CỐ ĐỊNH ENZYME LIPASE BẰNG VI hạt CHITOSAN

CỐ ĐỊNH ENZYME LIPASE BẰNG VI HẠT CHITOSAN. Enzyme lipase có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp thực phẩm, hóa chất, thuộc da, dệt, giấy, quản lý môi trƣờng, y tế, sản xuất nước hoa hay biodiesel

Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long CỐ ĐỊNH ENZYME LIPASE BẰNG VI HẠT CHITOSAN SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy TS Đặng Đức Long, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành đồ án, giúp tơi có nhiều kiến thức kinh nghiệm q báu nghiên cứu khoa học Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn tới KS Võ Công Tuấn, kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, ngƣời giúp đỡ nhiều suốt thời gian nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm, thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Hóa trƣờng Đại học Bách Khoa Đà Nẵng dạy dỗ, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập trƣờng Cuối cùng, xin cảm ơn ngƣời thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành luận văn Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Đà Nẵng, ngày 29 tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Quốc Khánh SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH i Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ iv DANH MỤC BẢNG v CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi TÓM TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Những khái niệm chung Enzyme 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cơ chế hoạt động enzyme 1.1.3 Phƣơng pháp xác định độ hoạt động enzyme 1.2 Tổng quan enzyme Lipase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Cơ chế tác dụng lipase 1.2.3 Ứng dụng 1.2.4 Enzyme cố định 10 1.3 Đại cƣơng chitosan 12 1.3.3 Nguồn gốc 12 1.3.4 Đặc tính 13 1.3.5 Ứng dụng chitosan 13 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP 17 2.1 Thiết bị vật liệu 17 2.1.1 Thiết bị 17 SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH ii Đồ án Tốt Nghiệp 2.2.1 GVHD: TS Đặng Đức Long Vật liệu 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Tạo hạt 18 2.3.2 Cố định enzyme lipase 20 2.3.3 Kiểm tra nồng độ enzyme lipase đƣợc cố định 21 2.3.4 Kiểm tra hoạt độ enzyme lipase 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết tạo hạt 25 3.2 Khả cố định enzyme lipase vi hạt chitosan 29 3.2.1 Phƣơng pháp cố định trực tiếp 29 3.2.2 Phƣơng pháp hấp phụ 30 3.2.3 Nhả hấp phụ 33 3.3 Khảo sát hoạt độ enzyme sau cố định 34 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 43 SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH iii Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Các phản ứng lipase xúc tác [13] Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn cấu trúc gấp nếp α/β hydrolase [13] Hình 1.3: Mơ hình hoạt động lipase chất hồ tan khơng tan nƣớc Sự thay đổi hình thể lipase q trình hoạt động xúc tác Mơ hình Verger đề xuất (1980) [21] Hình 1.4: Cấu trúc hóa học chitosan 12 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 18 Hình 2.2: Tạo hạt chitosan với kim tiêm y tế theo phƣơng pháp nhỏ giọt 20 Hình 2.3: Dùng ống fancol để chứa mẫu hấp phụ 21 Hình 2.4: Đo hoạt độ enzyme lipase phƣơng pháp chuẩn độ 24 Hình 3.1: Hạt ƣớt 26 Hình 3.2: Hạt khô 26 Hình 3.3: Vi hạt chitosan dạng khô ƣớt 27 Hình 3.4: Quy trình tạo vi hạt chitosan 27 Hình 3.5: Cơ chế tạo liên kết ngang glutaraldehyde 28 Hình 3.6: Quy trình cố định enzyme phƣơng pháp hấp phụ 