3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA
Chúng tôi đã tiến hành thực hiện ly trích DNA theo các quy trình sau:
Quy trình 1: Theo quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) nhƣng
không sử dụng Rnase. Gồm 11 bƣớc:
Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào cối, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650C trong 45 phút.
Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), vortex 10 phút, ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100
C.
Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.
Bƣớc 4: Thêm 300 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm. Bƣớc 5: Li tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100C.
Bƣớc 6: Thêm vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút
Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để – 200C trong 60 phút.
Bƣớc 8: Li tâm 14.000 vòng/10 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 14.000 vòng/2 phút ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
Quy trình 2: Cải tiến quy trình của Doyle: thay đổi thời gian và số vòng ly tâm,
thời gian ủ, trọng lƣợng mẫu.
Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá đã rửa sạch, lau khô. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng/phút). Ủ ở 650
C trong 60 phút.
Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), đảo nhẹ vài lần, li tâm 10.000 vòng/20 phút ở 100
C.
Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. Thu đƣợc V l dịch nổi. Bƣớc 4: Thêm V l dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm. Bƣớc 5: Li tâm 8.000 vòng/20 phút ở 100C. Đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và ủ – 200C trong 60 phút.
Bƣớc 8: Li tâm 8.000 vòng/15 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 6.000 vòng/5 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.
Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 40C.
Quy trình 3: Cải tiến quy trình 2, bổ sung PVP 2% vào dịch trích EB.
Quy trình 4: Cải tiến quy trình 3, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền mẫu
trong dích trích EB, tăng số vòng vortex.
Bƣớc 1: Cân 0,4 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong N2 lỏng, cho vào eppendorf.
Bƣớc 2: Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đều cho đến khi hỗn hợp có màu đồng nhất ở 14.000 vòng/phút trong khoảng 1 phút. Ủ ở 650C trong 1 giờ.
Bƣớc 4: Thêm V Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 10.000 vòng trong 20 phút ở 40C. Thu dịch nổi.
Bƣớc 5: Lập lại bƣớc 4.
Bƣớc 6: Thêm 300 µl Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ - 200C qua đêm. Bƣớc 7: Ly tâm 8.000 vòng trong 15 phút. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa. Bƣớc 8: Thêm 300 l TE 1X, đem ủ ở 370C trong 30 phút. Thêm 20 l Sodium acetate 3M và 64 l Ethanol 100%, trộn đều, đem ủ - 200C trong 1 giờ.
Bƣớc 9: Li tâm 15 phút, 8.000 vòng ở 40C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút 6.000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.
Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút, bảo quản mẫu ở - 200C.
3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích
3.3.2.1 Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel
Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 400 mA trong 20 phút.
Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA.
Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các băng trên gel [6], [7].
3.3.2.2 Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế
Hàm lƣợng DNA trong mẫu ly trích đƣợc tính theo công thức sau: DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n
Trong đó:
OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm
n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100) Cách tiến hành:
Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X. Hút 20 l dung dịch DNA cho vào Curvette, hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Tiến hành đo OD [7].
3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD
Nhằm tìm ra quy trình chạy RAPD phù hợp và tối ƣu cho cây mắm trắng, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng RAPD trên 2 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình phản ứng RAPD trên 2 nghiệm thức
Sử dụng primer OPAC10 và primer 1
Mục đích: Khảo sát quy trình RAPD – PCR trên cây mắm trắng Chỉ tiêu đánh giá: Các băng DNA trên gel điện di
Nghiệm thức 1: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Lâm Vỹ
Nguyên, 2006 theo bảng 2.1 và 2.2 nhƣ sau:
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM
dNTP 10 mM 0,25 l 100 M
Primer 100 pmol/ l 6,5 l 26 pmol/ l
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U
DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng
H2O 12,05 l
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1
Số chu kì Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 3 40 94 1 Ta 1 72 2 1 72 15 Hold 40 C Trong đó: Ta(OPAC10) = 36 và Ta(primer1) = 38
Nghiệm thức 2: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Nguyễn
Hồng Phong, 2007 (Kết quả chƣa công bố) theo bảng 2.3 và 2.4 nhƣ sau :
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
MgCl2 25 mM 3 l 3 mM
dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM
Primer 100 M 0,3 l 1,2 M
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U
DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng
H2O 17,8 l
Tổng thể tích phản ứng 25 l
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
40 94 30 s Ta 30 s 72 1 phút 1 72 5 Hold 40 C Trong đó: Ta (OPAC10) = 36 và Ta (primer1) = 38
Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng cho sản phẩm khuếch đại của các primer.
Sử dụng 5 primer OPA05, OPA10, RAH8, primer 9, primer 2 Điều kiện thí nghiệm nhƣ ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1. Trong đó : Ta (OPA05) = 36 Ta (OPA10) = 34 Ta (primer2) = 36 Ta (primer9) = 36 Ta (primerRAH8) = 34
2.3.4 Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1
Nguyên tắc của phần mềm là dựa trên sự có mặt hay không của các băng DNA quan tâm trên gel điện di dƣới dạng mã hóa theo ma trận với các thông số 0 và 1 (0: không có băng, 1: có băng). Phần mềm sẽ xử lý và xây dựng nên cây phân nhóm di truyền, qua đó ta có thể quan sát đƣợc mức độ gần gũi hay xa cách về mặt di truyền giữa những bộ gel nghiên cứu.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ
Trong công tác thu thập mẫu, chúng tôi gặp nhiều trở ngại trong việc tìm kiếm những mẫu có đặc tính khác nhau, có hình dáng khác lạ hoặc đặc tính đặc biệt nhƣ trong dự kiến đã đề ra. Một trong những nguyên nhân chính của vấn đề này là do việc đi lại trong rừng rất hạn chế bởi những vùng đất lún hoặc ngập nƣớc, vì thế chúng tôi chƣa thể đi sâu để tìm những mẫu này.
Trong thời gian tiến hành đề tài, chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng phân bố theo hai đƣờng chéo của rừng ngập mặn Cần Giờ, một chạy dọc theo đƣờng bộ và một chạy theo đƣờng sông.
Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.
Trong những mẫu đã thu thập, cho thấy công tác thu thập mẫu trải rộng trên nhiều tiểu khu. Do đó, mặc dù số lƣợng mẫu chỉ là 50 nhƣng nó cũng mang đƣợc tính đại diện cho quần thể mắm trắng của rừng.
4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu
Sau khi đƣợc đem về phòng thí nghiệm, đầu tiên mẫu đƣợc bảo quản ở 40
C. Kết quả, chỉ sau 2-3 ngày, thấy xuất hiện những dấu hiệu hóa nâu trên lá. Khi lấy mẫu ra khỏi bịch nilon ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, mẫu lập tức hóa nâu và chuyển sang đen. Theo chúng tôi, điều này có thể là do bảo quản mẫu ở điều kiện này, các enzyme trong lá vẫn hoạt động và các hoạt động chuyển hóa trong lá vẫn xảy ra dẫn đến sự hóa nâu của lá.
Thay đổi điều kiện bảo quản ở - 200C, sau 15 – 20 ngày, màu sắc mẫu bắt đầu sậm hơn. Khi lấy mẫu ra ở điều kiện phòng thí nghiệm, mẫu nâu hóa nhẹ sau 5 phút. Nguyên nhân có thể là do khi trữ ở - 200C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá. Ở điều kiện nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Tuy nhiên vẫn có thể tiến hành ly trích DNA trên những mẫu này do mẫu chƣa hóa đen hoàn toàn.
4.3. Kết quả quy trình ly trích DNA tổng số
Ban đầu, khi sử dụng quy trình ly trích 1, kết quả điện di cho thấy phần lớn có nhiều vệt smear trên gel và sản phẩm không mong muốn cũng rất nhiều. Chỉ số đo OD của những mẫu này chỉ từ 1,0 – 1,5. Mặc dù chúng tôi đã cố gắng nghiền nhẹ, đều tay và chuyển sang quy trình 2, giảm số vòng ly tâm và tăng thời gian ly tâm và ủ mẫu ở quy trình 1, nhƣng kết quả vẫn không tốt hơn, tuy vết smear ít hơn nhƣngsản phẩm không mong muốn lại rất nhiều và lƣợng DNA thu đƣợc rất ít, chỉ số OD của những mẫu này cũng chỉ dao động từ 1,1 – 1,6. Điều này cho thấy rằng những mẫu này chƣa đủ tinh sạch để có thể tiến hành cho những phân tích tiếp theo.
Theo chúng tôi điều này có thể là do mắm trắng là cây của vùng ngập mặn, lá mắm trắng có hàm lƣợng muối, polysaccharide và các hợp chất phenol nhiều hơn so với những cây bình thƣờng, do đó việc tiến hành ly trích theo quy trình 1 và 2 không thể loại hết những hợp chất này. Có thể sự tồn tại các hợp chất này ở hàm lƣợng cao nhƣ vậy trong lá sẽ làm ảnh hƣởng xấu đến tác dụng của các hóa chất
dùng trong ly trích, làm DNA dễ bị tổn hại trong các thao tác vortex hay ly tâm, từ đó dẫn đến việc DNA bị gãy nhiều. Vì các lí do này, chúng tôi đã quyết định sử dụng quy trình 3, bổ sung PVP2% vào thành phần của dịch ly trích EB, với mục đích loại bỏ các hợp chất phenol có trong lá tốt hơn.
Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2.
Kết quả điện di trên gel agarase 1% cho thấy việc sử dụng quy trình 3 làm giảm đáng kể sản phẩm không mong muốn. Chỉ số đo OD của những mẫu này từ 1,6 – 2, có thể sử dụng để thực hiện phản ứng RAPD.
Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3.
Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy quá trình nghiền mẫu trong dịch trích EB có một số hạn chế là tốn nhiều thời gian, công sức và cho kết quả không ổn định, còn phụ thuộc nhiều vào thao tác nghiền mẫu. Ngoài ra thao tác nghiền phải đƣợc tiến hành trong các tủ hút để tránh sự khuếch tán của Mercaptro ethanol vào không khí sẽ gây ra mùi khó chịu và gây nhều tác dụng xấu nếu nhƣ hít phải. Đồng thời, nhằm thu đƣợc những mẫu DNA tinh sạch hơn với độ tin cậy cao hơn, chúng tôi quyết
Nhiều vết smear trên
định tiếp tục thử nghiệm quy trình 4, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền trong EB và sử dụng các bƣớc tiếp theo giống nhƣ quy trình 3.
Hình 4.4. Kết quả ly trích theo quy trình 4
Kết quả đạt đƣợc tốt hơn hẳn. Kết quả điện di ở hình 3.5 cho thấy việc gãy DNA đã giảm xuống, các băng DNA dày và sáng. Chỉ số đo OD từ 1,75 – 2,2. Những mẫu này đáp ứng đựoc các yêu cầu về độ tinh sạch, và có thế đƣợc dùng cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền.
Nhƣ vậy việc nghiền mẫu trong N2 tỏ ra hiệu quả hơn nhiều so với nghiền trong dịch trích EB là không cần phải nghiền trong tủ hút, lá dễ nghiền hơn do đã khô cứng và giòn trong N2 lỏng. Ngoài ra mẫu có thể nghiền mạnh tay mà không sợ làm gãy DNA, kết quả thu đƣợc tốt hơn, tốn ít thời gian và công sức hơn.
Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định tiến hành ly trích DNA theo quy trình cải tiến (đƣợc chỉ rõ ở sơ đồ 3.1) để lấy nguyên liệu cho phân tích RAPD.
Hình 4.5 Kết quả ly trích theo quy trình 4
36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4
Đây là một quy trình ổn định và có độ tin cậy, vấn đề còn lại chỉ là thao tác hút dịch trong sau mỗi lần ly tâm đòi hỏi phải cẩn thận, tránh hút vào lớp ngăn cách giữa 2 pha. Chúng tôi tiến hành ly trích 48 mẫu lá mắm trắng, kết quả thu đƣợc 40 mẫu cho băng DNA rõ nét, 6 mẫu cho băng DNA mờ (mẫu ở vị trí 1,2,3,4,19,33) và 2 mẫu cho băng DNA rất mờ ( mẫu số 31 và 50), đạt tỉ lệ 83%. Với kết quả này, các mẫu thu đƣợc hoàn toàn có thể thực hiện phản ứng RAPD.
4.4. Kết thực hiện phản ứng RAPD 4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 Nghiệm thức 1: Nghiền 0,4 g lá trong N2 lỏng thành bột mịn Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex kĩ, ủ 650C/1 giờ Thêm 1V hỗn hợp CIA, đảo đều. Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu V’ dịch trong Thêm V’ hỗn hợp
CIA, đảo đều. Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu dịch trong. Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1:1, ủ ở - 200C qua đêm Ly tâm 9.000 vòng/20 phút/40C, đổ bỏ dịch trong, thu tủa Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/ 40 C, thu V dịch nổi. Thêm 300µl TE1X, ủ 370C/30 phút. Thêm 20 µl Sodium acetate và 640 µl Ethanol 100%, đem ủ -200C/1 giờ Ly tâm 8.000/20 phút/40C. Đổ bỏ dịch trong, thu tủa.
Rửa cặn với 300 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút/6.000 vòng Lặp lại bƣớc 10, làm
khô tủa DNA trong không khí.
Hòa tan tủa trong 100 µl TE1X, ủ ở 370C/30 phút. Bảo quản ở -200C
Sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với thành phần các chất và chu kì nhiệt đã nêu ở bảng 2.1 và 2.2 để thực hiện phản ứng RAPD, chúng tôi thu đƣợc kết quả là không có băng nào trên gel điện di, nhƣ thể hiện ở hình 3.6
Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1
Trong nghiệm thức này, chúng tôi đã sử dụng quy trình phân tích RAPD của Lâm Vỹ Nguyên, 2006 cho cây đƣớc. Mặc dù với quy trình này, Lâm Vỹ Nguyên