Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật Rapd

Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật Rapd

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG

(Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƯỚC DOANH

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2003 - 2007

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007

Con xin chân thành biết ơn những người thân yêu trong gia đình đã luôn động viên và tạo điều kiện cho con ăn học đến ngày hôm nay

Em xin gởi lòng biết ơn đến:

 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

 Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

 Ban Chủ nhiệm và các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học  Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phòng

kỹ thuật

đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực hiện đề tài này

Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi Minh Trí – giáo viên hướng dẫn, đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá trong nghiên cứu cũng như trong cuộc sống, giúp em hoàn thành đề tài này và ứng dụng nhiều trong thời gian tới

Và rất cảm ơn đến các anh chị đang công tác tại Trung tâm phân tích Thí nghiệm Trường Đại học Nông Lâm: chị Hưng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh Phương, anh Vũ…cùng các bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thương yêu, đã cùng tôi chia sẽ nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảm ơn !

NGUYỄN PHƯỚC DOANH

iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

NGUYỄN PHƯỚC DOANH, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Đề tài “BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA

DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ

SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RAPD” được tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm và Hóa sinh trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007

Mắm trắng là loài cây ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trò quan trọng và có sự phân bố rộng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ Tuy nhiên, trải qua những hoạt động khai thác của con người, quần thể mắm trắng tại đây ngày càng thoái hóa và suy giảm về diện tích nghiêm trọng Vì vậy, những nghiên cứu về đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho việc thiết lập các chiến lược tái tạo và phục hồi sự đa dạng sinh học của hệ sinh thái

Những kết quả đạt được:

 Thu được 50 mẫu lá mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể  Tối ưu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lượng cao đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu Sinh học phân tử

 Bước đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm trắng, sử dụng primer OPAC10 Với 14 mẫu DNA phân tích thu được tổng cộng 49 băng, trung bình là 3,5 băng cho mỗi mẫu Có 6 băng đa hình ở các kích thước 450 bp, 390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp và chỉ 1 băng đồng hình ở kích thước 200bp

 Kết quả thực hiện phản ứng RAPD được xử lý trên mần mềm NTSYS thu được cây phân loài của những cây đem phân tích Cây phân loài cho thấy chỉ số đồng dạng di truyền khá cao từ 0,55 – 1 Điều này cũng có nghĩa sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ở mức thấp do đó cần đặc biệt chú ý đến công tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền trên cây mắm trắng và đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng trong thời gian tới

Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large

distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area However, over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and degraduation Studies on population genetics are necessary to provide basic information for establishing the strategies for conserving and recovering biodeversity of the ecosystem

The obtained results were:

 Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected

 The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA

 The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for

Avicennia alba using primer OPAC10 Totally 49 amplicons were

generated with an average of 3,5 applicons per individual There were only one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps,

300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps)

 A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD results This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to 1 in

14 analized samples It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba

population is relatively poor So, strategies for conserving and recovering

their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed

1.4 Giới hạn của đề tài 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ 3

2.1.1 Đặc điểm tự nhiên 3

2.1.2 Cấu trúc 6

2.1.3 Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ 7

2.1.4 Vai trò của khu dự trữ sinh quyển 9

2.1.5 Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ 9

2.2 Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba) 10

2.2.1 Vùng phân bố 10

2.2.2 Hình thái học cây mắm trắng 11

2.2.3 Giá trị kinh tế của cây mắm trắng 13

2.2.4 Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ 13

2.2.5 Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng 14

vii

2.3 Khái niệm về đa dạng di truyền 14

2.3.1 Đa dạng sinh học 14

2.3.2 Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học 14

2.3.3 Các phân mức về đa dạng sinh học 15

2.3.3.1 Đa dạng hệ sinh thái 15

2.3.3.2 Đa dạng loài 15

2.3.3.3 Đa dạng di truyền 16

2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam 17

2.4 Phương pháp chiết tách DNA thực vật 18

2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) 19

2.5.1 Khái niệm 19

2.5.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR 19

2.5.3 Nguyên tắc của phản ứng PCR 20

2.5.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 21

2.5.5 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR 21

2.6 Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền 22

2.6.1 Nhóm không dựa trên PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 22

2.6.2 Nhóm dựa trên PCR 23

2.6.2.1 SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 23

2.6.2.2 Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) 24

2.6.2.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 25

2.6.2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 30

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 33

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 33

3.1.1 Thời gian tiến hành 33

3.1.2 Địa điểm 33

3.2 Vật liệu nghiên cứu 33

3.2.1 Mẫu thực vật 33

viii

3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 34

3.2.2.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA 34

3.2.2.2 Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA 35

3.2.2.3 Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD 36

3.2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 36

3.3 Phương pháp nghiên cứu 37

3.3.1 Phương pháp ly trích DNA 37

3.3.2 Kiểm tra DNA ly trích 39

3.3.2.1 Kiểm tra định tính DNA bằng phương pháp điện di trên gel 39

3.3.2.2 Kiểm tra định lượng DNA bằng quang phổ kế 39

3.3.3 Thực hiện kỹ thuật RAPD 40

3.3.4 Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 42

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ 43

4.2 Kết quả quá trình bảo quản mẫu 44

4.3 Kết quả quá trình ly trích DNA tổng số 44

4.4 Kết quả quá trình thực hiện phản ứng RAPD 47

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 40

Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 40

Bảng 3.3 Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 41

Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 41

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 47

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5

Hình 2.2 Cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ 11

Hình 2.3 Lá và hoa cây mắm trắng 12

Hình 2.4 Trái mắm trắng 12

Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR 20

Hình 2.6 Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI 26

Hình 2.7 Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI 26

Hình 2.8 Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP 27

Hình 2.9 Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP 28

Hình 2.10 Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP 29

Hình 2.11 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR 30

Hình 4.1 Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ 43

Hình 4.2 Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2 45

Hình 4.3 Kết quả ly trích theo quy trình 3 45

Hình 4.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ƣu 46

Hình 4.5 Kết quả ly trích theo quy trình 4 46

Hình 4.6 Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 48

Hình 4.7 Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 48

Hình 4.8 Sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen (Avicennia officinalis) 49