30 Đồ thị 3.1: Đƣờng chuẩn đo nồng độ enzyme lipase 31 Đồ thị 3.2: Đồ thị thể hoạt độ enzyme lipase so với enzyme cố định; Với E kí hiệu enzyme tự do, U enzyme cố định hạt ƣớt, K enzyme cố định hạt khô; 10, 50, lần lƣợt nồng độ 10mg/ml, 50mg/ml 35 Đồ thị 3.3: Hoạt độ riêng tính mg enzyme Với E kí hiệu enzyme tự do, U enzyme cố định hạt ƣớt, K enzyme cố định hạt khô; 10, 50, lần lƣợt nồng độ 10mg/ml, 50mg/ml 36 Đồ thị 3.4: Đồ thị biểu hoạt độ enzyme cố định sau lần sử dụng với nồng độ 50mg/ml 38 SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH iv Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hấp phụ enzyme lipase nồng độ 1mg/ml 24h 32 Bảng 3.2 Hấp phụ enzyme lipase nồng độ 1mg/ml, 10mg/ml, 50mg/ml; với K kí hiệu hạt khơ, U khí hiệu hạt ƣớt; 1,10,50 nồng độ tƣơng ứng 1mg/ml, 10mg/ml, 50mg/ml 33 Bảng 3.3 Theo dõi nhả hấp phụ hạt ƣớt sau hấp phụ enzyme lipase nồng độ 50mg/ml 34 Bảng 3.4 Tỉ lệ enzyme lipase nhả hấp phụ 34 Bảng 3.5 Tỉ lệ hoạt độ enzyme tự enzyme cố định 36 Bảng 3.6 Tỉ lệ hoạt độ riêng enzyme tự enzyme cố định 37 SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH v Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long CÁC CHỮ VIẾT TẮT - CS – GLU: chitosan - glutaraldehyde - Da: Dalton – đơn vị khối lƣợng - kDa: kilo Dalton - ES: Phức hợp enzyme chất - RNA: Acid ribonucleic SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH vi Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long TĨM TẮT Enzyme lipase có nhiều ứng dụng lĩnh vực sản xuất công nghiệp thực phẩm, hóa chất, thuộc da, dệt, giấy, quản lý mơi trƣờng, y tế, sản xuất nƣớc hoa hay biodiesel [2] Nhƣng sử dụng enzyme lipase nhiều trở ngại chi phí cao Để giải vấn đề ta chọn cách cố định enzyme lipase vi hạt chitosan Trong nghiên cứu tạo thành cơng vi hạt chitosan có kích thƣớc trung bình 0,2 – 0,4mm dạng khơ 0,1mm Hạt có khả cố định enzyme tốt, hiệu suất hấp phụ cao 95,81%, khả hấp phụ lên đến 455 lần Vi hạt có khả giữ enzyme tốt, lƣợng enzyme điều kiện mơ sản xuất công nghiệm xấp xỉ 1% 24h Từ khóa: enzyme lipase, chitosan, vi hạt chitosan, cố định enzyme, glutaraldehyde ABSTRACT Lipase enzyme has many applications in many different industries such as beverage, chemical, leather, textile, paper, environment, healthcare, perfume or biodiesel, etc However, the usage of lipase enzyme has encountered many barriers due to its high cost To fix this problem, we can choose the way “fixed lipase enzyme” by chitosan microparticles In this study, chitosan microparticles have been successfully created with the average size of 0,2 – 0,4mm and 0.1mm in the dry form The microparticles have a great capability to stablize this enzyme, the highest adsorption rate is 95.81%, and the adsorption capacity increases to 455 folds The microparticles have a good ability to keep the enzyme, the amount of enzyme escaped in industry producing simulation is only approximately 1% The particles are stable and easy to preserve Key words: enzyme lipase, chitosan, chitosan microparticles, immobilized enzyme, glutaraldehyde SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH vii Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long LỜI MỞ ĐẦU Lipase họ enzyme mà môi trƣờng tự nhiên chúng xúc tác cho phản ứng thủy phân chất béo Tuy nhiên, điều kiện phản ứng phù hợp lipase cịn có khả xúc tác phản ứng ester hóa, chuyển ester phản ứng alcoholysis [7] Nên enzyme lipase đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực nhƣ sản xuất công nghiệp thực phẩm, hóa chất, tẩy rửa, thuộc da, dệt, giấy, quản lý môi trƣờng, y tế, sản xuất nƣớc hoa hay biodiesel [2,7].Nhƣng sử dụng enzyme hịa tan có số nhƣợc điểm, ví dụ nhƣ khơng ổn định độ nhạy môi trƣờng khác khơng phải mơi trƣờng tối ƣu [2] Vì chất mang trở nên ngày quan trọng thời gian qua Ƣu điểm enzyme cố định chúng đƣợc sử dụng nhiều lần thời gian dài, không bị lẫn vào sản phẩm cuối q trình phản ứng, ngừng phản ứng cách tách chất mang khỏi chất, enzyme cố định tƣơng đối bền trƣớc tác động hóa học, vật lý so với enzyme tự Chitosan dẫn xuất chitin có nhiều vỏ giáp xác nhƣ tôm cua…Đây vật liệu không độc hại, tƣơng thích với sinh học dễ phân huỷ sinh học [2,5] Hạt chitosan làm chất mang có kích thƣớc khác đƣợc tạo số phƣơng pháp, ví dụ nhƣ nhỏ giọt, nhũ tạo liên kết ngang, phun khơ [1] Nhóm amin phản ứng nhóm hydroxyl- sau hoạt hóa – liên kết với enzyme [2,7] Do đó, chitosan thƣờng đƣợc sử dụng làm chất mang cho công nghệ cố định enzyme Tuy nhiên thực tế, chất mang làm từ chitosan thƣờng đƣợc dùng với kích thƣớc hạt khoảng milimet đƣợc sử dụng chủ yếu [14] Chính em tiến hành nghiên cứu đề tài : “Cố định enzyme lipase vi hạt chitosan” với mong muốn tạo hạt chitosan có kích thƣớc nhỏ, có khả cố định enzyme tốt giữ đƣợc hoạt tính enzyme SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những khái niệm chung Enzyme 1.1.1 Khái niệm Enzyme protein xúc tác sinh học, tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng cịn giữ ngun khả xúc tác (Theo tiếng Hi Lạp: -en có nghĩa trong, cịn -zyme có nghĩa bột chua) [4] Ngồi nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, tuyệt đại đa số enzyme có chất protein thể hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, phân tử trạng thái tự nhiên Enzyme có khối lƣợng thay đổi rộng từ 12.000 Da đến hàng vài trăm nghìn Da [6] Enzyme protein có hoạt tính sinh học nên có đủ tính chất protein Giống với protein hình hạt khác, enzyme hịa tan nƣớc, dung dịch đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý [27] Dung dịch enzyme có tính chất dung dịch keo ƣa nƣớc Enzyme dung dịch dễ dàng bị kết tủa dƣới tác dụng muối trung hịa nhƣ sulphatamon dung mơi hữu nhƣ ethanol, acetone, nhiệt độ thấp nhƣng không bị hoạt tính xúc tác Do đó, dùng tác nhân để thu chế phẩm enzyme [27] Ngƣợc lại, dƣới tác dụng yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) enzyme thƣờng bị khả xúc tác mức giảm hoạt độ tƣơng ứng với mức độ biến tính phân tử protein – Enzyme [4] 1.1.2 Cơ chế hoạt động enzyme Theo Michaleis - Menten muốn cho phản ứng enzyme xảy chất phải đƣợc gắn vào trung tâm hoạt động enzyme tạo thành phức hợp enzyme chất (ES) Quá trình tạo thành phức enzyme - chất (ES) biến đổi chất thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự thƣờng trải qua giai đoạn : SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long Bảng 3.6 Tỉ lệ hoạt độ riêng enzyme tự enzyme cố định Tỉ lệ Phần trăm (%) U50/E50 0,65 65,00 K50/E50 0,30 30,00 U10/E10 0,49 49,23 K10/E10 0,14 13,85 Kết cho thấy nồng độ nồng độ 10mg/ml hoạt độ riêng enzyme lớn nồng độ 50mg/ml, điều giải thích enzyme lipase bám bề mặt hạt, với nồng độ lớn dẫn đễn cạnh tranh cấu hình khơng gian, từ làm giảm khả tiếp xúc enzyme với chất Ngồi ta cịn nhận thấy hoạt độ hạt ƣớt lớn so với hạt khô cố định 50mg enzyme Điều thể sai khác cấu trúc nhƣ liên kết hạt khô hạt ƣớt dẫn đến tiếp xúc với chất hạt