Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 5 pptx

41 –Cho hổn hợp trên nhỏ từng giọt xuống dung dòch Ca 0.2M từ khoảng cách 20cm tạo thành các hạt có kích thước từ 0.5–4 mm. Để yên trong 2 giờ để các hạt gel tủa lại. Enzyme đã được bao bọc bên trong hạt gel.  Sơ đồ thực hiện: Sodium alginate Nước Khuấy, để yên trong 30 phút Dung dòch enzyme tỉ lệ 1:1 Khuấy. Loại bỏ bọt khí Glutaraldehyde Để yên trong 6giờ Xilanh nhỏ giọt CaCl 2 0.2M Loại enzyme dư. Để yên trong 2 giờ Gel 42 3.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme amylase cố đònh Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá hoạt tính enzyme amylase dựa trên đònh lượng đường maltose sinh ra sau phản ứng thủy phân tinh bột theo phương pháp Wihstatetter Schudel : a. Dụng cụ và hoá chất Dụng cụ Buret 2 ml , 5 ml , 10 ml Erlen 250 ml Hóa chất Dung dòch tinh bột 0.5% trong dung dòch đệm pH 5.6 Na 2 S 2 O 3 N/20 NaOH N/10 Dung dòch iod N/10 b. Đònh lượng đường maltose Lấy 2 erlen 250 ml Erlen thứ nhất : (Thử thật): Cho vào 5 ml hỗn hợp cần xác đònh đường maltose, 10ml dung dòch iod N/10, 15 ml dung dòch NaOH N/10. Thời gian nhỏ dung dòch NaOH N/10 phải kéo dài gần 2 phút (nhỏ từng giọt). Để yên trong tối 15 20 phút. Sau đó lấy ra cho thêm vào 2 ml H 2 SO 4 2N. Đònh phân lượng thừa bằng dung dòch Na 2 S 2 O 3 N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng đònh phân để làm chất chỉ thò màu) . Erlen thứ hai : (thử không) : thay 5 ml hỗn hợp cần xác đònh lượng đường maltose bằng 5 ml nước cất. Các bước tiến hành thực hiện tương tự như ở bình thứ nhất. 43 c. Tính kết quả  Lượng đường maltose sinh ra do tác dụng phân giải của amylase 2.10.20 342).( )( 3 0 t VV gX (*) V 0 : là thể tích Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng đònh phân cho bình thử không. V t : là thể tích Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng đònh phân cho bình thử thật. 342 : trọng lượng phản ứng của maltose.  Hoạt tính của amylase (UI) được tính theo công thức ).(. . IUK tm X A Hđ (**) X : Lượng đường maltose sinh ra do tác dụng thủy phân của amylase. m : Lượng mẫu enzyme sử dụng. K : Hệ số pha loãng. 3.2.3. Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh a. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh so với enzyme hòa tan – Sử dụng 25 ml enzyme Termamyl đã được pha loãng với nước cất (hệ số pha loãng là 2) tiến hành qui trình cố đònh với 25ml dung dòch alginate 3% như trên tạo ra được 50 ml enzyme cố đònh. – Lấy 10 erlen 250 ml chia thành hai lô, mỗi lô 5 erlen. Một lô tiến hành thí nghiệm với enzyme cố đònh, một lô tiến hành với dòch enzyme hòa tan với hệ số pha loãng là 2 để lấy giá trò trung bình. – Tiến hành theo bảng sau : 44 Lô thứ 1 Lô thứ 2 100 ml hồ tinh bột 0.5% 100 ml hồ tinh bột 0.5% 10 ml enzyme cố đònh 5 ml dòch enzyme hòa tan Đặt tên trên máy lắc ở nhiệt độ thường trong 1 giờ Đem đònh lượng đường maltose sinh ra Ở mỗi erlen lấy ra 25 ml hỗn hợp, thêm 10 ml dung dòch NaOH 0.5N để làm bất hoạt amylase, thêm nước cho đủ 50 ml . Lấy 5 ml hỗn hợp vừa pha loãng để đònh lượng đường maltose sinh ra sau phản ứng thủy phân tinh bột theo phương pháp Wilistatettet Schudel. b. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme cố đònh – Sử dụng 45 ml enzyme Termamyl đã được pha loãng với nước cất (hệ số pha loãng là 2) tiến hành qui trình cố đònh với 45ml dung dòch alginate 3% như trên tạo ra được 90 ml enzyme cố đònh. – Bố trí thí nghiệm theo 3 lô thí nghiệm, mỗi lô 3 mẫu tiến hành theo dõi hoạt tính của enzyme cố đònh ở các nhiệt độ khác nhau. – Tiến hành theo bảng sau : Tiến hành thí nghiệm Lô 1 Lô 2 Lô 3 Dung dòch tinh bột 0,5% (ml) 100 100 100 Enzyme cố đònh (ml) 10 10 10 Nhiệt độ ủ ( 0 C) 50 60 70 Thời gian ủ (h) 1 1 1 Sau thời gian ủ 1 giờ ở mỗi lô thí nghiệm lấy ra 25 ml hỗn hợp, thêm vào 10 ml dung dòch NaOH 0.5N để làm bất hoạt – amylase, thêm nước cho đủ 50 ml. Lấy ra 5ml hỗn hợp vừa pha loãng để đònh lượng lượng đường maltose sinh ra sau phản ứng thủy phân tinh bột theo phương pháp Wilistatettet Schudel. 45 c. Khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh theo thời gian – Sử dụng 75 ml enzyme Termamyl đã được pha loãng với nước cất (hệ số pha loãng là 2) tiến hành qui trình cố đònh với 75ml dung dòch alginate 3% như trên tạo ra được 150 ml enzyme cố đònh Bố trí thí nghiệm theo 5 lô thí nghiệm, mỗi lô 3 mẫu, tiến hành theo dõi hoạt tính của enzyme cố đònh ở các khoảng cách thời gian khác nhau. Tiến hành theo bảng sau : Tiến hành thí nghiệm Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Dòch hồ tinh bột 0.5% (ml) 100 100 100 100 100 Enzyme cố đònh (ml) 10 10 10 10 10 Thời gian ủ ở nhiệt độ thường (h) 1.5 2 2.5 3 3.5 Sau thời gian ủ nhất đònh ở mỗi lô thí nghiệm lấy ra 25 ml hỗn hợp, thêm vào 10 ml dung dòch NaOH 0.5N để làm bất hoạt – amylase, thêm nước cho đủ 50 ml. Lấy ra 5ml hỗn hợp vừa pha loãng để đònh lượng lượng đường maltose sinh ra sau phản ứng thủy phân tinh bột theo phương pháp Wilistatettet Schudel. d. Thí nghiệm sử dụng enzyme cố đònh trong thiết bò dòng chảy liên tục tuần hoàn Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh trong cột cố đònh hình trụ tròn với thể tích 300 ml , chiều cao 40 cm , tiến hành phản ứng thủy phân tinh bột theo dạng thiết bò tuần hoàn liên tục. – Nhồi vào cột 150 ml enzyme cố đònh. Tiến hành chạy thiết bò với lưu lượng nguyên liệu đầu vào 50 ml/ 1 giờ; Lưu lượng sản phẩm 50 ml/ 1 giờ; Lưu lượng dòng tuần hoàn 30 ml/ 1 giờ. – Sau những khoảng thời gian nhất đònh tiến hành xác đònh hàm lượng đường maltose sinh ra trong sản phẩm thu được, đánh giá hoạt tính enzyme cố đònh, đồng thời khảo sát thời gian sử dụng được enzyme một cách liên tục. Tuy nhiên do thời gian ở phòng thí nghiệm không cho phép khảo sát liên tục trong nhiều giờ do 46 đó sau mỗi lần sử dụng enzyme cố đònh được rửa qua dung dòch CaCl 2 0,2 M và sau đó được ngâm trong dung dòch CaCl 2 0,2 M đặt ở nhiệt độ lạnh. Hình 3.1: Mô hình thiết bò tuần hoàn liên tục 47 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh so với enzyme hòa tan Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh so với enzyme hoà tan theo phương pháp đã được trình bày ở phần III.3, thu được kết quả như sau (Bảng 4.1; Bảng 4.2) : Bảng 4.1: Kết quả hoạt tính của enzyme cố đònh ở nhiệt độ thường LÔ THỨ NHẤT (E. CỐ ĐỊNH) STT V 0 (ml) V t (ml) X(g) Hoạt tính (UI) 1 22,5 19,9 0.0222 0.0062 2 22,5 20.5 0.0171 0.0048 3 22,5 20.4 0.0180 0.0050 4 22,5 21 0.0128 0.0036 5 22,5 19.9 0.0222 0.0062 Tb 22,5 20.34 0.0185 0.0052 Bảng 4.2: Kết quả hoạt tính của enzyme hòa tan ở nhiệt độ thường LÔ THỨ HAI (E. HÒA TAN) STT V 0 (ml) V t (ml) X(g) Hoạt tính (UI) 1 22,5 19.3 0.0274 0.0077 2 22,5 18.9 0.0308 0.0086 3 22,5 19.4 0.0265 0.0074 4 22,5 20 0.0214 0.0060 5 22,5 18.9 0.0308 0.0086 Tb 22.5 19.3 0.0274 0.0077 48 Trong đó : V o : thể tích Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng đònh phân cho bình thử không. V t : thể tích Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng đònh phân cho bình thử thật. X : Khối lượng đường maltose sinh ra được tính theo công thức (*) Họat tính enzyme được tính theo công thức (**)  Nhận xét Hoạt tính enzyme – amylase cố đònh giảm 32,5% so với hoạt tính enzyme hòa tan. Điều này là do : – Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. – Tinh bột là nguồn cơ chất cao phân tử do đó khả năng thẩm thấu qua màng alginate thấp dẫn đến hạn chế chất lượng sản phẩm tạo ra. 