Xây dựng qui trình tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái sinh chồi in vitro cây hoàng tinh hoa đỏ (polygonatum kingianum coll et hemls )

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN - -  - - TRẦN HỒNG THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƢỚC ĐẦU TÁI SINH CHỒI IN VITRO CÂY HOÀNG TINH HOA ĐỎ (Polygonatum kingianum Coll et Hemls.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI, 2017 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN - -  - - TRẦN HỒNG THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƢỚC ĐẦU TÁI SINH CHỒI IN VITRO CÂY HOÀNG TINH HOA ĐỎ (Polygonatum kingianum Coll et Hemls.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng- Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng công nghệ AND ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm PGS.TS Lê Văn Sơn - Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, phương tiện để em hoàn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài em nhận giúp đỡ tận tình cô Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội tập thể cán phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ, đóng góp ý kiến để em hoàn thành đề tài khóa luận Nhân em xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, góp ý cho em qua trình học tập hoàn thành đề tài Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên TRẦN HỒNG THU LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng em.Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên TRẦN HỒNG THU MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Polygonatum 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Mô tả chi Polygonatum 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Hợp chất tự nhiên thuộc chi Polygonatum 1.1.5 Giá trị dƣợc liệu 1.1.6 Hiện trạng khai thác nƣớc 1.2 Một số phƣơng pháp sử dụng việc định danh loài xác định quan hệ di truyền 1.2.1 Giới thiệu DNA barcode 1.3 Sơ lƣợc nhân giống in vitro 1.3.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 10 1.3.3 Ƣu điểm phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.3.4 Các yếu tố ảnh hƣởng tới nuôi cấy mô 12 1.4 Các nghiên cứu Hoàng tinh hoa đỏ 15 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 2.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 16 2.2.1 Vật liệu thực vật 16 2.2.2 Trang thiết bị dụng cụ 16 2.2.3 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 17 2.2.4 Hóa chất môi trƣờng nuôi cấy 17 2.2.5 Điều kiện nuôi cấy in vitro 18 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Thu thập mẫu nhận dạng loài 18 2.3.2 Tái sinh chồi in vitro Hoàng tinh hoa đỏ 21 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Đặc điểm phân loại loài Hoàng tinh hoa đỏ thu Sa Pa (Lào Cai) 24 3.1.1 Đặc điểm hình thái 24 3.1.2 Đặc điểm phân loại loài thị phân loại phân tử 25 3.2 Tái sinh chồi in vitro Hoàng tinh hoa đỏ 30 3.2.1 Tạo vật liệu khởi đầu 30 3.2.2 Tái sinh chồi in vitro: 32 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi nhân gen barcode 17 Bảng 3.1: Hệ số tương đồng mẫu nghiên cứu loài công bố ngân hàng Genbank dựa thị psbA-trnH 28 Bảng 3.2: Hệ số tương đồng mẫu nghiên cứu loài công bố ngân hàng Genbank dựa thị RpoC 30 Bảng 3.3: Hiệu chất khử trùng mẫu Hoàng Tinh Hoa Đỏ 31 Bảng 3.4: Ảnh hưởng