Hình 4.9 Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 2 trên cây mắm trắng 50

Hình 4.10 Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng 51

Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích 52

xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

 µl: microlite  µM: micromol/lite  bp: base pair  cm: centimét

 CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid

 dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate  Kb: kilobases

 mM: milimol/lite  m: mét

 nm: nanomét

 OD: Optical density

 PCR: Polymerase chain reaction  pmol: picomol

 RNA: Ribonucleic acid  Rnase: Ribonuclease

 SSR: Single sequence repeat

 Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)

 TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)

 Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của enzyme

Phần 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, được xem là khu rừng phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á và vinh dự được UNESCO công nhận là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam, nằm trong mạng lưới 459 khu dự trữ sinh quyển trên Thế giới Đây được xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới, không chỉ phong phú, đa dạng với các quần thể thực vật, động vật có giá trị mà còn được xem là lá phổi xanh của TP Hồ Chí Minh và có nhiều tiềm năng về kinh tế, du lịch sinh thái – văn hóa, nghiên cứu và giao lưu quốc tế

Cây mắm trắng (Avicennia alba) là một trong những loài thực vật ngập mặn

thực sự, rất phổ biến tại rừng Cần Giờ Đây là quần thể tiên phong và giữ một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái rừng Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trường sống cho sinh vật ven biển Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đước là thành phần chính của rừng ngập mặn Cần Giờ, có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven biển, là nơi nuôi dưỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ

Quần thể mắm trắng tại đây chủ yếu là phát triển tự nhiên Tuy nhiên, qua thời gian cùng với sự phát triển của rừng, diện tích mắm trắng đang ngày càng thu hẹp trước sự khai thác, sử dụng không hợp lý và lâm vào tình trạng báo động bởi những dịch sâu bệnh tấn công trên vùng rộng Việc đánh giá tổng quát về quỹ gien và mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ là cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho các kế hoạch bảo vệ và sử dụng hợp lý tiềm năng cây mắm trắng Đáp ứng yêu cầu đó, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, và dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Bùi Minh Trí, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“BƯỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA

DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ

SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”

1.2 Mục đích

 Tối ưu hóa quy trình ly trích DNA và bước đầu hoàn thiện quy trình thực hiện phản ứng RAPD thích hợp cho cây mắm trắng

 Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng

(Avicennia alba) tại khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ

1.3 Yêu cầu

 Thu thập được nhiều mẫu đặc trưng, mang tính đại diện cao cho quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, chú ý đến những mẫu đặc biệt, cá biệt trong quần thể, ghi nhận tọa độ chính xác của mỗi cá thể

 Ly trích thành công DNA từ các mẫu đã thu đủ tiêu chuẩn về độ tinh sạch và số lượng cho các phân tích tiếp theo

 Thiết lập quy trình RAPD - PCR trên cây mắm trắng cho độ tin cậy cao

1.4 Giới hạn của đề tài

 Số lượng các primer được sử dụng còn bị hạn chế

 Chưa có điều kiện khảo sát quần thể mắm trắng với số lượng mẫu lớn  Việc tìm kiếm những cá thể đặc biệt bị giới hạn do điều kiện đi lại trong rừng gặp nhiều khó khăn

 Đề tài được thực hiện trong thời gian ngắn, từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007, do đó chưa phản ánh đúng đắn và chính xác với tất cả các giống hiện có

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ 2.1.1 Đặc điểm tự nhiên

Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ nằm trên địa bàn huyện Cần Giờ, một huyện ngoại thành của TP Hồ Chí Minh, nằm ở vùng ven biển vịnh Gềnh Rái và cửa sông Đồng Nai, là cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 30 km Đây là khu dự trữ sinh quyển mang đặc điểm của hệ sinh thái cửa sông ven biển, hệ động thực vật đặc trưng cho hệ sinh thái rừng ngập mặn Vùng rừng ngập mặn bị chia cắt bởi hệ thống sông rạch dày đặc gồm sông lớn như Lòng Tàu nằm giữa khu rừng (đường thủy ra vào cảng Sài Gòn), sông Đồng Tranh, sông Nhà Bè, sông Thị Vải, sông Gò Gia, và nhiều rạch khác [19]

Trước năm 1960, rừng ngập mặn Cần Giờ (có tên gọi thông thường là Rừng Sác) có tới hơn 40.000 ha cây rừng, được xếp hạng rừng giàu Rừng có cấu trúc dày đặc với tán rừng dày, cao trên 25 m, đường kính 25 – 40 cm, là sinh cảnh của nhiều

động vật hoang dã Trong rừng, đước (Rhizophora apiculata) là loài chiếm ưu thế, bên cạnh các quần thể khác như bần đắng (Sonneratia alba), mắm trắng (Avicennia

alba), đưng (R mucronata), vẹt (Bruguiera spp.), xu (Xylocarpus spp), cóc (Lumnitzera spp.), chà là (Phoenix paludosa), giá (Excoecaria agallocha) [5], [19]

Trong suốt thời gian chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ là đối tượng tàn phá của nhiều phương tiện chiến tranh, đặc biệt bị hủy diệt gần như hoàn toàn do chất độc hóa học, liên tục từ năm 1961 đến năm 1971, hầu hết các loại cây rụng lá và chết Các loài cây như đước, đưng gần như biến mất Một số ít cây dà