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cố đònh Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme cố đònh được trình bày trong bảng 4.3 Bảng 4.3: Kết quả họat tính của enzyme cố đònh ở các nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ Lô 1 (50 0 C) Lô 2 (60 0 C) Lô 3 (70 0 C) V t Bercher thứ1 (ml) 19.0 18.5 17 V t Bercher thứ 2 (ml) 18.0 18.7 16.3 V t Bercher thứ 3 (ml) 19.3 18.4 15.5 Giá trò V t trung bình (ml) 19.03 18.53 16.27 Hàm lượng đường maltose X(g) 0.03 0.034 0.053 Hoạt tính enzyme (UI) 0.0083 0.0095 0.0149 V o : thể tích Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng đònh phân cho bình thử không (22.5ml) V t : thể tích Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng đònh phân cho bình thử thật. X : Khối lượng đường maltose sinh ra được tính theo công thức (*) Hoạt tính enzyme được tính theo công thức (**) 49 50  Nhận xét Hoạt tính enzyme tăng rõ rệt khi ta gia tăng nhiệt độ phản ứng đến 70 0 C. Ở nhiệt độ này, hiệu suất sử dụng cao hơn, mang lại hiệu quả sử dụng cao hơn. Tuy nhiên, theo nhận đònh của cảm quan, ta không thể tiếp tục gia tăng nhiệt độ, vì ở nhiệt độ cao hơn hạt gel sẽ không bền vững, hạt gel bò mềm đi khi đó enzyme sẽ thoát ra ngoài. Đây cũng là một trở ngại rất lớn khi ta sử dụng gel alginate để cố đònh enzyme có nhiệt độ tối ưu cao như enzyme – amylase. 4.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh theo thời gian Bảng 4.4 : Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh theo thời gian Thời gian Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 V t Bercher thứ1 (ml) 19,2 18,7 18,1 18,3 18,2 V t Bercher thứ 2 (ml) 19,3 18,6 17,8 18,1 18,2 V t Bercher thứ 3 (ml) 19,3 18,9 18,2 17,9 18,0 Giá trò V t trung bình (ml) 19,27 18,73 18,03 18,10 18,13 Hàm lượng đường maltose X(g) (*) 0,0276 0,0322 0,0382 0,0376 0,0373 Hoạt tính enzyme (**) 0,0052 0,0045 0,0043 0,0035 0,0030 V o : thể tích Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng đònh phân cho bình thử không(22.5ml) V t : thể tích Na 2 S 2 O 3 N/20 dùng đònh phân cho bình thử thật. X : Khối lượng đường maltose sinh ra được tính theo công thức (*) Hoạt tính enzyme được tính theo công thức (**) Từ bảng kết quả trên, ta rút ra được sự thay đổi hoạt tính của enzyme cố đònh theo thời gian như sau: Bảng 4.5 : Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo thời gian Thời gian (giờ) 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Hoạt tính amylase 0.0052 0.0052 0.0045 0.0043 0.0035 0.0030 . thời gian như sau: Bảng 4 .5 : Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo thời gian Thời gian (giờ) 1 1 .5 2 2 .5 3 3 .5 Hoạt tính amylase 0.0 052 0.0 052 0.00 45 0.0043 0.00 35 0.0030 . trình cố đònh với 25ml dung dòch alginate 3% như trên tạo ra được 50 ml enzyme cố đònh. – Lấy 10 erlen 250 ml chia thành hai lô, mỗi lô 5 erlen. Một lô tiến hành thí nghiệm với enzyme cố đònh,. m : Lượng mẫu enzyme sử dụng. K : Hệ số pha loãng. 3.2.3. Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh a. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh so với enzyme hòa tan – Sử dụng 25 ml enzyme