khơ gặp khó khăn Nhƣng ngƣợc lại hạt khơ có khả cố định lớn nhiều lần so với hạt ƣớt nên tùy điều kiện mà ta sử dụng dạng Việc cố định enzyme lên hạt ƣớt tốn thời gian, hiệu suất cao, độ nhả hấp phụ lớn so với hạt khô nên tiếp tục chọn hạt ƣớt để khảo sát hoạt độ sau nhiều lần tái sử dụng SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 37 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long Hoạt độ enzyme cố định sau lần tái sử dụng với nồng độ ĐVHT/mg enzyme 50mg/ml 1500 1000 500 Enzyme tự Lần Lần Lần Đồ thị 3.4: Đồ thị biểu hoạt độ enzyme cố định sau lần sử dụng với nồng độ 50mg/ml Kết thí nghiệm cho thấy enzyme đƣợc cố định giữ vững hoạt độ sau lần tái sử dụng Chứng tỏ hạt giữ enzyme tốt enzyme không bị biến tính Bên cạnh cịn kiểm tra hoạt độ enzyme sau ngày giữ mẫu 4°C kết cho thấy hoạt tính đảm bảo SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 38 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong nghiên cứu tạo thành cơng vi hạt chitosan có kích thƣớc trung bình 0,2 – 0,4mm dạng khơ 0,1mm Hạt có khả cố định enzyme tốt, hiệu suất hấp phụ cao 95,81%, khả hấp phụ cao lên đến 455 lần Vi hạt có khả giữ enzyme tốt, lƣợng enzyme thoát điều kiện mô sản xuất công nghiệm xấp xỉ 1% 24h Hạt bền vững không bị sụp đổ Dễ dàng bảo quản Phƣơng pháp sản xuất đơn giản, chi phí thấp Cơng đoạn tạo hạt ơn hịa, khơng phức tạp, thiết bị thông dụng Enzym lipase đƣợc cố định thành cơng vi hạt tạo thành Hoạt tính enzyme cố định bị giảm nhƣng chấp nhận đƣợc Khảo sát hoạt tính đảm bảo sau lần tái sử dụng hoạt độ ổn định sau ngày bảo quản điều kiện 4°C 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu phát triển để đƣa vi hạt cố định enzyme vào sản xuất thực tế mơ hình sản xuất cơng nghiệp Áp dụng kết để tạo mộ số mơ hình có tính ứng dụng thực ví dụ nhƣ mơ hình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu nành [7], ứng dụng tƣơng tự để xử lý nƣớc thải chế biến cá để làm xăng sinh học Hoặc dùng vi hạt chitosan thu từ vỏ tôm để làm cột lọc nƣớc thải nhiễm kim loại nặng Nghiên cứu cách cố định enzyme khác để sử dụng ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Thay đổi chất tạo liên kết ngang để thích hợp sử dụng làm chất dẫn truyền thuốc y tế hay công nghiệp mỹ phẩm, thực phẩm Với điều kiện tạo hạt ơn hịa nghiên cứu cách cố định enzyme trực tiếp để giảm lƣợng enzyme thoát hạt cố định enzyme tốt SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 39 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thanh Phƣớc, Bùi Vũ Thanh Phƣơng (2002) Nghiên cứu chế tạo hạt gel chitosan liên kết ngang kích thước nhỏ Tạp chí Khoa học 2012:23b 60-68 Nguyễn Bảo Dƣ (2001) Đồ án công nghệ cố định enzyme ứng dụng Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lƣợng (2006) Công nghệ vi sinh – tập – Thực phẩm lên men truyền thống Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Minh Xuân (2013) Bài giảng c ng nghệ enzyme Trƣờng Đại học Bách Khoa Đà Nẵng Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Ngọc Lƣơng, Trần Thị Quý Mai, Hoa Thị Hằng, Nguyễn Xuân Thụ, Nguyễn Ngọc Phong (2012) Nghiên cứu ứng dụng c ng ngệ thân thiện m i trường kh ng sử dụng hoá chất tách chiết chitin từ vỏ tơm Tạp chí sinh học, 34(4):521-528 PGS TS Đỗ Quý Hai, Trần Thanh Phong (2008) Giáo trình cơng nghệ ứng dụng enzyme Trƣờng Đại Học Huế PGS.TS Phạm Xuân Núi, KS Nguyễn Ngọc Sơn, KS Lê Thị Cúc (2013) Tổng hợp đặc trưng úc tác enzyme Lipase cố định nano từ tính