(Ceriops spp), giá (Excoecaria agallocha) ven bờ kênh rạch tái sinh theo từng cụm nhỏ, nơi đất ngập triều có mắm, trên đất cao có chà là nước (Phoenix paludosa) và các loài ráng đại (Acrostichum aureum), dây mủ (Gymnanthera mitida), cóc kèn

(Derris trifoliata), chùm lé (Azima sarmentosa), lức (Pluchea indica), chùm gọng (Clerodendrum inerme) [5]

Sau giải phóng, một chương trình lớn được thực hiện: khôi phục rừng ngập mặn Cần Giờ vì yêu cầu cấp bách khắc phục hậu quả nghiêm trọng đối với môi trường TP Hồ Chí Minh do chiến tranh hóa học gây ra Từ năm 1967 đến nay, công việc tái tạo rừng được thực hiện mạnh mẽ Đến nay diện tích rừng ngập mặn Cần Giờ vào khoảng 38.000 ha Sau hơn 30 năm bảo tồn và phát triển, rừng ngập mặn Cần Giờ vinh hạnh được UNESCO công nhận là Khu dự trữ sinh quyển với tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh và tên ngắn gọn: Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ [19], [21]

Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có tọa độ địa lý và các đặc điểm như sau:  Vĩ độ Bắc: 10o22’14” – 10o37’39”

 Kinh độ Đông: 106o46’12” – 107o00’59”  Ngày được UNESCO công nhận: 21/01/2000

 Tổng diện tích: 71.370 ha, chiếm tới 1/3 diện tích đất đai toàn TP Hồ Chí Minh Trong đó diện tích rừng và đất liền là 38.664 ha (chiếm khoảng 54,2%)

 Dân số: 57.650 người (nguồn thống kê tháng 7/1999 của huyện Cần Giờ), với 40% số hộ thuộc diện xóa đói giảm nghèo, sống chủ yếu dựa vào khai thác tài nguyên rừng [5], [8], [19]

Hình 2.1 Bản đồ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Ghi chú:

Vùng lõi

Vùng đệm

Vùng chuyển tiếp

2.1.2 Cấu trúc

Khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ được chia làm 3 vùng chính: vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp [5]

Vùng lõi (4.721 ha): đặc trưng cho các hệ sinh thái rừng trồng và đặc biệt

là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng với đa dạng sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật với cảnh quan

rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn, gồm các tiểu khu rừng số 4b, 6, 11, 12 và 13

Mục tiêu quản lý vùng lõi là bảo tồn đa dạng sinh học, hạn chế các hoạt động của con người và có các chức năng chính như sau:

 Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên

 Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trường sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nước

 Bảo tồn hệ thống thuỷ vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển nơi kiếm ăn và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều

 Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du lịch sinh thái có giới hạn [5]

Vùng đệm (37.339 ha): tiếp giáp với vùng lõi, là nơi có thể tiến hành các

hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục và giải trí nhưng không ảnh hưởng đến mục đích bảo tồn trong vùng lõi, bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 3, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 23 và 24

Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, vùng đệm có vai trò quan trọng trong bảo tồn vùng lõi Các hoạt động du lịch sinh thái, tham quan và nghiên cứu có thể triển khai ở Khu căn cứ địa kháng chiến, đặc khu Rừng Sác, thăm vườn chim, vườn cò, vườn dơi sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho người dân, nâng cao ý thức và hiểu biết giá trị của công tác bảo tồn góp phần làm giảm sức ép lên vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển Mặt khác, vùng đệm còn tạo không gian cho thú hoang dã như khỉ, rái cá, kỳ đà kiếm ăn Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung

vào vùng lõi nếu cần thiết, đồng thời tạo cảnh quan tự nhiên và hoạt động văn hoá phục vụ cho du lịch sinh thái Ngoài ra, các mô hình lâm ngư kết hợp thân thiện với môi trường cũng được ứng dụng, trình diễn cho nhân dân địa phương đến tham quan, học tập và trao đổi kinh nghiệm [5]

Vùng chuyển tiếp (29.310 ha): gồm các khu vực còn lại của huyện Cần

Giờ, bao gồm các vùng bãi bồi, giồng, bãi cát, các khu vực sản xuất nông nghiệp, thuỷ sản của dân cư dọc theo ven biển Cần Giờ

Vùng chuyển tiếp còn được gọi là vùng phát triển bền vững, nơi cộng tác của các nhà khoa học, nhà quản lý và người dân địa phương, tạo điều kiện thuận lợi và đẩy mạnh các hoạt động phát triển kinh tế, du lịch, dịch vụ đi đôi với tuyên truyền giáo dục nâng cao nhận thức cộng đồng [5]

2.1.3 Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ

Rừng ngập mặn Cần Giờ là Khu dự trữ sinh quyển thế giới đầu tiện tại Việt Nam, và là thành viên thứ 368 của mạng dự trữ sinh quyển quốc tế thuộc 97 quốc gia Đến tháng 7/2002, Rừng ngập mặn Cần Giờ tiếp tục được Tổ chức Du lịch thế giới (World Tourism Organization) công nhận là Khu du lịch Sinh thái bền vững nhất (là 1 trong 65 khu được thế giới công nhận) Theo Ủy ban Quốc gia Con người và Sinh quyển Việt Nam (MAB), rừng ngập mặn Cần Giờ được xem là khu rừng phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á, đặc biệt là còn rất ít trên thế giới [5], [19]

