21 Nhược điểm Enzyme có thể bò mất hoạt tính vì cấu trúc của enzyme bò thay đổi do quá trình liên kết. Giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất do đó làm giảm hoạt tính enzyme cố đònh. Vật liệu cố đònh không tái sử dụng được, phương pháp này áp dụng cho các enzyme ổn đònh hoạt tính khi cố đònh. Enzyme cố đònh có thể tạo ra bằng hai cách – Nối đồng hóa trò liên kết các phân tử enzyme riêng biệt lại thành một liên hợp cao phân tử không hòa tan. Đây là phương pháp không sử dụng chất mang. Các phân tử enzyme sẽ liên kết với nhau qua các cầu nối trung gian để trở thành dạng không hòa tan. Các cầu nối trung gian thường dùng là glutaraldehyte. – Kết hợp phân tử enzyme với vật liệu cố đònh không hòa tan bằng liên kết cộng hóa trò. Điều chế các enzyme cố đònh loại 1, khi dùng các tác nhân lưỡng chức như bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid và một số hợp chất khác. Đặc biệt người ta thường dùng glutaraldehyte làm tác nhân để đính các phân tử enzyme lại với nhau. Các enzyme cố đònh loại 2 thường được điều chế phổ biến hơn. Chất mang để cố đònh enzyme phải thỏa mãn những đòi hỏi nhất đònh sau : Có độ hòa tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học và hóa học nhất đònh … Không gây tác dụng kìm hãm đến enzyme. Không tạo ra hiện tượng hấp thụ không đặc hiệu đối với các protein. Vì phản ứng enzyme thường xảy ra trong môi trường nước, nên vật liệu cố đònh tốt hơn cả là có chất ưa nước. 22 Trò số và dấu điện tích của vật liệu cố đònh cũng có vai trò nhất đònh. Việc gắn enzyme có hiệu quả hơn cả khi điện tích của enzyme và của vật liệu cố đònh có dấu ngược nhau. Vì lẽ điện tích cùng dấu có thể ngăn cản sự liên kết. Quá trình cố đònh enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu vật liệu cố đònh cố đònh có chứa các nhóm có khả năng tham gia tương tác trực tiếp với nhóm amin của enzyme. Trường hợp ngược lại quá trình xảy ra qua 2 giai đoạn : Giai đoạn hoạt hóa vật liệu cố đònh bằng cách đưa vào các nhóm chức năng có khả năng phản ứng hơn. Giai đoạn hai giai đoạn kết hợp enzyme. Trường hợp không cần hoạt hóa vật liệu cố đònh thể hiện rõ trong trường hợp copolymer của maleic alhydric và ethylen. Copolymer được dùng phổ biến làm vật liệu cố đònh để điều chế các dẫn xuất không tan của protease và một số enzyme khác. Trường hợp hoạt hóa vật liệu cố đònh : Hoạt hóa chất mang bằng cyanogen halogenur : Các chất mang có bản chất là polysaccharide ( OH) thường được hoạt hóa sơ bộ bằng cyanogen halogenur. Phản ứng hoạt hóa xảy ra trong môi trường kiềm. Chất mang hoạt hóa có khả năng liên kết cộng hóa trò với [ NH 2 ] của protein của enzyme. Porath và Bar Eli lần đầu tiên hoạt hóa cellulose, agarose và dextran bằng phương pháp này. Quá trình diễn ra như sau: Khi xử lý polysaccharide bằng BrCN sẽ tạo ra imidocarbonate. Carbonate bền vững, còn imidocarbonate tương tác với [ NH 2 ] 23 NH C O O OH N CNOH OH OH CNBr + ENZYME + ENZYME OH ENZYMENHCO NH OH ENZYMENHCO O Hoạt hóa bằng ethyl chloroformate : Khi sử dụng phương pháp hoạt hóa bằng cyanogenbromide, Cyanogenbromide và các sản phẩm trung gian rất độc. Chloroformate có thể được