Nhằm tìm ra quy trình chạy RAPD phù hợp và tối ƣu cho cây mắm trắng, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng RAPD trên 2 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình phản ứng RAPD trên 2 nghiệm thức
Sử dụng primer OPAC10 và primer 1
Mục đích: Khảo sát quy trình RAPD – PCR trên cây mắm trắng Chỉ tiêu đánh giá: Các băng DNA trên gel điện di
Nghiệm thức 1: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Lâm Vỹ
Nguyên, 2006 theo bảng 2.1 và 2.2 nhƣ sau:
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM
dNTP 10 mM 0,25 l 100 M
Primer 100 pmol/ l 6,5 l 26 pmol/ l
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U
DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng
H2O 12,05 l
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1
Số chu kì Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)
1 94 3 40 94 1 Ta 1 72 2 1 72 15 Hold 40 C Trong đó: Ta(OPAC10) = 36 và Ta(primer1) = 38
Nghiệm thức 2: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Nguyễn
Hồng Phong, 2007 (Kết quả chƣa công bố) theo bảng 2.3 và 2.4 nhƣ sau :
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10X 2,5 l 1X
MgCl2 25 mM 3 l 3 mM
dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM
Primer 100 M 0,3 l 1,2 M
Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U
DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng
H2O 17,8 l
Tổng thể tích phản ứng 25 l
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
40 94 30 s Ta 30 s 72 1 phút 1 72 5 Hold 40 C Trong đó: Ta (OPAC10) = 36 và Ta (primer1) = 38
Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng cho sản phẩm khuếch đại của các primer.
Sử dụng 5 primer OPA05, OPA10, RAH8, primer 9, primer 2 Điều kiện thí nghiệm nhƣ ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1. Trong đó : Ta (OPA05) = 36 Ta (OPA10) = 34 Ta (primer2) = 36 Ta (primer9) = 36 Ta (primerRAH8) = 34
2.3.4 Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1
Nguyên tắc của phần mềm là dựa trên sự có mặt hay không của các băng DNA quan tâm trên gel điện di dƣới dạng mã hóa theo ma trận với các thông số 0 và 1 (0: không có băng, 1: có băng). Phần mềm sẽ xử lý và xây dựng nên cây phân nhóm di truyền, qua đó ta có thể quan sát đƣợc mức độ gần gũi hay xa cách về mặt di truyền giữa những bộ gel nghiên cứu.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ
Trong công tác thu thập mẫu, chúng tôi gặp nhiều trở ngại trong việc tìm kiếm những mẫu có đặc tính khác nhau, có hình dáng khác lạ hoặc đặc tính đặc biệt nhƣ trong dự kiến đã đề ra. Một trong những nguyên nhân chính của vấn đề này là do việc đi lại trong rừng rất hạn chế bởi những vùng đất lún hoặc ngập nƣớc, vì thế chúng tôi chƣa thể đi sâu để tìm những mẫu này.
Trong thời gian tiến hành đề tài, chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng phân bố theo hai đƣờng chéo của rừng ngập mặn Cần Giờ, một chạy dọc theo đƣờng bộ và một chạy theo đƣờng sông.
Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.
Trong những mẫu đã thu thập, cho thấy công tác thu thập mẫu trải rộng trên nhiều tiểu khu. Do đó, mặc dù số lƣợng mẫu chỉ là 50 nhƣng nó cũng mang đƣợc tính đại diện cho quần thể mắm trắng của rừng.
4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu
Sau khi đƣợc đem về phòng thí nghiệm, đầu tiên mẫu đƣợc bảo quản ở 40
C. Kết quả, chỉ sau 2-3 ngày, thấy xuất hiện những dấu hiệu hóa nâu trên lá. Khi lấy mẫu ra khỏi bịch nilon ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, mẫu lập tức hóa nâu và chuyển sang đen. Theo chúng tôi, điều này có thể là do bảo quản mẫu ở điều kiện này, các enzyme trong lá vẫn hoạt động và các hoạt động chuyển hóa trong lá vẫn xảy ra dẫn đến sự hóa nâu của lá.