Rừng ngập mặn được xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới không chỉ cung cấp lâm sản có giá trị mà còn là nơi cư trú của nhiều loài hải sản, chim nước, chim di cư và một số loài động vật lưỡng cư, trên cạn [19]

Rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính chất rừng nhiệt đới cổ và phong phú về số loài thực vật di cư Theo số liệu điều tra, Rừng ngập mặn Cần Giờ có khoảng 35

loài thực vật, phổ biến là đước đôi (Rhizophora apiculata), đưng (Rhizophora

mucronata), mắm trắng (Avicennia alba), bần (Sonneratia evata), chà là (Phoenix paludosa), dừa nước (Nipa fruticans) [19]

Cùng với sự phục hồi về thảm thực vật rừng, nhiều loài động vật tưởng chừng đã biến mất cùng với sự tàn phá của chiến tranh đã hồi sinh và phát triển lại nhanh chóng ở nơi đây như khỉ, lợn rừng, chồn, trăn, rái cá, trong đó có nhiều loài được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam như Cá sấu hoa cà, Rắn hổ mang chúa Đặc biệt, nhờ có sinh cảnh thuận lợi, các sân chim tự nhiên đã và đang hình thành trở lại với số loài đã chiếm tới 34% tổng số loài chim nước ở Việt Nam, trong đó có tới 9 loài quí hiếm được ghi trong Sách Đỏ Thế giới Động vật không xương sống thủy sinh ở rừng ngập mặn Cần Giờ có hơn 700 loài, đặc biệt những loài giáp xác, nhuyễn thể có giá trị kinh tế cao Trong rừng Cần Giờ có 137 loài cá, 40 loài lưỡng thể và bò sát, 130 loài chim, 19 loài thú Rừng ngập mặn thực sự là cầu nối giữa hệ sinh thái thủy vực và hệ sinh thái trên cạn, giữa hệ sinh thái ngập triều và hệ sinh thái ngập nước lợ và lũ sông nước ngọt [19]

Bên cạnh những giá trị về đa dạng sinh học, Cần Giờ còn là nơi lần đầu tiên ở Việt Nam và khu vực Đông Nam Á phát hiện khu mộ cổ chum (trên 300 ngôi), di chỉ có giá trị về nền văn hoá Óc Eo [19]

Ngoài ra, lịch sử phát triển Cần Giờ còn gắn liền với tên tuổi Nguyễn Huệ (chiến thắng trên sông Soài Rạp), Nguyễn Lữ, Trương Định và những chiến công của quân dân trong thời kỳ kháng chiến chống ngoại xâm trong chiến khu Rừng Sác [19]

Những giá trị văn hoá bản địa của cộng đồng người dân nơi đây cũng rất phong phú và mang đậm bản sắc, gắn liền với các lễ hội theo ngành nghề cổ truyền: làng chài thờ Thần Nam Hải (Cá voi); làng rừng, làng nông thờ Hà Bá, Thủy Quan sông rạch [ 19]

Rừng ngập mặn ở đây có những tổ hợp gien đặc biệt có thể sống và phát triển tốt trong điều kiện nước mặn, ngập nước triều mà các loại cây khác không thể sống được Tuy là rừng trồng nhưng rừng ngập mặn Cần Giờ đạt được hệ sinh thái giống như rừng tự nhiên Một ưu thế nữa là rừng ngập mặn Cần Giờ nằm trong một thành phố công nghiệp đông dân cư, rất thuận lợi để phát triển du lịch, giáo dục, hợp tác quốc tế vô cùng thuận lợi [5]

2.1.4 Vai trò của khu dự trữ sinh quyển

Các khu dự trữ sinh quyển là đại diện mẫu của các hệ sinh thái trên Trái đất, là phòng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh thái, đem lại lợi ích cho người dân địa phương và Quốc tế [5]

Hiện nay trên thế giới có 459 khu dự trữ sinh quyển thuộc 97 nước [5] Khu dự trữ sinh quyển có các chức năng sau:

 Bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn địa dạng cảnh quan, hệ sinh thái loài và vốn gien di truyền

 Phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế dựa trên cơ sở bền vững môi trường và văn hóa

 Trợ giúp: nghiên cứu, giám sát, đào tạo và giáo dục về bảo tồn và phát triển bền vững địa phương, Quốc gia, khu vực và Quốc tế

2.1.5 Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ

Trong chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ bị hủy diệt gần như hoàn toàn do chất độc hóa học của Mỹ Hầu hết các loại cây rụng lá và chết Các loài cây chính của rừng như đước, đưng gần như bị biến mất [19]

Sau chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ được tái sinh theo kế hoạch trồng và phát triển rừng của thành phố Hồ Chí Minh, nhanh chóng trở thành Khu rừng phòng hộ (1991) và Khu dự trữ sinh quyển thế giới (2000) Tuy nhiên hiện nay rừng ngập mặn Cần Giờ đang đứng trước những nguy cơ đe dọa đáng báo động [21]

