3.2.1. Mẫu thực vật
Địa điểm lấy: Mẫu đƣợc lấy tại một số tiểu khu của Khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ.
Cách lấy mẫu: Lấy mẫu theo hai đƣờng chéo của rừng, một theo đƣờng bộ
và một theo đƣờng sông. Lấy theo khoảng cách, khoảng 1 km lấy một mẫu, ghi nhận các đặc tính hình thái (thân cây to, mọc khỏe hoặc yếu ớt, các cây có khối u, hình dáng dị thƣờng) và tọa độ vị trí nơi lấy mẫu bằng máy định vị GPS.
Chọn những lá tƣơi tốt, còn non, thƣờng là phần ngọn của các cành. Lấy 8 – 10 lá trên mỗi cây. Kí hiệu cho mẫu theo kiểu AAxx
Trong đó: AA: tên loài (Avicennia alba) và xx: số thứ tự.
Bảo quản và vận chuyển mẫu: Lá đƣợc cho vào bịch nylon, buộc kín miệng,
bảo quản tạm thời trong thùng xốp lạnh, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản.
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm
3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA
HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA
CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol)
Phá vỡ màng tế bào, màng nhân
Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC
Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp
Dung dịch gốc
Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng
Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate
Dung dịch gốc
Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm
Dung dịch gốc
Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Dung dịch gốc Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol)
Gắn nối các ion hóa trị II (Mg++, Ca++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++ Pha 100ml: - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp 121oC/20phút trƣớc khi dùng.
NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA Pha 100ml: - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng.
TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml: - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng.
TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X +
90ml nƣớc cất 2 lần EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml:
- 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt).
- Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4o C, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20o
C Pha 100ml: - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng RNase (Ribonuclease) (10%, w/v)
Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích Pha 1ml: - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4o C, tránh ánh sáng trực tiếp. Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc
PVP (polyvinylpyrrolydol) Biến tính các hợp chất phenol
Dạng bột, sử dụng 2g PVP, thêm vào thành phần của dịch trích EB
3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA
Nƣớc cất 2 lần khử ion TE 1X
TAE 0,5 X Loading dye 6X Ethidium bromide
3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD
Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV dNTP 25mM (Promega)
Buffer free Mg2+ 10X (Promega) MgCl2 25mM (Promega)
Taq DNA Polymerase 5U (Promega)
Primer: Sử dụng 7 primer có trình tự và Tm nhƣ sau: Primer OPAC10 _ 5’AGC AGC GAG G3’, Tm = 34 Primer 1 (OPA02) _ 5’TGC CGA GCT G3’, Tm = 40,7 Primer 2 (OPA03) _ 5’AGC CAG CCA C3’, Tm = 34,3 Primer 9 (OPN03) _ 5’GGT ACT CCC C, Tm = 33,9 Primer OPA05 _ 5’AGG GGT CTT G3’, Tm = 34,2 Primer OPA10 _ 5’GTG ATC GCA G3’, Tm=30,7 Primer RAH8 _ 5’GAG AGC CAA C 3’, Tm = 31,9
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Chén sứ và chày giã (Đức) Máy Vortex (IKA - Đức) Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh)
Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) Tủ sấy (Jencons-Anh)
Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) Bồn điện di (Biorad)
Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) Lò Viba (Electrolux)
Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển) Đầu típ các loại (Đức)
Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) Máy PCR (PTC 100 - MJ)
Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) Pipet các loại (Nichiryo - Nhật Bản)
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA
Chúng tôi đã tiến hành thực hiện ly trích DNA theo các quy trình sau:
Quy trình 1: Theo quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) nhƣng
không sử dụng Rnase. Gồm 11 bƣớc:
Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào cối, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650C trong 45 phút.
Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), vortex 10 phút, ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100
C.
Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.
Bƣớc 4: Thêm 300 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm. Bƣớc 5: Li tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100C.
Bƣớc 6: Thêm vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút
Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để – 200C trong 60 phút.
Bƣớc 8: Li tâm 14.000 vòng/10 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 14.000 vòng/2 phút ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
Quy trình 2: Cải tiến quy trình của Doyle: thay đổi thời gian và số vòng ly tâm,
thời gian ủ, trọng lƣợng mẫu.
Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá đã rửa sạch, lau khô. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng/phút). Ủ ở 650
C trong 60 phút.
Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), đảo nhẹ vài lần, li tâm 10.000 vòng/20 phút ở 100
C.
Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. Thu đƣợc V l dịch nổi. Bƣớc 4: Thêm V l dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm. Bƣớc 5: Li tâm 8.000 vòng/20 phút ở 100C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và ủ – 200C trong 60 phút.
Bƣớc 8: Li tâm 8.000 vòng/15 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 6.000 vòng/5 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 40C.
Quy trình 3: Cải tiến quy trình 2, bổ sung PVP 2% vào dịch trích EB.
Quy trình 4: Cải tiến quy trình 3, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền mẫu
trong dích trích EB, tăng số vòng vortex.
Bƣớc 1: Cân 0,4 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong N2 lỏng, cho vào eppendorf.
Bƣớc 2: Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đều cho đến khi hỗn hợp có màu đồng nhất ở 14.000 vòng/phút trong khoảng 1 phút. Ủ ở 650C trong 1 giờ.
Bƣớc 4: Thêm V Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 10.000 vòng trong 20 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
Bƣớc 5: Lập lại bƣớc 4.
Bƣớc 6: Thêm 300 µl Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ - 200C qua đêm. Bƣớc 7: Ly tâm 8.000 vòng trong 15 phút. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa. Bƣớc 8: Thêm 300 l TE 1X, đem ủ ở 370C trong 30 phút. Thêm 20 l Sodium acetate 3M và 64 l Ethanol 100%, trộn đều, đem ủ - 200C trong 1 giờ.
Bƣớc 9: Li tâm 15 phút, 8.000 vòng ở 40C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút 6.000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút, bảo quản mẫu ở - 200C.
3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích
3.3.2.1 Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel
Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 400 mA trong 20 phút.
Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA.
Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các băng trên gel [6], [7].
3.3.2.2 Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Hàm lƣợng DNA trong mẫu ly trích đƣợc tính theo công thức sau: DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n
Trong đó:
OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm
n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100) Cách tiến hành:
Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X. Hút 20 l dung dịch DNA cho vào Curvette, hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Tiến hành đo OD [7].
3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD
Nhằm tìm ra quy trình chạy RAPD phù hợp và tối ƣu cho cây mắm trắng, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng RAPD trên 2 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình phản ứng RAPD trên 2 nghiệm thức
Sử dụng primer OPAC10 và primer 1
Mục đích: Khảo sát quy trình RAPD – PCR trên cây mắm trắng Chỉ tiêu đánh giá: Các băng DNA trên gel điện di
Nghiệm thức 1: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Lâm Vỹ
Nguyên, 2006 theo bảng 2.1 và 2.2 nhƣ sau:
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM
dNTP 10 mM 0,25 l 100 M
Primer 100 pmol/ l 6,5 l 26 pmol/ l
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U
DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng
H2O 12,05 l
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1
Số chu kì Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 3 40 94 1 Ta 1 72 2 1 72 15 Hold 40 C Trong đó: Ta(OPAC10) = 36 và Ta(primer1) = 38
Nghiệm thức 2: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Nguyễn
Hồng Phong, 2007 (Kết quả chƣa công bố) theo bảng 2.3 và 2.4 nhƣ sau :
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
MgCl2 25 mM 3 l 3 mM
dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM
Primer 100 M 0,3 l 1,2 M
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U
DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng
H2O 17,8 l
Tổng thể tích phản ứng 25 l
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
40 94 30 s Ta 30 s 72 1 phút 1 72 5 Hold 40 C Trong đó: Ta (OPAC10) = 36 và Ta (primer1) = 38
Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng cho sản phẩm khuếch đại của các primer.
