v/v)/2 phút
CT4 Ngọn non Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 1% (v/v)/3 phút CT5 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 2% (v/v)/10 phút CT6 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 2% (v/v)/20 phút CT7 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 2% (v/v)/30 phút CT8 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 5% (v/v)/10 phút CT9 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 5% (v/v)/20 phút CT10 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 5% (v/v)/30 phút
CT11 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 10% (v/v)10 phút CT12 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 10% (v/v)/20 phút CT13 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 10% (v/v)/30 phút CT14 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 15% (v/v)/10 phút CT15 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 15% (v/v)/20 phút CT16 Cành bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 15% (v/v)/30 phút CT17 Đốt thân bánh tẻ Xử lý sơ bộ + cồn 70% (v/v)/1 phút + Javen 10% (v/v)/20 phút
Mẫu cấy sau khi được khử trùng trong tủ cấy sẽ được cắt đều nhau dài khoảng 1 – 3 cm, thấm khô rồi cấy vào các bình tam giác chứa môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962). Đặt trên giàn nuôi cấy theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống sau 25 ngày cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%):(Tổng số mẫu nhiễm / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - Tỷ lệ mẫu sống (%): (Tổng số mẫu sống / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - Tỷ lệ mẫu chết (%): (Tổng số mẫu chết / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - Quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro cây Lùng.
2.5.2.2. Thi nghiệm 2: Tái sinh và nhân nhanh cây Lùng Nghệ An bằng
phương pháp tạo cụm chồi
Sau khi tạo được vật liệu cây Lùng in vitro và nuôi cấy trong môi
trường MS ở thí nghiệm, chúng tôi cấy sang môi trường ở bảng 2, để đánh giá khả năng tái sinh chồi cây Lùng (đánh giá sau 7 tuần nuôi cấy) theo các công thức nghiên cứu sau:
Bảng 2.2. Công thức nghiên cứu tạo cụm chồi mẫu cành và đốt thân cây Lùng
Công thức Thành phần môi trường
CT1 1/2MS (Đối chứng) CT2 1/2 MS + 1,0 mg/l BAP + ND 10% (môi trường đặc) CT3 1/2 MS + 1,0 mg/l BAP + ND 10% (môi trường lỏng) CT4 1/2 MS + 2,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l Kn (môi trường đặc)
Chỉ tiêu theo dõi:
- Hệ số nhân nhanh chồi = Tổng chồi tạo thành / Tổng chồi đưa vào - Chiều cao chồi (cm)
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy ngoài tự nhiên vào điều kiện
nuôi cấy in vitro. Đối với mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải xác định
phương thức khử trùng khác nhau cho thích hợp. Có loại chỉ cần bóc sạch các lớp bên ngoài để lấy đỉnh sinh trưởng và rửa lại bằng cồn 700 (như mía, gừng...), có loại phải sử dụng hoá chất khác nhau như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2,… với nồng độ và thời gian thích hợp. Cây Lùng vì là cây thuộc họ tre được lớp bẹ bảo vệ nên khá sạch và dễ khử trùng. Để có vật liệu cây Lùng vô trùng chỉ cần bóc sạch lớp bẹ và rửa lại bằng cồn 700 đối với củ măng non và ngọn măng non. Đối với cành, đốt thân cần sử lý bằng Javen nồng độ 1% - 15% trong thời gian 2 - 30 phút.
Giai đoạn này cần đạt các tiêu chuẩn: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại phân hoá và sinh trưởng tốt. Do đó, việc xác định phương thức khử trùng có ý nghĩa quyết định đối với sự thành công ban đầu và cả quá trình nhân giống tiếp theo.
Đề tài đã sử dụng nguồn mô ban đầu để tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm là: củ măng non, ngọn măng non, đốt thân bánh tẻ chứa mắt ngủ, cành bánh tẻ chứa mắt ngủ của giống Lùng.
Tỷ lệ mẫu sống sạch khuẩn, nấm trong ống nghiệm là chỉ tiêu đánh giá kết quả khử trùng mẫu. Sau hai tuần theo dõi kết quả được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu giống cây Lùng Công thức Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Mẫu sạch Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) ĐC 100 0 0 CT1 38,89 0 61,11 CT2 100 0 0 CT3 100 0 0 CT4 100 0 0 CT5 100 0 0 CT6 100 0 0 CT7 100 0 0 CT8 94,45 3,33 2,22 CT9 87,78 8,89 3,33 CT10 83,34 12,22 4,44 CT11 76,66 17,78 5,56 CT12 52,23 41,1 6,67 CT13 70,0 22,22 7,78 CT14 72,22 18,89 8,89 CT15 73,33 16,67 10,0 CT16 76,67 12,22 11,11 CT17 64,44 32,22 7,78
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ĐC CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 CT 8 CT 9 CT 10 CT 11 CT 12 CT 13 CT 14 CT 15 CT 16 CT 17 Tỷ lệ mẫu sống (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 3,33 8,89 12,22 17,78 41,1 22,22 18,89 16,67 12,22 32,22
Kết quả cho thấy, mẫu khử trùng ở các công thức ĐC (xử lý sơ bộ), CT1 (lau bằng etanol), các mẫu củ đều bị chết trong vòng 5 ngày nuôi cấy. Đối với ngọn măng non CT2 (lau bằng etanol) tỉ lệ mẫu sạch cao nhưng đều chết sau 2 tuần nuôi cấy. Khi khử trùng ngọn măng non với Javel ở nồng độ 1% (CT3 và CT4), các mẫu đều chết trong vòng 5 ngày nuôi cấy. Đối với cành bánh tẻ khử trùng với Javel ở nồng độ 2% (CT5 đến CT7), các mẫu cũng đều chết trong vòng 5 ngày nuôi cây. Các công thức từ CT8 đến CT16 cho
thấy Javen có tác dụng khử trùng mẫu in vitro. Tuy nhiên có sự khác nhau về
hiệu quả, có thể xếp thành 3 nhóm: tác dụng khử trùng tốt nhất ở công thức CT12 (đạt 41,1%), tiếp theo là CT13, CT14, CT11, CT15 và tác động thấp là CT8, CT9, CT10, CT16. Đối với mẫu thân bánh tẻ khử trùng với Javen 10% ở công thức CT17 có tỷ lệ mẫu sống cũng khá cao (đạt 32,22%). Kết quả này cho thấy ở cành bánh tẻ, khi sử dụng nồng độ Javen thấp thì hiệu quả khử