Việc nghiêm cấm tỉa thưa rừng của Ủy ban Nhân dân thành phố Hồ Chí Minh ban hành (6/1999) làm chất lượng rừng có xu hướng xấu đi, do cạnh tranh không gian, dinh dưỡng và tạo điều kiện cho sâu bệnh phát triển Chiều cao của cây quá cao (với tuổi đời 19 – 27 chiếm đa số), cộng với thiếu ánh sáng nên đường kính thân không cân đối, làm thiệt hại đáng kể đến thu nhập từ nguồn gỗ Mặc khác, việc lưu thông tàu bè đã làm xói lở ven bờ, khói thải, dầu làm ảnh hưởng đến môi sinh Nhiều hộ dân cư vẫn còn sinh sống và sản xuất trong rừng làm ảnh hưởng đến dòng chảy, nguồn nước, tạo các dịch bệnh cho cây rừng Hiện nay đã xuất hiện nhiều sâu

bệnh hại cây rừng, như sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân đe dọa nghiêm trọng đến sự sinh trưởng của cây rừng Thêm vào đó, việc mở con đường Rừng Sác băng qua rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay càng làm tăng thêm mối đe dọa đến môi sinh và sinh thái rừng nghiêm trọng [21] Do đó, việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các loài cây rừng có giá trị để làm tiền đề cho công tác chọn giống, khôi phục rừng đang trở thành một vấn đề cấp bách hiện nay

2.2 Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba)

 Tên Việt Nam: mắm trắng

 Tên Latinh: Avicennia alba

 Vị trí phân loại cây mắm trắng [17]:

2.2.1 Vùng phân bố

Mắm trắng là một nhóm các loài cây rừng ngập mặn phân bổ rộng khắp trên thế giới, trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa lúc triều lên và triều xuống, về phía nam của Bắc chí tuyến, phổ biến ở Rừng Sác Việt Nam (Cà Mau, Cần Giờ) Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Philippin, Malaixia, Inđônexia, Nouvelle Guinee, Saloman, Caroline [15]

(Superrgnum): Eukarya Giới (regnum): Plantae

Ngành (divisio): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Lamiales

Họ (familia): Acanthaceae hay Avicenniaceae

Chi (genus): Avicennia

Loài (species): Avicennia alba

2.2.2 Hình thái học cây mắm trắng

Hình dạng: Thân gỗ, có thể cao đến 20 m, đường kính 0,5 m, thân ít khi

thẳng, với nhiều cành nhánh cong queo, chỉ khá thẳng khi mọc lẫn với rừng đước

(Rhizophora apiculata), vỏ nâu dợt đến xám đen, tròn, nhiều nốt bần [17]

Hình 2.2 Cây mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ

Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến hình mác, thuôn, bầu dục, dài 5 – 7 cm, rộng từ

2,5 – 3 cm, đầu nhọn có khi tù, chân nêm, mặt dưới phủ lông màu trắng bạc, gân bên nổi rõ cả hai mặt, có tuyến tiết muối thưa ở cả mặt dưới và mặt trên, lá khô có màu đen ở mặt trên [17]

Hoa: nhỏ 5 – 8 mm, vàng cam, tạo thành tán - gié ở ngọn, hoa từng cặp, lá

bắc nhỏ, không cọng, đài ngắn, không rụng, 5 tai đài hình bầu dục, có 2 lõm, đài bằng nhau, vành đứng hình ống thẳng có 4 thùy bằng nhau, 4 tiểu nhị (2 dài, 2 ngắn), tua nhị ngắn và trơn, bao phấn có buồng song song, hình bầu dục, bầu nhụy hình bầu dục, hơi mịn ở đầu, có nhựa thơm, 4 tiểu noãn tròn dài gắn ở đầu 1 trục, vòi nhụy rất ngắn 1 mm, trơn đầu chẻ đôi [17]

Hình 2.3 Lá và hoa cây mắm trắng

Trái: Trái là manh nang hình tim, phồng

lên ở một bên làm mũi trái cong qua 1 bên, dài 2 cm, vỏ dày lông mịn, xanh lục, 1 hột, không phôi nhũ, chồi mầm mọc bên trong vỏ trước khi trái rụng với 2 lá mầm xanh, dày, trục rễ mầm có nhiều lông trắng [17]

Hình 2.4 Trái mắm trắng

Nơi sống: Mắm trắng là loại cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh, thích nghi với

nhiều loại đất (bùn, cát, sét) và các độ mặn của nước (mặn, lợ, ngọt) Mắm trắng là loài cây cho chồi gốc, thường trổ hoa vào đầu mùa mưa (tháng 4 – 6 dương lịch), cho trái vào cuối mùa mưa (tháng 9 – 11 dương lịch) Chỉ vài giờ sau khi trái rụng, cây mầm bên trong hút nước lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài và phát triển thành cây mới Mắm trắng thường chiếm những diện tích mới bồi ven biển, nơi có mực thủy triều lên xuống hàng ngày Nói chung "Ðất bùn có nước triều lên xuống hàng ngày" là đất sinh trưởng, phát triển thích hợp của loài cây gỗ này [15]

2.2.3 Giá trị kinh tế của cây mắm trắng

Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi Rễ phổi có nhiệm vụ hấp thụ dưỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn Rễ phổi cũng là "kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi [15]

Gỗ cây mắm trắng trước đây dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi Ngày nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc biến chế dược liệu và cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da Vì thiếu nguồn cây giống để trồng bảo vệ ven biển và đất bồi, một số nước đã có lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm, đước và vẹt [17]

Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm ở lợi ích trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trường sống cho sinh vật ven biển Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đước là thành phần chính của rừng ngập mặn có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven là nơi nuôi dưỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao.Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ (riêng Cà Mau vài km²/năm) [15]

2.2.4 Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ

Trong tương lai gần quần thể mắm trắng tại Cần Giờ sẽ lâm vào tình trạng nguy cấp do khai thác bừa bãi quá mức, không có kế hoạch, chặt cây phá rừng lấy đất làm đầm nuôi tôm và sản xuất nông nghiệp khác [16]