BAP đến khả phát sinh chồi Hoàng Tinh Hoa Đỏ sau tháng nuôi cấy 33 Bảng 3.5: Ảnh hưởng tổ hợp BAP IAA đến khả tạo chồi Hoàng Tinh Hoa Đỏ sau tháng nuôi cấy 35 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây Hoàng tinh hoa đỏ Hình 3.1: Mẫu thu Sa Pa-Lào Cai 24 Hình 3.2: Kết điện di DNA tổng số mẫu Hoàng tinh hoa đỏ nghiên cứu 25 Hình 3.3: Kết tinh sản phẩm PCR gen P10 (psbA-trnH) gen RpoC1 M: thang Marker 1Kb 26 Hình 3.4: Cây phân loại dựa thị psbA-trnH mẫu nghiên cứu (HoangTinhHoaDo) 28 Hình 3.5: So sánh trình tự psbA-trnH (kí hiệu HTHD_Sapa_01) thu từ Hoàng tinh hoa đỏ thu Sa Pa loài P.kingianum (Mã số Genbank: KJ745828.1) 29 Hình 3.6: Cây phân loại dựa thị RpoC mẫu nghiên cứu (HoangTinhHoaDo) 30 Hình 3.7: Quy trình tạo vật liệu Hoàng tinh hoa đỏ phương pháp in vitro 32 Hình 3.8: Chồi in vitro Hoàng tinh hoa đỏ sau tháng nuôi cấy môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng 34 Hình 3.9: Chồi in vitro Hoàng tinh hoa đỏ sau tháng nuôi cấy môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng 36 Hình 3.10: Mẫu Hoàng tinh hoa đỏ sau tháng nuôi cấy môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng 37 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris - Acetic acid - EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase NAA Napthlacetic acid BA Benzyl adenin IBA Indol butyric acid 2,4-D 2,4- Dichlorophenoxy acetic aicd BAP 6-Benzyl amino purin MS Murashige Skoog MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Xu hướng phát triển y học Việt Nam số nước khu vực Đông Nam Á quay với y học cổ truyền, sử dụng thuốc dân gian tác dụng loài dược liệu Cây chi Polygonatum loài dược liệu quý, sử dụng rộng rãi nghiên cứu dùng để chữa trị nhiều bệnh [22] Trong năm gần đây, nhà khoa học giới có số nghiên cứu chi Polygonatumvà cho thấy Polygonatum chi phức tạp với số lượng NST (2n= 16, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 36, 38, 40,…) [18], đại diện 60 loài giới, phân bố chủ yếu khu vực ôn đới từ dãy Himalaya đến Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Malaixia Ở Trung Quốc có 32 loài gồm 20 loài đặc hữu, có loài Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl [22].Đây chi phức tạp nên việc nhận dạng loài nói chung nhận dạng Hoàng Tinh Hoa Đỏ (Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl) nói riêng tương đối khó khăn Hiện nay, phương pháp DNA barcode công cụ phục vụ định danh loài xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng DNA chuẩn hay gọi thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định loài DNA thị có hiệu cao việc phân biệt loài thực vật quan sát hình thái, sinh trưởng phát triển chưa đủ sở để định danh phân biệt loài [12] Hoàng tinh hoa đỏ dược liệu thuộc chi Polygonatum sử dụng phổ biến Y học cổ truyền phương Đông với tên vị thuốc "Thục hoàng" Theo Y học cổ truyền, Thục hoàng có tác dụng kiện tỳ, nhuận phế, ích thận, sử dụng để điều trị chứng ho khan, bệnh phổi nhờ tác dụng kháng khuẩn hiệu quả; dùng làm thuốc bổ Ở nước ta, Hoàng tinh Hình 3.5: So sánh trình tự psbA-trnH (kí hiệu HTHD_Sapa_01) thu từ Hoàng tinh hoa đỏ thu Sa Pa loài P.kingianum (Mã số Genbank: KJ745828.1) Bên cạnh thị psbA-trnH thị RpoC1cũng sử dụng phổ biến nghiên cứu barcode, đặc biệt nghiên cứu Liu (2010) rpoC1 thị hữu ích để phân biệt loài bryophytes Tiến hành phân tích tương tự trình tự rpoC1, kết cho thấy trình tự rpoC1 phân lập từ loài Hoàng tinh hoa đỏ thu Sa Pa-Lào Cai có chiều dài 542 bp có độ tương đồng 99% với trình tự rpoC1 nhiều loài thuộc chi Polygonatum P.sibiricum (KT695605.1), P.verticillatum (KT722981.1), P.cyrtonema (KT630835.1)… Như vậy, trình tự rpoC1 loài thuộc Chi Polygonatum khác biệt, sử dụng trình tự để nhận dạng cho Chi 29 Bảng 3.2: Hệ số tƣơng đồng mẫu nghiên cứu loài đƣợc công bố ngân hàng Genbank dựa thị RpoC Percent Identity Divergence 98.3 98.2 98.2 98.0 HoangTinhHoaDo 99.8 99.8 99.6 Polygonatum stenophyllum 100.0 99.8 Polygonatum involucratum 1.7 1.9 0.2 1.9 0.2 0.0 2.1 0.4 0.2 0.2 99.8 Polygonatum inflatum Polygonatum humile Hình 3.6: Cây phân loại dựa thị RpoC mẫu nghiên cứu (HoangTinhHoaDo) 3.2 Tái sinh chồi in vitro Hoàng tinh hoa đỏ 3.2.1 Tạo vật liệu khởi đầu Trong giai đoạn kỹ thuật nhân giống in vitro giai đoạn tạo vật liệu in vitro đóng vai trò quan trọng, định đến thành công công trình nghiên cứu Để loại bỏ vi sinh vật sử dụng nhiều loại chất khử trùng khác NaClO, Ca(OCl)2, H2O2, HgCl2… thí nghiệm này, chất khử trùng javen (NaClO) sử dụng chất khử trùng có hiệu cao cho nhiều đối tượng khác Tuy nhiên, đối tượng 30 trồng cần nghiên cứu chế độ khử trùng thích hợp Mẫu Hoàng Tinh Hoa Đỏ sau thu xử lý sơ + javen với nồng độ thời gian khử trùng khác Theo dõi tiêu mẫu nhiễm, mẫu sau tuần nuôi cấy ta thu kết trình bày bảng sau: Bảng 3.3: Hiệu chất khử trùng mẫu Hoàng Tinh Hoa Đỏ Công thức Tỷlệ mẫu nhiễm (%) CT1(ĐC): xử lí xơ xà phòng, cồn nước cất CT2: Cồn 70% phút, javen 3% 7phút CT3: Cồn 70% 10 phút, javen 7% 10phút CT4: Cồn 70% 15phút, javen 10% 15phút CT5: Cồn 70% 20 phút, javen 15% 20 phút CT6: Cồn 70% 25phút, javen 20% 20 phút CT7: Cồn 70% 30phút, javen 30% 30 phút CT8: Cồn 70% 30phút, javen 35% 30phút CT9: Cồn 70% 30phút, javen 40% 30phút 100 93 63.2 16 45 47,1 27.4 Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Tỷ lệ mẫu mẫu sống chết (%) (%) 0 33.8 50 34 17.3 37.7 52,9 72.6 95 100 Kết thu cho biết tăng nồng độ javen thời gian xử lí tỷ lệ mẫu sống tăng (0-50%) đồng thời tỷ lệ mẫu nhiễm giảm Thời gian khử trùng nồng độ javen thấp không đủ để gây chết vi sinh vật (CT1-CT3), mẫu nhiễm nhiều, không đạt yêu cầu Ngược lại, thời gian khử trùng kéo dài nồng độ javen tăng, mẫu nhiễm hơn, nhiên tỷ lệ mẫu bị chết tăng (CT6-CT9) Như vậy, thời gian nồng độ khử trùng có ảnh hưởng lớn đến khả tái sinh mẫu nghiên cứu Nồng độ thích hợp cho hiệu khử trùng giaven 10% thời gian 15 phút, cho tỷ lệ mẫu cao với 50% Các mẫu nuôi cấy để tái sinh chồi Từ kết trên, đưa quy trình tạo vật liệu in vitro sau: 31 a b c d e f Hình 3.7: Quy trình tạo vật liệu Hoàng tinh hoa đỏ phƣơng pháp in vitro (a) Củ Hoàng tinh hoa đỏ thu thực địa chứa chồi non (b) Rửa mẫu nghiên cứu phơi khô (c) Xử lý mẫu javen (d) Rửa lại với nước cất (e) Cắt mẫu thành đốt có chứa mắt (f) Nuôi cấy môi trường MS vô trùng 3.2.2 Tái sinh chồi in vitro Trong quy trình nhân giống in vitro, giai đoạn tái sinh đóng vai trò quan trọng Để có trạng thái sinh trưởng tốt việc xác định môi trường thích hợp quan trọng Các phytohoocmon điều tiết sinh trưởng (xytokinin) cần thiết việc điều khiển tái sinh mẫu