sử dụng để tạo ra các sản phẩm trung gian tương tự nhưng không có độc tính. Phương pháp được thực hiện như sau : OH ENZYMENHCO O O C O O HCClO OH OH ENZYM 522 Hoạt hóa bằng carbodiimide Các chất mang có chứa nhóm carboxyl, có thể được hoạt hóa bằng các dẫn xuất carbodiimide. Phản ứng xảy ra trong môi trường acid yếu (pH = 5), nên phương pháp hoạt hóa này phù hợp với các enzyme amylase, pepsin, cellulase … 24 ENZYMNHC O R' N C CO NH O HOC O ENZYMR'NCNR R Hoạt hóa bằng glutaraldehyde Các chất mang có chứa nhóm NH 2 như polyacrylamide,chitin, chitosan, cellulose, tinh bột ghép acrylamide đều có thể sử dụng phương pháp này. Glutaraldehyde là chất có chứa hai nhóm aldehyde hoạt hóa. Một nhóm sẽ gắn với NH 2 của chất mang, nhóm còn lại sẽ gắn vào NH 2 của enzyme. OCH CH CH CH OCH 2 2 2 22 22 22 CHCHC OCH CHCHCHC OCH CHCHCHC OCH CH 22 22 22 CHCHCH OCH CHCHCH ENZYMNCH CHCHCH OCH NH CH Hoạt hóa bằng 3 aminopropyltriethoxysilane Hoạt hóa bằng trialkoxysilane cho phép hoạt hóa những vật liệu trơ như thủy tinh có thể gắn với enzyme. Thực hiện như sau : ENZYM + ENZYM 25 232 232 NH)Si(CHO)H(C NH)(CHSiOSiO O O NH)(CHSiOSiO O OHSiO O OHSiO O 232352 2 CClS NCS)(CHSiOSiO O O NCS)(CHSiOSiO O 32 32 + ENZYM ENZYMNHCNH)(CHSiOSiO S O O ENZYMNHCNH)(CHSiOSiO S O 32 32 Hoạt hóa bằng azide Hiện nay phương pháp này được xem là phương pháp hàng đầu. Các chất mang có chứa nhóm chức COOH như CM Cellulose, polyacrylamide và nylon có thể hoạt hóa bằng phương pháp này. Trước hết là ester hóa CM Cellulose. Sau đó chuyển ester thành hydrazide, rồi azide. Azide trong môi trường kiềm sẽ phản ứng [ NH 2 ] của enzyme. Phản ứng xảy ra theo sơ đồ : Glass 26 OH NHNHCOCH O NHNH OH OCHCOCH O OHCH OH COOHOCH 22 22 32 3 2 HNO 2 ENZYM OH ENZYMNHCOCH O 2 OH NCOCH O 32 Hoạt hóa bằng phản ứng diazo Những chất mang có nhóm amine có thể sử dụng phương pháp này. Muối diazo của chất mang hoạt hóa có thể phản ứng không chỉ với nhóm amin mà cả nhóm phenol, imidizol của protein của enzyme. Phản ứng cộng hóa trò với enzyme xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thường và môi trương nước trung bình. Quá trình hoạt hóa và gắn enzyme như sau : OH NN CHO HCl ,NaNO OH NH CHO 2 2 22 + ENZYM OH ENZYMNN CHO 2 27 Phương pháp liên kết ion Dựa trên khả năng tạo liên kết giữa chất mang với enzyme. Liên kết ion thường không bền bằng sự hấp thụ giữa enzyme với chất mang. Năm 1956, Mitz là người đầu tiên thực hiện phương pháp liên kết ion để gắn enzyme vào chất mang. Ông đã sử dụng DEAE để gắn enzyme vào. Năm 1966, Tosa đã sử dụng DEAE sephadex như một chất mang để gắn aminoacrylase trong qui trình công nghiệp sản xuất amino acid, sau đó là hàng loạt nghiên cứu theo phương pháp này và được áp dụng khá thành công ở qui mô công nghiệp. d. Phương pháp khâu mạch (cross linking) Những hợp chất có hai hoặc đa nhóm chức năng như glutaraldehyde, diisocyanate được dùng làm cầu nối khâu mạch tạo thành đại phân tử không tan trong nước. Phương pháp này thường cho hoạt tính thấp là do các hợp chất khâu mạch có thể liên kết vào trung tâm hoạt động của enzyme. Trên đây là một số phương pháp cố đònh enzyme, sự lựa chon đúng