Bên cạnh đó việc phá rừng, phóng đường đã và đang gây nhiều ảnh hưởng đến diện tích và môi sinh của cây mắm trắng Do đó mặc dù diện tích rừng và trữ lượng cây rất lớn nhưng lại bị giảm sút nhanh chóng và ngày càng nghiêm trọng, mức độ đe dọa: bậc V [16] Do đó các nghiên cứu về đa dạng di truyền trên các cây rừng ngập mặn nói chung và cây mắm trắng nói riêng rất được chú trọng đầu tư và khuyến khích thực hiện

2.2.5 Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng

Những nghiên cứu trên cây mắm trắng chủ yếu được thực hiện ở trong nước ta, nguyên nhân có thể là do mắm trắng không phải là quần thể thực vật tiên phong chính tại các rừng ngập mặn khác trên thế giới (mà thay vào đó là quần thể mắm biển) Tuy vậy những nghiên cứu đã thực hiện chủ yếu là điều tra, khảo sát các đặc điểm sinh lý, tình hình sâu bệnh, ít có những nghiên cứu thực sự ở mức độ phân tử

Một số đề tài nghiên cứu đã thực hiện: Phân bố rễ Mắm trắng trên các vùng

có mức độ ngập triều khác nhau ở Cần Giờ TP Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam, 2006)

2.3 Khái niệm về đa dạng di truyền 2.3.1 Đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002)

Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gien chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường” [8]

2.3.2 Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con người, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lượng cuộc sống của chúng ta [9]

Đa dạng sinh học là một trong những nguồn tài nguyên không thể thay thế được, là cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vượng và bền vững của loài người [22]

2.3.3 Các phân mức về đa dạng sinh học 2.3.3.1 Đa dạng hệ sinh thái

Đây là sự đa dạng bao trùm nhất của đa dạng sinh học

Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và có mối quan hệ tương hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trường

Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh Các nhân tố hữu sinh gồm có nhóm sinh vật tự dưỡng – vật sản xuất sơ cấp (thực vật quang hợp), những sinh vật tiêu thụ sơ cấp (động vật ăn cỏ), những vật tiêu thụ thứ cấp (các động vật ăn thịt), và sinh vật phân hủy các chất hữu cơ giải phóng các chất vô cơ cung cấp trở lại cho thực vật

Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau của các kiểu quần xã sinh vật Quần xã này được tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nước, khí hậu, địa hình)

Tóm lại, hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao Điều kiện môi trường càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng [9]

2.3.3.2 Đa dạng loài

Sự đa dạng loài bao gồm số loài có trên Trái đất Sự đa dạng này được thể hiện bằng số lượng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định Loài được xác định bởi một trong hai cách:

 Phân loại theo cấu tạo hình thái của loài: xác định theo nhóm cá thể

có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trưng, khác biệt với các nhóm khác Cách phân loại này thường được các nhà phân loại học, sinh học vận dụng để định loại, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới

 Phân loại sinh học loài: là nhóm cá thể có khả năng giao phối với

nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm khác Cách

này được sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hóa và khảo sát các mối quan hệ về gien [8]

Những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế thường phức tạp hơn rất nhiều so với lý thuyết (Rojas, 1992; Stanley, 1992) Một loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt những sự khác nhau theo đặc điểm cấu tạo và hình thái Ngược lại, các phân loài đôi khi giống nhau đến mức tưởng như chúng là các thành viên của cùng một loài Trong thiên nhiên đôi khi cũng tồn tại các loài “đồng hình”, các loài này rất giống nhau về cấu tạo hình thái hay sinh lý nhưng lại cách ly về mặt sinh học và không giao phối được với nhau [8], [22]

Qua đó, ta thấy những nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới được thu thập chưa được biết đến tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết

2.3.3.3 Đa dạng di truyền

Là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài

Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thường bị ảnh hưởng bởi những tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối được với nhau tạo ra con lai hữu thụ Trong loài có thể bao gồm một hay nhiều quần thể

Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gien khác nhau Sự đa dạng về bộ gien này là do các cá thể có các gien khác nhau, dù chỉ là rất ít Gien là đơn vị di truyền cùng với nhiễm sắc thể đặc trưng cho những protein riêng biệt

Những hình thái khác nhau của gien được thể hiện bằng những alen và những khác biệt do sự đột biến Những alen khác nhau của một gien có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau

Những sự khác biệt về gien trong di truyền học được tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gien và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các

gien trong quá trình sinh sản Các gien trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới được thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái

Tổng các gien và alen trong một quẩn thể là vốn gien của quần thể và những tổ hợp của các alen mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu di truyền (genotype) Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể được biểu hiện đặc trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trường nhất định

Số lượng khác biệt nhau về gien trong một quần thể được xác định bởi số gien trong vốn gien đó, thường mỗi gien có nhiều hơn một alen (các gien đa hình) và số các alen cho mỗi một gien đa hình Sự tồn tại của các gien đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gien dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận được những alen khác nhau từ các gien của mỗi bố mẹ Sự khác biệt về gien cho phép các loài thích ứng được với sự thay đổi của môi trường [9], [22]

2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam

Việt Nam là một trong mười nước có hệ sinh thái phong phú nhất trên thế giới Việt Nam có khoảng 10 % số loài sinh vật của thế giới Song sự đa dạng này đang bị đe dọa vì môi trường sống bị hủy hoại bởi tình hình tăng dân số, việc xây dựng đập nước và đường xá cũng như việc mở rộng các hoạt động công nghiệp Tình trạng tăng dân số và đô thị hoá đang gây sức ép đối với năng lực bảo vệ môi trường