ứng dụng cho q trình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu nành Đại học Mỏ - Địa chất PGS.TS Đặng Thị Thu (2004) Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo lipase Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Bộ Khoa học Công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm Hà Nội Phạm Thị Kim Thảo (2011) Bài giảng thí nghiệm hóa sinh Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng 10 Phạm Văn Thiều (2000) Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm đậu tương Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp 11 Trần Thị Xơ (2013) Bài giảng Hóa sinh Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng 12 Võ Cơng Tuấn (2011) Bài giảng thí nghiệm Cơng nghệ enzyme Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 40 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long Tài liệu tiếng Anh 13 Abu Bakar Salleh Raja Noor Zaliha Raja Abdul Rahman anh Mahiran Basri (2006) New lipases and proteases Nova Science Publishers New York 14 Emese Biró a, Ágnes Sz Németh a, Csaba Sisak a, Tivadar Feczkó, János Gyenis (2008) Preparation of chitosan particles suitable for enzyme immobilization J Biochem Biophys Methods 70, 1240–1246 15 Hsu, A F., Jones, K., Foglia, T A., and Marmer, W N (2002) Immobilized lipase-catalysed production of alkyl esters of restaurant grease as biodiesel Biotechnology and Applied Biochemistry, 36: 181–186 16 Klaus, D (1998) An enzyme process for the physical refining of seed oils Chemical Engineering and Technology, 21: 278-281 17 Lee, D.W., Koh, Y.S., Kim, K J., Kim, B.C., Choi, H J., Kim, D.S., Suhartono, M T., and Pyun, Y R (1999) Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1 FEMS Microbiology Letters, 179: 393-400 18 Masalova O, Kulikouskaya V, Shutava T, Agabekov V (2013) Alginate and chitosan gel nanoparticles for efficient protein entrapment Physics Procedia 40, 69 – 75 19 Pandey, A., Benjamin, S., Soccol, C., Nigam, P., Krieger, N., and Soccol, V (1999) The realm of microbial lipases in biotechnology: a review, Biotechnology and Applied Biochemistry, 29: 119-131 20 Parmjit S.Panesar, Shweta Kumari and Reeba Panesar Potential Application of immobilized β- galactosida in food Processing industries SAGE – Hindawi Access to research, volume 2010, 16 page 21 (2012) Paul Woolley, Aarhus Universitet, Denmark, Steffen B Petersen Lipase – Their Structure, Biochemistry and Application Cambridge University Press 22 Sharma, R., Soni, S K., Vohra, R M., Gupta, L K., and Gupta, J K (2002) Purification and characterization of a thermostable alkaline lipase from a new thermophilic Bacillus sp RSJ-1 Process Biochemistry, 37: 1075-1084 23 Sonali Seth, Debamitra Chakravorty, Vikash Kumar Dubey, Sanjukta SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 41 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long Patra (2013) An insight into plant lipase research – challenges encountered Protein expression and purification 95 24 Sufang Sun, Yan Zhang,Lingyun Dong, and Shigan Shen (2009) Using Silica Particles as Porogen of macroporous Preparationof Chitosan for Suitable for Enzyme Immobilization Macrospheres College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding, China 25 Sultatos LG, Pastino GM, Rosenfeld CA, Flynn EJ (2004) Incorporation of the genetic control of alcohol dehydrogenase into a physiologically based pharmacokinetic model for ethanol in humans