Thay đổi điều kiện bảo quản ở - 200C, sau 15 – 20 ngày, màu sắc mẫu bắt đầu sậm hơn. Khi lấy mẫu ra ở điều kiện phòng thí nghiệm, mẫu nâu hóa nhẹ sau 5 phút. Nguyên nhân có thể là do khi trữ ở - 200C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá. Ở điều kiện nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Tuy nhiên vẫn có thể tiến hành ly trích DNA trên những mẫu này do mẫu chƣa hóa đen hoàn toàn.
4.3. Kết quả quy trình ly trích DNA tổng số
Ban đầu, khi sử dụng quy trình ly trích 1, kết quả điện di cho thấy phần lớn có nhiều vệt smear trên gel và sản phẩm không mong muốn cũng rất nhiều. Chỉ số đo OD của những mẫu này chỉ từ 1,0 – 1,5. Mặc dù chúng tôi đã cố gắng nghiền nhẹ, đều tay và chuyển sang quy trình 2, giảm số vòng ly tâm và tăng thời gian ly tâm và ủ mẫu ở quy trình 1, nhƣng kết quả vẫn không tốt hơn, tuy vết smear ít hơn nhƣngsản phẩm không mong muốn lại rất nhiều và lƣợng DNA thu đƣợc rất ít, chỉ số OD của những mẫu này cũng chỉ dao động từ 1,1 – 1,6. Điều này cho thấy rằng những mẫu này chƣa đủ tinh sạch để có thể tiến hành cho những phân tích tiếp theo.
Theo chúng tôi điều này có thể là do mắm trắng là cây của vùng ngập mặn, lá mắm trắng có hàm lƣợng muối, polysaccharide và các hợp chất phenol nhiều hơn so với những cây bình thƣờng, do đó việc tiến hành ly trích theo quy trình 1 và 2 không thể loại hết những hợp chất này. Có thể sự tồn tại các hợp chất này ở hàm lƣợng cao nhƣ vậy trong lá sẽ làm ảnh hƣởng xấu đến tác dụng của các hóa chất
dùng trong ly trích, làm DNA dễ bị tổn hại trong các thao tác vortex hay ly tâm, từ đó dẫn đến việc DNA bị gãy nhiều. Vì các lí do này, chúng tôi đã quyết định sử dụng quy trình 3, bổ sung PVP2% vào thành phần của dịch ly trích EB, với mục đích loại bỏ các hợp chất phenol có trong lá tốt hơn.
Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2.
Kết quả điện di trên gel agarase 1% cho thấy việc sử dụng quy trình 3 làm giảm đáng kể sản phẩm không mong muốn. Chỉ số đo OD của những mẫu này từ 1,6 – 2, có thể sử dụng để thực hiện phản ứng RAPD.
Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3.
Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy quá trình nghiền mẫu trong dịch trích EB có một số hạn chế là tốn nhiều thời gian, công sức và cho kết quả không ổn định, còn phụ thuộc nhiều vào thao tác nghiền mẫu. Ngoài ra thao tác nghiền phải đƣợc tiến hành trong các tủ hút để tránh sự khuếch tán của Mercaptro ethanol vào không khí sẽ gây ra mùi khó chịu và gây nhều tác dụng xấu nếu nhƣ hít phải. Đồng thời, nhằm thu đƣợc những mẫu DNA tinh sạch hơn với độ tin cậy cao hơn, chúng tôi quyết
Nhiều vết smear trên
định tiếp tục thử nghiệm quy trình 4, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền trong EB và sử dụng các bƣớc tiếp theo giống nhƣ quy trình 3.
Hình 4.4. Kết quả ly trích theo quy trình 4
Kết quả đạt đƣợc tốt hơn hẳn. Kết quả điện di ở hình 3.5 cho thấy việc gãy DNA đã giảm xuống, các băng DNA dày và sáng. Chỉ số đo OD từ 1,75 – 2,2. Những mẫu này đáp ứng đựoc các yêu cầu về độ tinh sạch, và có thế đƣợc dùng cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền.
Nhƣ vậy việc nghiền mẫu trong N2 tỏ ra hiệu quả hơn nhiều so với nghiền trong dịch trích EB là không cần phải nghiền trong tủ hút, lá dễ nghiền hơn do đã khô cứng và giòn trong N2 lỏng. Ngoài ra mẫu có thể nghiền mạnh tay mà không sợ làm gãy DNA, kết quả thu đƣợc tốt hơn, tốn ít thời gian và công sức hơn.
Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định tiến hành ly trích DNA theo quy trình cải tiến (đƣợc chỉ rõ ở sơ đồ 3.1) để lấy nguyên liệu cho phân tích RAPD.
Hình 4.5 Kết quả ly trích theo quy trình 4
36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4
Đây là một quy trình ổn định và có độ tin cậy, vấn đề còn lại chỉ là thao tác hút dịch trong sau mỗi lần ly tâm đòi hỏi phải cẩn thận, tránh hút vào lớp ngăn cách giữa 2 pha. Chúng tôi tiến hành ly trích 48 mẫu lá mắm trắng, kết quả thu đƣợc 40 mẫu cho băng DNA rõ nét, 6 mẫu cho băng DNA mờ (mẫu ở vị trí 1,2,3,4,19,33) và 2 mẫu cho băng DNA rất mờ ( mẫu số 31 và 50), đạt tỉ lệ 83%. Với kết quả này, các mẫu thu đƣợc hoàn toàn có thể thực hiện phản ứng RAPD.
4.4. Kết thực hiện phản ứng RAPD 4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 Nghiệm thức 1: Nghiền 0,4 g lá trong N2 lỏng thành bột mịn Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex kĩ, ủ 650C/1 giờ Thêm 1V hỗn hợp CIA, đảo đều. Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu V’ dịch trong Thêm V’ hỗn hợp
CIA, đảo đều. Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu dịch trong. Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1:1, ủ ở - 200C qua đêm Ly tâm 9.000 vòng/20 phút/40C, đổ bỏ dịch trong, thu tủa Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/ 40 C, thu V dịch nổi. Thêm 300µl TE1X, ủ 370C/30 phút. Thêm 20 µl Sodium acetate và 640 µl Ethanol 100%, đem ủ -200C/1 giờ Ly tâm 8.000/20 phút/40C. Đổ bỏ dịch trong, thu tủa.
Rửa cặn với 300 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút/6.000 vòng Lặp lại bƣớc 10, làm
khô tủa DNA trong không khí.
Hòa tan tủa trong 100 µl TE1X, ủ ở 370C/30 phút. Bảo quản ở -200C
Sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với thành phần các chất và chu kì nhiệt đã nêu ở bảng 2.1 và 2.2 để thực hiện phản ứng RAPD, chúng tôi thu đƣợc kết quả là không có băng nào trên gel điện di, nhƣ thể hiện ở hình 3.6
Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1
Trong nghiệm thức này, chúng tôi đã sử dụng quy trình phân tích RAPD của Lâm Vỹ Nguyên, 2006 cho cây đƣớc. Mặc dù với quy trình này, Lâm Vỹ Nguyên đã thu đƣợc kết quả rất tốt. Theo chúng tôi, điều này có thể là do một số lý do sau:
Thao tác của chúng tôi còn chƣa chính xác.
Đây chƣa phải là quy trình phù hợp cho cây mắm trắng.
Nghiệm thức 2:
Khi sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với chu kì nhiệt và thành phần hóa chất nhƣ đã đƣa ra trong bảng 2.3 và 2.4, chúng tôi thu đƣợc 4 băng khi chạy với primer OPAC10, và chỉ 1 băng khi chạy với primer 1 nhƣ ở hình 3.7
Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2
Không có sản phẩm tạo thành Avicennia officinalis Avicennia alba Avicennia marina OPAC10 Primer 1
Từ kết quả này, chúng tôi kết luận rằng thực hiện phản ứng RAPD theo điều kiện ở nghiệm thức 2 này là phù hợp cho cây mắm trắng. Với OPAC10, chúng tôi thu đƣợc 4 băng cho mỗi mẫu DNA đem phân tích. Các băng tách rõ và có thể quan sát bằng mắt thƣờng.