phương pháp thích hợp cho từng enzyme và vật liệu cố đònh chuyên biệt là một yếu tố tối quan trọng để thu được chế phẩm enzyme cố đònh có hoạt tính cao. Đồng thời cần xác đònh các điều kiện hoạt động thích hợp cho enzyme cố đònh. Vì vậy để cho quá trình cố đònh có kết quả nên lưu ý : Enzyme phải ổn đònh trong những điều kiện diễn ra phản ứng. Các chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang chủ yếu chỉ tương tác với những nhóm chức năng nằm ngoài trung tâm hoạt động enzyme hoặc tạo liên kết ngang có kích thước lớn không cho phép nó xâm nhập vào trung tâm hoạt động enzyme. Trung tâm hoạt động phải luôn được “bảo vệ” bằng nhiều phương pháp khác nhau như : Enzyme chứa nhóm SH thì cần phải xử lý sơ bộ nó bằng glutathinon hay cystein và chỉ tái hoạt hóa enzyme sau khi đã gắn nó vào vật 28 liệu cố đònh hoặc bổ sung vào hỗn hợp phản ứng cơ chất đã được bão hòa bởi enzyme. Cần chọn biện pháp thích hợp để tách “enzyme không được gắn” lên vật liệu cố đònh, mà không gây ảnh hưởng xấu đến enzyme được gắn. Khi lựa chọn hệ cố đònh cần để ý đến phản ứng cụ thể và thật vô nghóa nếu đưa enzyme vào vật liệu cố đònh mà bản chất vật liệu cố đònh là polymer bò phân giải bởi enzyme này xúc tác hoặc đặc biệt nếu enzyme bò ức chế bởi sản phẩm của phản ứng tạo ra. 2.3. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH [3] 2.3.1. Trong công nghiệp Ngày nay, nhiều qui trình ứng dụng enzyme cố đònh trong công nghiệp như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất. Rượu bia : các enzyme amylase, tế bào nấm men cố đònh enzyme được sử dụng với qui mô lớn. Chế biến sữa : Enzyme lactase cố đònh để thủy phân lactose trong sữa. Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoamylase cố đònh. Năm 1971 đã dùng chymotrysin liên kết cộng hóa trò với carboximethyl cellulase làm đông tụ sữa thay cho renin đắt tiền. Thu nhận hỗn hợp glucose fructose Năm 1973 hãng Clinton Corn (Mỹ) đưa vào sản xuất công nghiệp glucoisomerase chuyển hóa glucose thành fructose với tỉ lệ 1:1, thông thường được gắn với các polymer vô cơ qua các liên kết đồng hóa trò. Tách hỗn hợp aminoacid nhờ aminocylase Công trình được sử dụng đầu tiên ở Nhật Bản để sản xuất methionine. Hãng Snam Progetti (Ý) nhốt aminoacid trong sợi cellulose triacetat. Hãng Tanaka Cuaky (Nhật) sử dụng phương pháp hấp thụ aminoacid trên DEAE Cellulose. 29 Thu nhận l asparric acid Aspartase cố đònh xúc tác quá trình gắn nhóm NH 3 vào fumaric acid để nhận được L aspartic acid (1973) hiệu suất chuyển hóa lá 80%. Aspartic cố đònh thu nhận bằng cách nhốt tế bào trong gel polyacrylamide. Thu nhận l succinic acid Fumarase cố đònh chuyển hóa fumaric acid thành L succinic acid được thực hiện ở qui mô công nghiệp năm 1974, phản ứng xảy ra cho đến khi 80% fumaric acid được chuyển hóa. Fumarase cố đònh được thu nhận bằng cách nhốt tế bào trong gel polyacrylamide hoặc sợi triacetate cellulose. Thu nhận 6 amino penicillinic acid 6 APA là bán sản xuất để tổng hợp các loại penicilin khác nhau, lần đầu tiên được hãng Snam Progetti 1975 đã sử dụng penicillinamiolase cố đònh để sản xuất penicillin. Thủy giải lactose Lactose hay còn gọi là “đường sữa” có độ ngọt và độ hòa tan thấp, bò thủy giải bởi lactase thành glucose và galactose. Các chế phẩm lactase cố đònh đã được chế tạo theo phương pháp khác nhau: nhốt trong sợi triacetate cellulose, liên kết đồng hóa trò với các polymer chứa silic, hấp thụ trên các chất trao đổi ion. Thu nhận từ tinh bột Để thu nhận glucose phải sử dụng hai enzyme là amylase và glucoamylase phân cắt tinh bột thành các oligosaccharide, còn glucoamylase phân cắt tinh bột và tạo thành glucose. Hiện nay người ta chú ý tạo glucoamylase cố đònh. Hãng Corning Glass đã sử dụng glucoamylase cố đònh để sản xuất 450 kg glucose/ngày. Chế phẩm glucoamylase cố đònh được thu nhận bằng cách gắn enzyme trên silicagel, nhốt trong sợi triacetate cellulose hấp thụ trên DEAE Cellulose. 30 Ngoài ra, hiện nay vô số enzyme đắt tiền khác đang được tiến hành cố đònh và nghiên cứu sử dụng ở qui mô công nghiệp. 2.3.2. Trong y học Enzyme cố đònh được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa các bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu. Năm 1954 Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trên cơ thể lâu dài vì enzyme bò biệt lập với môi trường xung quanh. Nhờ thế mà cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bò ảnh hưởng đến các phản ứng phụ. Urease cố đònh được dùng để loại urea trong máu của thận nhân tạo. Các tiểu cầu có gắn catalase dùng trò thiếu catalase cơ. Enzyme cố đònh còn được dùng trong chẩn đoán bệnh, ngoài các ứng dụng điện cực enzyme, trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như lượng glucose, urea, cholesterol… enzyme horse radish peroxidase cố đònh trên polystyren cùng với kháng thể giúp chẩn đoán nhanh và chính xác (kỹ thuật ELLISA). Enzyme 1 asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của khối u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể thì bò đưa ra ngoài nhanh chóng và gây hiện tượng dò ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả hơn. 2.3.3. Trong nghiên cứu khoa học Trước tiên enzyme cố đònh là công cụ nghiên cứu hóa sinh rất quan trọng. Năm 1967, điện cực enzyme đầu tiên đã được chế tạo để xác đònh nồng độ glucose nhờ glucooxydase cố đònh. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt có gel poly acrylamide. Nhúng điện cực vào dung dòch có glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme. Như vậy, sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ của phản ứng và nồng độ glucose. Kaetsu đã dùng điện cực urease để đo nồng độ urea trong máu, dùng cholesterol oxidase đo nồng độ cholesterol. . Aspartase cố đònh xúc tác quá trình gắn nhóm NH 3 vào fumaric acid để nhận được L aspartic acid (19 73) hiệu suất chuyển hóa lá 80%. Aspartic cố đònh thu nhận bằng cách nhốt tế bào trong gel. sữa, sản xuất da, hóa chất. Rượu bia : các enzyme amylase, tế bào nấm men cố đònh enzyme được sử dụng với qui mô lớn. Chế biến sữa : Enzyme lactase cố đònh để thủy phân lactose trong sữa cố đònh không tái sử dụng được, phương pháp này áp dụng cho các enzyme ổn đònh hoạt tính khi cố đònh. Enzyme cố đònh có thể tạo ra bằng hai cách – Nối đồng hóa trò liên kết các phân tử enzyme