Toxicological Sciences : an Official Journal of the Society of Toxicology, Vols 78 (1): 2031 26 Vanessa L Gonỗalves, Mauro C M Laranjeira, Valfredo T Fávere, Departamento de Química (2004) Effect of Crosslinking Agents on Chitosan Microspheres in Controlled Release of Diclofenac Sodium 27 Wolfgang Aehale (2004) Enzyme in Industry Wliey – VCH Verlag, GmbH&Co.KGa, Weinheim Tài liệu trực tuyến 28 Http://doc.edu.vn/tai-lieu/do-an-nghien-cuu-tim-hieu-ung-dung- chitin-chitosan-8908/ ngày truy cập 20/03/2015 29 http://luanvan.co/luan-van/nghien-cuu-thu-nhan-lipase-tren-ba-dau- nanh-bang-phuong-phap-nuoi-cay-be-mat-tu-chung-rhizopus-2243/ ngày truy cập 21/04/2015 Http://tai-lieu.com/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-chitin-chitosan-5628/ ngày truy cập 30/04/2015 Http://tai-lieu.com/tai-lieu/ung-dung-cua-chitosan-885/ tc ngày truy cập 25/02/2015 30 http://text.123doc.org/document/2674699-enzyme-lipase.htm/ ngày truy cập 30/03/2015 31 http://timtailieu.vn/tai-lieu/giao-trinh-enzyme-chuong-1-dinh-nghia- enzyme-24829/ ngày truy cập 21/04/2015 SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 42 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long PHỤ LỤC Phụ lục Định lƣợng protein phƣơng pháp Bradford Có nhiều phƣơng pháp để định lƣợng protein: Biuret, Lowry, Bradford, BCA phƣơng pháp đo quang phổ kế Trong phƣơng pháp kể trên, phƣơng pháp Bradford ƣu việt Đây phƣơng pháp có độ nhạy cao xác định tới µg protein, hóa chất đơn giản, tốn thời gian Một ƣu điểm lớn phƣơng pháp bị cản trở hóa chất sử dụng nghiên cứu protein, ammonium sulfate Nguyên tắc Phƣơng pháp dựa thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, chƣa kết nối với protein thuốc nhuộm có bƣớc sóng hấp thu cực đại 465 nm; kết hợp với protein thuốc nhuộm hấp thu cực đại bƣớc sóng 595 nm Độ hấp thụ bƣớc sóng 595nm có liên hệ cách trực tiếp tới nồng độ protein Để xác định protein mẫu, ta xây dựng đƣờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn biết trƣớc nồng độ Dung dịch protein chuẩn thƣờng Bovine serum albumin Sau cho dung dịch protein vào dung dich thuốc nhuộm, màu xuất sau phút bền tới Tiến hành đo dung dịch máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta đƣợc ODx , độ hấp thụ tỷ lệ với lƣợng mẫu Thực đối chứng với nƣớc cất (OD0) Lấy giá trị ΔOD = ODx – OD0 Lƣợng protein mẫu dung dịch đo đƣợc xác định cách chấm đƣờng chuẩn theo OD chiếu xuống trục hoành Giá trị nhận đƣợc trục hồnh lƣợng protein mẫu dung dịch đo Hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.1 Hóa chất - Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin cân phân tích, pha ml nƣớc cất Lắc cho tan Giữ -200C Khi dùng pha loãng 100 lần, đƣợc dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml Trong thực tập pha SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 43 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long ml để sử dụng (lấy ống nghiệm nhựa có nắp thật khơ cho vào 3960 µl nƣớc cất, sau thêm 40 µl dung dịch albumin Lắc đều.) - Dung dịch thuốc thử Bradford: dungdịch thuốc thử có thành phần 100ml nhƣ sau: + Coomassie Brilliant Blue G250: 0,01 g + Ethanol tuyệt đối: 4,7 g + Phosphoric acid 85%: 8,5 g Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue G250 đƣợc làm tan ethanol chai đựng màu tối có nắp Bổ sung phosphoric acid chỉnh tới 100ml nƣớc cất Lắc Giữ 40C 2.2 Dụng cụ thiết bị Máy đo quang phổ kế (Spectrophotometer) Ống nghiệm Cốc 100 ml Rổ nhựa Viết