Sử dụng 5 primer OPA05, OPA10, RAH8, primer 9, primer 2 Điều kiện thí nghiệm nhƣ ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1. Trong đó : Ta (OPA05) = 36 Ta (OPA10) = 34 Ta (primer2) = 36 Ta (primer9) = 36 Ta (primerRAH8) = 34
2.3.4 Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1
Nguyên tắc của phần mềm là dựa trên sự có mặt hay không của các băng DNA quan tâm trên gel điện di dƣới dạng mã hóa theo ma trận với các thông số 0 và 1 (0: không có băng, 1: có băng). Phần mềm sẽ xử lý và xây dựng nên cây phân nhóm di truyền, qua đó ta có thể quan sát đƣợc mức độ gần gũi hay xa cách về mặt di truyền giữa những bộ gel nghiên cứu.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ
Trong công tác thu thập mẫu, chúng tôi gặp nhiều trở ngại trong việc tìm kiếm những mẫu có đặc tính khác nhau, có hình dáng khác lạ hoặc đặc tính đặc biệt nhƣ trong dự kiến đã đề ra. Một trong những nguyên nhân chính của vấn đề này là do việc đi lại trong rừng rất hạn chế bởi những vùng đất lún hoặc ngập nƣớc, vì thế chúng tôi chƣa thể đi sâu để tìm những mẫu này.
Trong thời gian tiến hành đề tài, chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng phân bố theo hai đƣờng chéo của rừng ngập mặn Cần Giờ, một chạy dọc theo đƣờng bộ và một chạy theo đƣờng sông.
Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.
Trong những mẫu đã thu thập, cho thấy công tác thu thập mẫu trải rộng trên nhiều tiểu khu. Do đó, mặc dù số lƣợng mẫu chỉ là 50 nhƣng nó cũng mang đƣợc tính đại diện cho quần thể mắm trắng của rừng.
4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu
Sau khi đƣợc đem về phòng thí nghiệm, đầu tiên mẫu đƣợc bảo quản ở 40
C. Kết quả, chỉ sau 2-3 ngày, thấy xuất hiện những dấu hiệu hóa nâu trên lá. Khi lấy mẫu ra khỏi bịch nilon ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, mẫu lập tức hóa nâu và chuyển sang đen. Theo chúng tôi, điều này có thể là do bảo quản mẫu ở điều kiện này, các enzyme trong lá vẫn hoạt động và các hoạt động chuyển hóa trong lá vẫn xảy ra dẫn đến sự hóa nâu của lá.
Thay đổi điều kiện bảo quản ở - 200C, sau 15 – 20 ngày, màu sắc mẫu bắt đầu sậm hơn. Khi lấy mẫu ra ở điều kiện phòng thí nghiệm, mẫu nâu hóa nhẹ sau 5 phút. Nguyên nhân có thể là do khi trữ ở - 200C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá. Ở điều kiện nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Tuy nhiên vẫn có thể tiến hành ly trích DNA trên những mẫu này do mẫu chƣa hóa đen hoàn toàn.
4.3. Kết quả quy trình ly trích DNA tổng số
Ban đầu, khi sử dụng quy trình ly trích 1, kết quả điện di cho thấy phần lớn có nhiều vệt smear trên gel và sản phẩm không mong muốn cũng rất nhiều. Chỉ số đo OD của những mẫu này chỉ từ 1,0 – 1,5. Mặc dù chúng tôi đã cố gắng nghiền nhẹ, đều tay và chuyển sang quy trình 2, giảm số vòng ly tâm và tăng thời gian ly tâm và ủ mẫu ở quy trình 1, nhƣng kết quả vẫn không tốt hơn, tuy vết smear ít hơn nhƣngsản phẩm không mong muốn lại rất nhiều và lƣợng DNA thu đƣợc rất ít, chỉ số OD của những mẫu này cũng chỉ dao động từ 1,1 – 1,6. Điều này cho thấy rằng những mẫu này chƣa đủ tinh sạch để có thể tiến hành cho những phân tích tiếp theo.
Theo chúng tôi điều này có thể là do mắm trắng là cây của vùng ngập mặn, lá mắm trắng có hàm lƣợng muối, polysaccharide và các hợp chất phenol nhiều hơn so với những cây bình thƣờng, do đó việc tiến hành ly trích theo quy trình 1 và 2