cấy theo hướng tạo chồi Ở giai đoạn sử dụng môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 32 BAP, BAP+IAA, 2,4D ngưỡng nồng độ khác nhằm tìm nồng độ thích hợp cho trình tái sinh cây,tạo số chồi nhiều 3.2.2.1 Ảnh hưởng BAP (Benzyl Adenin Purin) đến khả tái sinh chồi in vitro Trong nhóm chất xytokinin, BAP chất thường sử dụng lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào giai đoạn nhân chồi chúng có vai trò thúc đẩy phân hóa chồi mẫu nuôi cấy, định hệ số chồi chất lượng chồi hình thành Bảng 3.4: Ảnh hƣởng BAPđến khả phát sinh chồi Hoàng Tinh Hoa Đỏ sau tháng nuôi cấy Phát Chỉ tiêu sinh chồi Nồng độ (mg/l) Số Chiều cao chồi/mẫu chồi (chồi) (%) (cm) Số Trạng thái lá/chồi chồi (lá) (*) ĐC 33.3 1.00a 2.33a 2.5ab Kém 100 1.25a 4.11d 3.75b Tốt 100 3.00b 3.55c 2.75ab Tốt 100 1.75a 2.95b 2.00a Trung bình 100 1.25a 3.20b 1.75a Trung bình - - - - (*) Tốt: chồi mập, xanh; Trung bình: chồi bình thường, xanh nhạt; Kém: chồi gầy, xanh nhạt, (-) Không tượng, chữ khác cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 33 a b c d Hình 3.8: Chồi in vitro Hoàng tinh hoa đỏ sau tháng nuôi cấy môi trƣờng MS bổ sung chất kích thích sinh trƣởng (a) Môi trường MS bổ sung mg/l BAP (b) Môi trường MS bổ sung mg/l BAP (c) Môi trường MS bổ sung mg/l BAP (d) Môi trường MS bổ sung mg/l BAP Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP (1-8 mg/l)lên khả nhân chồi in vitro Hoàng Tinh Hoa Đỏ trình bày bảng 3.4, cho thấy công thức bổ sung BAP cho tỷ lệ phát sinh chồi đạt 100% so với công thức đối chứng đạt 33,3% Trong đó, môi trường có nồng độ mg/l BAP có ảnh hưởng tốt đến khả nhân chồi, số chồi đạt chồi/mẫu, số đạt lá/chồi, chiều cao chồi đạt 3,55 cm Tuy nhiên, môi trường có nồng độ 1mg/l BAP lại cho chất lượng chồi tốt nhất, chồi có màu xanh, thân 34 to, phát triển tốt, có kích thước dài Khi nồng độ BAP tiếp tục tăng số chồi tạo thành có xu hướng giảm nồng độ BAP cao chồi không hình thành điều chứng tỏ nồng độ cao BAP ức chế đến hình thành chồi 3.2.2.2 Ảnh hưởng tổ hợp BAP IAA (Axit β -indol axetic) đến khả nhân chồi in vitro: Các chồi cấy lên môi trường MS bổ sung tổ hợp BAP (15mg/l) kết hợp với 0,2 mg/l IAA để thăm dò khả nhân chồi in vitro Kết sau tháng nuôi cấy trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng tổ hợp BAP IAA đến khả tạo chồi Hoàng Tinh Hoa Đỏ sau tháng nuôi cấy Chất điều tiết Mẫu sinh trƣởng phát Số Chiều Số Trạng (mg/l) sinh chồi/mẫu cao chồi lá/chồi thái chồi (chồi) (cm) (lá) chồi (*) BAP IAA (%) ĐC 33.3 1.00a 2.32a 2.50a Kém 0.2 - - - - 0.2 100 1.25ab 3.13b 2.00a Kém 0.2 100 2.25bc 3.35b 2.75a Trung bình 0.2 100 3.00c 4.20c 4.75b Tốt (*) Tốt: chồi mập, xanh; Trung bình: chồi bình thường, xanh nhạt; Kém: chồi gầy, xanh nhạt, (-) Không tượng, chữ khác cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 35 a b c d Hình 3.9: Chồi in vitro Hoàng tinh hoa đỏ sau tháng nuôi cấy môi trƣờng MS bổ sung chất kích thích sinh trƣởng (a) Môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (b) Môi trường MS bổ sung mg/l BAP+ 0,2 mg/l IAA (c) Môi trường MS bổ sung mg/l BAP+ 0,2 mg/l IAA (d) Môi trường MS bổ sung 5mg/l BAP+ 0,2mg/l IAA Kết bảng 3.5 cho thấy bổ sung thêm IAA vào môi trường, có mặt auxin ảnh hưởng đến tích luỹ cytokinin, hoạt tính BAP yếu Cụ thể như, thí nghiệm BAP đơn lẻ, cần 2mg/l cho kết nhân chồi tốt công thức nghiên cứu thí nghiệm bổ sung hỗn hợp cần nồng độ 5mg/l BAP +0,2mg/l IAA Điều với nhận định Gaspar et al (1996) auxin ức chế tích luỹ cytokinin Tuy nhiên, công thức mg/l BAP + 0,2mg/l IAA cho chiều cao chồi, số lá/chồi 4,2 cm 4,75 lá/chồi, vượt hẳn so với thí nghiệm dùng BAP đơn lẻ đạt 3,55 cm 2,75lá/chồi Như vậy, công thức tốt cho nhân chồi mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA 36 3.2.2.3 Ảnh hưởng 2,4D (2,4-Diclorophenoxyaxetic axit) đến khả tạo mô sẹo Chất điều hòa sinh trưởng 2,4D loại auxin tổng hợp thường dùng nuôi cấy mô, tế bào 2,4D có tác dụng kích thích phân bào sinh trưởng mô sẹo Để xác định ảnh hưởng nồng độ auxin 2,4D đến khả tạo callus Hoàng Tinh Hoa Đỏ, tiến hành thử nghiệm bổ sung chất với nồng độ khác môi trường nuôi cấy a b Hình 3.10: Mẫu Hoàng tinh hoa đỏ sau tháng nuôi cấy môi trƣờng MS bổ sung chất kích thích sinh trƣởng (a) Môi trường MS bổ sung mg/l 2,4D (b) Môi trường MS bổ sung 3mg/l 2,4D Kết nghiên cứu bảng 3.6 cho thấy, loại môi trường có bổ sung 2,4D nghiên cứu, có nồng độ 2mg/l có khả tạo mô sẹo sau tháng nuôi cấy Khi tăng nồng độ 2,4D mẫu nghiên cứu không phản ứng chứng tỏ nồng độ cao 2,4D có vai trò thuốc diệt cỏ, gây chết tế bào 37 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl.) thu Sa Pa-Lào Cai bổ sung thêm hai thị phân loại phân tử psbAtrnH rpoC1 có chiều dài 616 bp 542 bp, sử dụng trình tự psbA-trnH để nhận dạng mức độ loài trình tự rpoC1 để nhận dạng mức độ Chi Polygonatum - Chồi non thân rễ Hoàng tinh hoa đỏ khử trùng cách rửa nước sạch, khử trùng cồn 70 % (v/v)/15 phút javen 10 % (v/v)/15 phút - Môi trường tái sinh chồi MS, 30g đường saccharose, 7g agar có bổ sung mg/l BAP 0,2 mg/l IAA thích hợp để tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu thêm để tìm chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi, đặc biệt tăng trưởng chồi hình thành rễ Hoàng tinh hoa đỏ in vitro nhanh Nghiên cứu giai đoạn vườn ươm để tìm giá thể thích hợp cho phát triển Hoàng tinh hoa đỏ in vitro 38 PHỤ LỤC Bảng Thành phần dung dịch đệm rửa Hóa chất STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối Sorbitol 350 mM Tris-HCl (pH 8,0) 1M 100 mM EDTA (pH 8,0) 0,5 M mM Sordium metabisulfit 5% Bảng Thành phần dung dịch đệm tách STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối NaCl 3M 1,5 M Tris-HCl (pH 8,0) 1M 100 mM EDTA (pH 8,0) 0,5 M 20 mM CTAB 4% Bảng Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nước khử ion vô trùng 12,8 Buffer (10X) 2,5 MgCl2 (25 mM) 2,5 dNTPs (10 mM) 2,5 Primer barcode_F (100 pmol/µl) Primer barcode_R (100 pmol/µl) 39 Taq DNA polymerase (6 unit/µl) 0,7 DNA Tổng thể tích 25 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Võ Văn Chi, (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Tập I, tr 11191120 NXB Y học, Hà Nội Dương Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô thực vật II, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Hoàng Đăng Hiếu, “Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh loài tập đoàn dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh”: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, luận văn thạc sỹ Phạm Hoàng Hộ, (2006), Cây có vị thuốc Việt Nam - Nhà xuất Trẻ Đỗ Tất Lợi, (1996), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong, (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, NXB Đại học quốc gia Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/3/2006 Chính phủ Nguyễn Tập,( 2007), Cẩm nang thuốc cần bảo vệ Việt Nam, mạng lưới Lâm sản gỗ Việt Nam Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật: Sách đỏ Việt Nam, 2007, Phần II Thực vật - trang 388 (Vietnam red data book, Part II Plants), NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ 10 Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 11 Chase M.W, Cowan R.S, Hollingsworth P.M (2007), “A proposal for a standard protocol to barcode all land plants”, Taxon, 56:295-299 12 Gonzalez M.A, Baraloto C, Engel J, Mori S.A, Pétronelli P (2009), “Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE 4(10):7483 41 13 Khan H, Saeed M, Muhammad.N (2012), “Pharmacological and phytochemical updates of genus Polygonatum”, Phytopharmacology, 3(2) 286-308 14 Hou JP, Jin Y (2005), “The healing power of Chinese herbs and medicinal recipes”, The Haworth integrative Healing press, New York 15 Iyyakkannu Sivanesan1,Byoung Ryong Jeong (2012), “In vitro propagation of Polygonatum Odoratum druce Var Pluriflorum Ohwi F Variegatum Y N Lee”, Propagation of Ornamental Plants, Vol 12, No 4, 2012: 215-219 16 Kress W.J, Wurdack K.J, Zimmer E.A, Weigt L.A, Janzen D.H, (2005a), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc Natl Acad Sci USA, 102:8369-8374 17 Kress W.J, Wurdack K.J, Zimmer E.A, Weigt L.A, Janzen D.H, (2005b), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc Natl Acad Sci USA, 102(23):8369-8374 18 Lattoo S K., Khan S., Dhar A K 2005, A new chromosome number in Polygonatum cirrhifolium Royle: an endangered liliaceous medicinal herb, Current Science, 89(7): 1080-1081 19 Murashige T., Skoog F (1962), “A revised medium for rupid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol Phant 15: 473 - 479 20 Shivani Bisht, N S Bisht, and Snehlata Bhandari (2012), “In vitro micropropagation in Polygonatum verticillatum (L.) All an important threatened medicinal herb of Northern India”, Physiol Mol Biol Plants, 18(1): 89–93 21 Vijayan K., Tsou C H (2010), “ DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 22 Zheng-Yi W, Raven P.H, (2003), Flora of China: Vol 24 42 (Flagellariaceae through Marantaceae), p 223 - 233 Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St Louis Tài liệu Internet 23 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 24 http://www.vncreatures.net 43 ... (Polygonatum kingianum Coll et Hemls. ) Vì vậy, đề tài: Xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầu bước đầu tái sinh chồi invitro Hoàng Tinh Hoa Đ (Polygonatum kingianum Coll et Hemls. ) nhằm góp phần vào... HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN - -  - - TRẦN HỒNG THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU VÀ BƢỚC ĐẦU TÁI SINH CHỒI IN VITRO CÂY HOÀNG TINH HOA ĐỎ (Polygonatum kingianum Coll et Hemls. ) KHÓA... thuật DNA Barcode - Xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầuin vitro Hoàng Tinh Hoa Đỏ - Bước đầu tái sinh chồi Hoàng Tinh Hoa Đ in vitro 2.2 Nghiệm vụ nghiên cứu - Phân lập, giải trình tự hai gen