Mặc dù diện tích che phủ của rừng đã tăng lên, song mối quan tâm thực sự là vấn đề chất lượng Một nửa số rừng nguyên sinh đã bị mất Hiện có 700 loài sinh vật nằm trong danh sách các loài có nguy cơ tuyệt chủng Mức độ ô nhiễm thường xuyên vượt quá mức độ cho phép, và riêng mức độ bụi ở các khu đô thị ít nhất cũng cao gấp đôi so với tiêu chuẩn tối đa Vì vậy mà các loài sinh vật bị tiêu diệt dần và một số loài có nguy cơ tuyệt chủng, làm ảnh hưởng xấu đến đa dạng sinh học [8]

2.4 Phương pháp chiết tách DNA thực vật

DNA thực vật là nguyên liệu quan trọng trong những nghiên cứu đa dạng sinh học [6] Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số như quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997) Mỗi phương pháp đều có ưu và khuyết điểm riêng Chúng ta có thể dựa vào đối tượng cũng như yêu cầu về chất lượng, số lượng DNA cần thu để chọn phương pháp cho thích hợp Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phương pháp tách chiết thích hợp Mục đích cuối cùng là để thu được DNA tinh khiết cho những phân tích tiếp theo [2], [12], [14]

Quy trình chiết tách gồm 3 bước cơ bản sau:

 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân Mô được nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl, CTAB) và proteinase (proteinase K) Hỗn hợp này có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nước) Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform và phenol, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein mà không hòa tan nucleic acid Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol chloroform Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại

 Bước 3: Tủa nucleic acid Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu.Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.5.1 Khái niệm

Kỹ thuật PCR được nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 Đây là phương pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một

cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq DNA polymerase từ một

lượng DNA mẫu rất nhỏ Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được thu nhận từ DNA mẫu [8]

2.5.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR

DNA mẫu:

Được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau DNA thực vật thường được ly trích từ mô lá, DNA động vật được ly trích từ máu, lông, mô

Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao Tuy nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết

Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 10 – 50 ng DNA thuần khiết [1] Nồng độ DNA có thể xác định được dựa vào chỉ số đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260 nm và 280 nm Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức :

DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Trong đó:

 OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 260nm  OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 280nm  n: Độ pha loãng (thường n = 100)

Primer (mồi):

Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR Nếu primer được thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ được khuếch đại chính xác [2]

Cặp primer là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F – primer (mồi xuôi) và R – Primer (mồi ngược)

dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP):

Gồm dATP, dCTP, dTTP, dGTP được sử dụng với nồng độ như nhau

Dung dịch buffer:

Tạo môi trường thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động

Taq DNA polymerase:

Là một loại enzyme polymerase bền với nhiệt, cô lập từ vi khuẩn Thermus

aquaticus sống ở suối nước nóng, có vai trò kéo dài đoạn DNA cần khuếch đại Ion kim loại Mg++:

Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động

2.5.3 Nguyên tắc của phản ứng PCR

Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR

Nguyên lý kỹ thuật PCR

Từ 30 – 40 chu kỳ Bước 1: Biến tính

Bước 2: Bắt cặp

Bước 3: Nối dài

Phản ứng PCR được thực hiện qua 30 - 40 chu kỳ Mỗi chu kỳ bao gồm các bước: biến tính DNA, bắt cặp, kéo dài [7]

Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép được tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 - 960 C)

Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ này phụ thuộc vào primer nhưng thường là 50 - 560 C)

Kéo dài: Kéo dài dây mới nhờ primer dưới sự thực hiện của Taq DNA

Trong nghiên cứu genomic: multiplex PCR

Trong nghiên cứu y học: Phát hiện, chẩn đoán được nhiều loại bệnh do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng gây ra

Trong nông nghiệp: Chọn lọc giống cây trồng nhờ chỉ thị DNA (MAS), kiểm tra kết quả chuyển gien [8]

2.5.5 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR

Ưu điểm của kỹ thuật PCR

 Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA là có thể thực hiện  Độ nhạy rất cao

 Thao tác đơn giản

 Thời gian thực hiện nhanh

 Độ tinh sạch của mẫu không cần cao  Lượng mẫu cần ít

Nhược điểm của kỹ thuật PCR [1], [7]

 Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dương tính giả Trong một số trường hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính

 Kích thước của đoạn khuếch đại bị giới hạn Phản ứng PCR chỉ cho kết quả tốt khi thực hiện với những đoạn DNA có kích thước dưới 1,5 kb Với những đoạn có kích thước trên 3kb, phản ứng PCR tỏ ra vô hiệu

 Sự sao chép bởi Taq DNA polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (đến 10-4, nghĩa là cứ khoảng 10000 nucleotid thì enzyme có thể gắn sai một nucleotid)

2.6 Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền

Nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở thực vật nói riêng và ở sinh vật nói chung nằm ở thứ tự các bộ ba trên phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của chúng Hiếm có các cá thể trong cùng một loài hoặc cùng một giống có thứ tự các bộ ba trên DNA trong bộ gien giống hệt nhau Việc xác định tính đa dạng sinh học cực kì quan trọng trong chọn giống vì các vật liệu di truyền dùng để lai tạo thường được đòi hỏi có tính đa dạng càng lớn càng tốt [8]

Để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các cá thể, quần thể về căn bản người ta thường dựa trên các chỉ thị DNA Chỉ thị DNA có thể được chia làm hai nhóm:

 Nhóm không dựa trên PCR (non PCR-based): RFLP

 Nhóm dựa trên PCR (PCR-based): SSCP, SSR, RAPD, AFLP Các phương pháp này đều sử dụng sản phẩm DNA đã được chiết tách, tinh sạch từ khâu ly trích

2.6.1 Nhóm không dựa trên PCR

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Là phương pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy

các băng DNA hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước Ngược lại nếu có sự khác nhau về trình tự DNA (khác giống hoặc do đột biến) thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA

Phương pháp tiến hành: DNA sau khi tách chiết được phân cắt bằng một enzyme nhất định, rồi chạy điện di, lúc này các đoạn DNA tách riêng ra với nhau tùy theo kích thước của nó chạy trên gel agarose Những đoạn DNA này được chuyển từ gel sang một thể rắn (tấm lọc nitrocellulose hoặc màng lọc bằng nylon), nơi nó bị cố định Sau giai đoạn trước khi lai DNA, người ta cố định các vị trí trên màng, nơi quá trình lai DNA sẽ xảy ra Các DNA (gien liên kết với marker) sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (probe, hay RFLP marker) được đánh dấu bằng phóng xạ Quá trình lai giữa DNA và probe như vậy được gọi là lai DNA Sau khi lai, tấm lọc hay màng lọc được rửa để loại bỏ các probe không gắn, hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu Tiếp sau đó, DNA lai với probe tự ghi trên biểu đồ phát xạ Sau khi điện di, gel được chụp dưới tia cực tím Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục DNA lai với probe sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X – quang Các sọc có tính đa hình (polymorphism) có thể được quan sát để đánh giá [10]

RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhưng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng và chất lượng rất cao Do đó, người ta có xu hướng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase [3], [4], [11]

2.6.2 Nhóm dựa trên PCR

2.6.2.1 SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism)

Người ta đã tìm thấy có sự chuyển dịch của đoạn DNA dạng dây đơn, ngắn, trong điều kiện chưa qua quá trình biến tính DNA thành dây đơn Người ta giả định rằng: sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA là do sự thay đổi ngoại hình của dây đơn (single – strand conformation) Sự thay đổi này làm cho DNA chuyển dịch trên gel, tạo ra thể đa hình [1], [4]

Trong phân tích SSCP, phản ứng chuẩn PCR đã hoàn thành Sản phẩm của PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa và ngâm vào trong nước đá Khi đó hiện tượng snap – back sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp Để tránh hiện tượng đứt gãy cấu trúc thứ cấp, các mẫu phải được xử lý trong điều kiện lạnh Nếu P32

được dùng trong PCR, thì phim chụp X – quang sẽ thể hiện vị trí của DNA trên gel Nếu không, người ta sẽ dùng bạc để nhuộm gel DNA khi nhuộm bằng bạc sẽ nhạy cảm gấp trăm lần nhuộm Ethidium bromide [11]

SSCP marker là công cụ rất mạnh và nhanh, nhưng nó chỉ áp dụng cho việc tìm kiếm thể đa hình của những đoạn phân tử DNA tương đối ngắn SSCP có thể xác định tính chất dị hợp tử của những đoạn phân tử DNA (có cùng trọng lượng phân tử), và nó có thể phân biệt được sự thay đổi của một vài nucleotide nào đó Người ta cho nó là công cụ hữu dụng trong xét nghiệm bệnh di truyền ở người Trong thực vật, SSCP chưa được phát triển nhiều Người ta hi vọng, SSCP marker sẽ giúp cho việc phân nhóm di truyền ở con lai trở nên dễ dàng hơn, khi chúng ta có primer thích hợp đối với tính trạng quan trọng nào đó [11]

2.6.2.2 Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat)

SSR là các trình tự hai nucleotide ((AC)n, (AG)n, (AT)n) hoặc ba nucleotide ((TAT)n, (TCT)n, (CAG)n) lặp lại Do vậy nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự khuếch đại các trình tự lặp lại trên bộ gien bằng các primer đặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai đầu của locus microsatellite Sản phẩm PCR là các đoạn DNA có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về độ dài được tách ra trên gel polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA Do số lần lặp lại cao của microsatellite ở các cá thể nên sự đa hình cao hơn ở các trường hợp khác như RFLP, RAPD và sự đa hình ở các cá thể khác nhau tất nhiên là khác nhau Chiều dài các đoạn DNA qua điện di thường có kích thước 100 – 200 bp Tuy nhiên, SSR thường được phân tích trên DNA hệ gien nhỏ mang trình tự lặp lại và kích thước của chúng được nhận biết sau khi điện di trên gel [4], [11]

SSR được thực hiện theo bốn bước:

 Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu

 Thực hiện phản ứng khuếch đại qua PCR với các primer đặc trưng cho các đoạn lặp đơn giản

 Điện di kết quả trên gel polyacrylamid và tính toán số liệu, xác định mức độ giống và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA

 Xử lý số liệu bằng các phần mềm như Map Marker Program, SYSTAT, NTSYSpc lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại

2.6.2.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP, đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc, do Vos và cộng sự phát minh 1975, là kỹ thuật được áp dụng để phân tích tính đa dạng của sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã được khuếch đại đồng thời nhờ phản ứng PCR [13], [18], [20]

Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản:

 Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adapter đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trưng cho các primer đã chọn trước Adapter là một đoạn oligonucleotide đôi, được tổng hợp nhân tạo và có trình tự tương ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA được phân cắt bởi một loại enzyme nhất định

 Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại primer khác nhau

 Các thành phần tham gia trong phản ứng AFLP:

Các enzyme:

Để cắt DNA của bộ gien, 2 enzyme cắt hạn chế được sử dụng:

 MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 4 base  EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 6 base

Sau phản ứng cắt, có ba loại đoạn DNA thu nhận được: một loại đoạn DNA

được cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu kết thúc, một loại đoạn DNA được cắt bởi EcoRI ở một đầu kết thúc này và MseI ở đầu kết thúc khác, và một loại đoạn DNA được cắt bởi MseI ở cả hai đầu kết thúc [13]