marker Khăn lau Micropipette Pipette 5ml Pipette 1ml Giấy thấm Giá để ống nghiệm Cuvette thủy tinh Bình tia Phương pháp 3.1 Dựng đường chuẩn - Lập ống nghiệm đƣợc đánh số theo thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, - Bổ sung thành phần vào ống nghiệm theo bảng sau: SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 44 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long Nƣớc cất (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 albumin 0,1 mg/ml (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Thuốc thử Bradford (ml) 5 5 5 Nồng độ albumin (µg/ml) 10 20 30 40 50 Vẽ đƣờng chuẩn * Tính giá trị ΔOD595 = OD595 thử thật – OD595 thử khơng * Vẽ đƣờng tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang (ΔOD595) 3.2 Định lượng Protein mẫu thu - Bổ sung vào ống nghiệm thành phần với dung tích nhƣ sau: + Nƣớc cất: 0,8 ml + Dung dịch mẫu thử: 0,2 ml + Dung dịch thuốc thử: ml - Việc đo mẫu đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ phần dựng đƣờng chuẩn Tính lƣợng protein có mẫuvà dựa vào đƣờng chuẩn dựng để suy nồng độ protein cần tìm SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 45 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long Phụ lục Xác định hoạt độ enzyme lipase phƣơng pháp chuẩn độ Nguyên tắc Lipase enzym thuộc nhóm thủy phân, phân nhóm esterase – xúc tác phản ứng thủy giải nối ester glycerine acid béo glyceride Nhờ hoạt động lipase, acid béo đƣợc giải phóng làm tăng độ chua mơi trƣờng phản ứng Lƣợng acid đƣợc chuẩn độ kiềm số hoạt độ enzym lƣợng kiềm cần để trung hòa acid béo đƣợc hình thành Theo nghiên cứu lipase có nhóm serin, histidin axit aspastic trung tâm hoạt động Với chất khơng tan nƣớc, hoạt tính lipase đạt đƣợc cực đại đƣợc phân tán vào bề mặt phân pha dầu nƣớc Q trình đƣợc gọi q trình hoạt hố phân pha Hóa chất thiết bị 2.1 Hóa chất - Sữa tƣơi : 50ml - NaOH 0,1N: pha từ ống chuẩn - Cồn 96%: 50ml - Phenolphtalein 1%: 10ml - Hỗn hợp nƣớc - glycerin: 28 ml (tỷ lệ nƣớc : 1glycerin) 2.2 Dụng cụ thiết bị - Bình tam giác 250ml: bình - Buret 25ml: - Pipet 2ml: - Pipet 10ml: - Cối sứ: - Bếp điện: - Vải màn: - Giấy lọc: SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 46 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long - Phễu lọc: Tiến hành 3.1 Chuẩn bị mẫu enzyme th Xác định hoạt tính enzyme lipase: Lấy 02 bình tam giác 250ml, cho vào bình 10ml sữa tƣơi - Bình tam giác (mẫu thử): cho vào ml lipase, lắc đều, để nhiệt độ phòng vòng 30 phút - Bình tam giác (đối chứng): đun sơi sữa bình, sau cho 2ml lipase vào đun sơi tiếp phút Để nhiệt độ phịng vòng 30 phút Sau thời gian ủ thêm vào bình 8ml cồn 96%, giọt phenolphtalein, chuẩn độ hai bình tam giác KOH 0,1N Tiến hành thí nghiệm lần Lấy kết giá trị trung bình lần thí nghiệm 2.4 Tính kết Đơn vị hoạt độ lipase: đƣợc biểu thị số ml KOH dùng để chuẩn độ acid béo tạo thành từ thủy phân lipid có lít sữa đƣợc tính theo cơng thức sau: X= k Trong đó: - X : Hoạt độ enzyme lipase (ĐVHT/mg hạt) - V1 : Số ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình tam giác mẫu thử - V2 : Số ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình tam giác đối chứng đối chứng X = (V1 – V2).1000/10 - K: hệ số hiệu chỉnh Phụ lục Hệ số hiệu chỉnh Dùng H2SO4 0,1N pha từ ống chuẩn để hiệu chỉnh KOH 0,1N Hút xác 10ml H2SO4 0,1N sau cho thêm vài giọt phenolphthalein dùng KOH 0,1N để chuẩn độ Lặp lại thí nghiệm lần lấy kế trung bình K= VH2SO4/VKOH SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 47 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long Phụ lục 4: Thông số thiết bị TÊN THIẾT BỊ: MÁY RỬA SIÊU ÂM Các đặc điểm thiết bị: Mã tài sản: 4-TTCNSH Mã số thiết bị: 4-TTCNSH Năm đƣa vào sử dụng: 2010 Số hiệu, thông số kỹ thuật: S300H Ký hiệu: S300H Hãng sản xuất: Elma, Đức Số lƣợng: 01 Các thơng số kỹ thuật thiết bị - Thể tích: 28l - Khối lƣợng: 11kg - Điều kiện làm việc: 220-240V, 50/60 Hz - Tần số sóng siêu âm: 37kHz - Nhiệt độ làm nóng tối đa: 800C Chức thiết bị - Rửa dụng cụ bị bám bẩn sóng siêu âm, trộn TÊN THIẾT BỊ: CÂN PHÂN TÍCH Các đặc điểm thiết bị: Mã tài sản: 5-TTCNSH Mã số thiết bị: 5-TTCNSH Năm đƣa vào sử dụng: 2010 Số hiệu, thông số kỹ thuật: AUY220 Ký hiệu: AUY220 Hãng sản xuất: SHIMADU, Nhật SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 48 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long Số lƣợng: 02 Các thông số kỹ thuật thiết bị - Nguồn điện: 15,5V – 600mA (Đã có adapter) - Khối lƣợng cân tối thiểu: 0,1 mg - Khối lƣợng cân tối đa: 220 g - Độ phân giải: 0,1 mg - Nhiệt độ hoạt động: – 400C Chức thiết bị - Cân xác khối lƣợng mẫu TÊN THIẾT BỊ: CÂN KỸ THUẬT Các đặc điểm thiết bị: Mã tài sản: 6-TTCNSH Mã số thiết bị: 6-TTCNSH Năm đƣa vào sử dụng: 2010 Số hiệu, thông số kỹ thuật: TXB 622L Ký hiệu: TXB 622L Hãng sản xuất: SHIMADU, Nhật Số lƣợng: 02 Ảnh chụp toàn cảnh thiết bị Các thơng số kỹ thuật thiết bị (Specifications) - Nguồn điện: 12V – 1A (Đã có adapter) - Khối lƣợng cân tối thiểu: 0,01 g - Khối lƣợng cân tối đa: 620 g - Độ phân giải: 0,01 g - Nhiệt độ hoạt động: 10 – 300C Chức thiết bị - Xác định xác khối lƣợng mẫu SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 49 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long TÊN THIẾT BỊ: MÁY LẮC ỔN NHIỆT Các đặc điểm thiết bị: Mã tài sản: 7-TTCNSH Mã số thiết bị: 7-TTCNSH Năm đƣa vào sử dụng: 2010 Số hiệu, thông số kỹ thuật: SI500 Ký hiệu: SI500 Hãng sản xuất: Stuart, Anh Số lƣợng: 01 Các thông số kỹ thuật thiết bị - Nguồn điện: 230V – 50Hz - Kích thƣớc tủ ni: 297mm x 408 mm x 422 mm (HxDxW) - Nhiệt độ min/max: – 600C - Độ phân giải: 0,10C - Số vòng lắc min/max: 30 – 300 vòng/phút Chức thiết bị - Ni cấy vi sinh vật có điều chỉnh nhiệt độ số vòng lắc TÊN THIẾT BỊ: BỂ ĐIỀU NHIỆT CÓ LẮC NÓNG LẠNH Các đặc điểm thiết bị: Mã tài sản: 22-TTCNSH Năm đƣa vào sử dụng: 2010 Số hiệu, thông số kỹ thuật: GLS400 Ký hiệu: GLS400 Hãng sản xuất: GRANT, Anh Số lƣợng: 02 Các thơng số kỹ thuật thiết bị SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 50 Đồ án Tốt Nghiệp GVHD: TS Đặng Đức Long - Nguồn điện: 230V – 50/60Hz - Nhiệt độ min/max: – 990C - Tốc độ quay min/max: 40 – 400 vòng/phút - Độ phân giải: 0,10C Chức thiết bị - Lắc mẫu nuôi cấy vi sinh vật co kiểm sốt nhiệt độ số vịng quay SVTH: Nguyễn Quốc Khánh_Lớp 10SH 51 ... 1.3.5.6 Cố định enzyme Trên giới có nhiều thí nghiệm tiến hành cố định enzyme chitosan Nhƣ cố định enzyme b-amylase chiết xuất từ khoai lang hạt chitosan [24], hay Glucose oxidase đƣợc cố định chitosan. .. tra khả cố định enzyme lipase dạng khô ƣớt ta tiếp tục khảo sát phƣơng pháp hấp phụ với hạt vừa tạo thành 3.2 Khả cố định enzyme lipase vi hạt chitosan 3.2.1 Phương pháp cố định trực tiếp Enzyme. .. 31 Đồ thị 3.2: Đồ thị thể hoạt độ enzyme lipase so với enzyme cố định; Với E kí hiệu enzyme tự do, U enzyme cố định hạt ƣớt, K enzyme cố định hạt khô; 10, 50, lần lƣợt nồng độ 10mg/ml,