Với primer 1, tuy kết quả PCR tốt nhƣng chúng tôi chỉ thu đƣợc chỉ 1 băng đồng hình duy nhất. Do chỉ có 1 băng nên kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm này không có ý nghĩa trong việc so sánh sự đa dạng di truyền trên cây mắm trắng. Tuy nhiên khi so sánh kết quả này với kết quả chạy primer 1 trên 2 loài mắm đen (Avicennia
officinalis) và mắm biển (Avicennia marina), chúng tôi kết luận có thể đây là băng
đặc trƣng không những chỉ cho cây mắm trắng mà còn cho cả chi Avicennia và có
thể là một vùng bảo tồn của chi Avicennia, là chỉ thị phân tử để phân biệt chi mắm với các chi khác trong họ Avicenniacea. Kết quả điện di với ladder cho thấy băng
này có kích thƣớc khoảng 400 bp. Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định khảo sát thêm một số primer khác với mong muốn tìm đƣợc primer cho sản phẩm khuếch đại trên gel cao hơn nhƣ trong thí nghiệm 2.
Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen
(Avicennia officinalis)
Băng đặc trưng 400 bp
4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2
Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 3 trên cây mắm trắng.
Với các primer đã sử dụng, chỉ có primer OPA05 và OPA10 không cho băng nào, primer 9 và primer 2 đều cho 3 băng, primer RAH8 chỉ cho 2 băng. Theo chúng tôi, lý do không có băng ở mẫu thực hiện với primer OPA05 và OPA10 là do các primer này đã đƣợc bảo quản trong thời gian dài (từ năm 2004), hoạt tính có thể đã giảm đi, vì vậy không xảy ra phản ứng khuếc đại. Ở các primer khác, mặc dù có cho băng, nhƣng số băng còn ít (chỉ từ 2 – 3 băng), do đó chúng tôi không chọn để phân tích đa dạng di truyền.
Với kết quả trên, chúng tôi quyết định sử dụng primer OPAC10 để thực hiện phản ứng RAPD, phân tích đa dạng di truyền trên cây mắm trắng.
4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ sinh quyển Cần Giờ
Chúng tôi đã tiến hành phản ứng RAPD với primer OPAC10 sử dụng thành phần hóa chất và chu kì nhiệt ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1 trên 16 mẫu DNA đã ly trích có kết quả đo OD đạt từ 1,8 -2,2. Kết quả có 2 mẫu không cho sản phẩm khuếch đại. Đối chiếu với thao tác thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy đây là mẫu cuối cùng khi chúng tôi tiến hành chia từ ống trộn chính sang các eppendorf khác, sự hao
hụt không thể tránh khỏi khi tiến hành với những thể tích nhỏ nhƣ vậy, do đó nồng độ thành phần các chất ở mẫu này có thể đã bị thay đổi, do đó phản ứng khuếch đại đã không xảy ra.
Với 16 mẫu thực hiện phản ứng RAPD – PCR, chúng tôi thực hiện thành công 14 mẫu (chiếm tỉ lệ 87%), thu đƣợc tổng cộng là 49 băng, với 7 băng có kích thƣớc khác nhau, trung bình 3,5 băng/mẫu. Số băng tối đa chúng tôi thu đƣợc là 5 băng (ở 2 mẫu 11.AA07 và 5A.AA19), số băng ít nhất là 2 băng (thu đƣợc đƣợc ở 2mẫu 11.AA09 và 11.AA11). Măc dù số băng còn thấp nhƣng cũng thấy xuất hiện những băng đa hình ở những mẫu này. Kết quả thu đƣợc 6 băng đa hình (chiếm tỉ lệ 85%) và 1 băng đồng hình (chiếm tỉ lệ 15%) có kích thƣớc khoảng 200 bp.
Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng.
Trong các mẫu phân tích, băng đồng hình 200 bp luôn xuất hiện, vì vậy chúng tôi nghĩ rằng có thể đây là băng đặc trƣng để phân biệt giữa cây mắm trắng với các cây khác trong chi mắm. Từ kết quả điện di thu đƣợc trên gel điện di, chúng tôi mã hóa số liệu thành dạng nhị phân 1 và 0 (1 là có băng, 0 là không có băng), và đem kết quả này phân tích với phần mềm NTSYSpc2.1 để phân tích sự đa dạng di truyền. Kết quả chúng tôi thu đƣợc cây phân nhóm của các mẫu đã phân tích.
Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích