NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME [2 ] 2.1.1 Khái niệm về enzyme Trong các phản ứng hóa học nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần.
Trang 1Phần 1
LỜI NÓI ĐẦU Enzyme là một chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thức phẩm, trong y học, trong kỹ nghệ phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường
Ngày nay, những nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong sản xuất công nghiệp phát triển rất mạnh Các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tăng khả năng sử dụng enzyme, kéo dài thời gian, số lần sử dụng enzyme giảm giá thành sử dụng enzyme Một trong những bước tiến quan trọng nhất hiện nay là kỹ thuật cố định enzyme trên giá thể tạo ra các dạng enzyme cố định (enzyme không hòa tan) Enzyme cố định ở các nước phát triển đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều qui trình công nghệ như: chế biến thực phẩm, y sinh học và nghiên cứu khoa học Tuy nhiên hiện nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme cố định ở Việt Nam chưa được phổ biến lắm và vẫn còn là hướng phát triển mới mẻ
Để góp phần vào những nghiên cứu về enzyme cố định đồng thời được sự chấp thuận của bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh,
dưới sự hướng dẫn của Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, tôi thực hiện đề tài “Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate” tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
thuộc trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh
Trang 2Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME [2 ]
2.1.1 Khái niệm về enzyme
Trong các phản ứng hóa học nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác
Chất xúc tác có hai đặc điểm quan trọng
Làm tăng phản ứng hóa học
Bản thân chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng
Chất xúc tác hóa học chỉ làm thay đổi tốc độ phản ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay năng lượng sử dụng trong phản ứng Trong các phản ứng sinh học xảy ra trong cơ thể sinh vật cũng có
các chất làm tăng phản ứng Chất đó dược gọi là enzyme
Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng hóa học trong cơ thể Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ Sau này các nhà khoa học xác định bản chất của enzyme là protein
Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể
Điểm rất khác biệt của enzyme là chúng hoạt động trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa trong cơ thể sinh vật Trong khi đó, các chất hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng Những ưu điểm cơ bản của enzyme có thể tóm tắt như sau :
Trang 31 Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất
2 Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao
3 Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm của phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo
4 Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít
5 Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật
6 Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm ra hơn 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ so với số lượng thật có trong mỗi tế bào
Dị hóa
ngoài tế bào
Vật chất
có kích thước nhỏ
Tế bào
Vật chất dị hóa ra khỏi tế bào Vật chất tổng hợp
ra khỏi tế bào
(sản phẩm bậc 1)
Sản phẩm bậc 2
Hình 2.1 : Hệ thống tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật
Enzym ngoại bào
Vật chất có kích thước lớn
nội bào trong tế
Quá trình bào
tổng hợp
Trang 42.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme
a Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme
Cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất qua ba giai đoạn
Giai đoạn 1 : Enzyme tương tác với cơ chất tạo thành phức enzyme cơ chất E S
Giai đoạn 2 : Phức enzyme cơ chất sẽ được tách ra
Giai đoạn 3 : Enzyme sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm Như vậy ở giai đoạn đầu, nếu cơ chất có nồng độ thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất
Hình 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng của enzyme
Vận tốc phản ứng được tính như sau :
S K
S V
V
m
Phương trình trên gọi là phương trình Michealis Menten
Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng Nhưng khi tốc đố phản ứng đạt giá trị cực đại, cho dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo
Nồng độ cơ chất
Tốc độ
phản ứng
Km
Trang 5b Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme
Trong các phản ứng hóa học, nhiệt độ càng tăng, tốc độ phản ứng xúc tác càng tăng Trong các phản ứng sinh học, nhiệt độ tăng khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng Nhưng khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh
Hình 2.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme
Hiện tượng đặc biệt này ở enzyme có liên quan đến bản chất hóa học của enzyme Các enzyme là những protein thường không bền nhiệt Trường hợp ta tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất Khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính enzyme sẽ mất dần và đi đến chỗ triệt tiêu
c Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme
Trong những nghiên cứu thí nghiệm về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng : nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt tới điểm cực đại giá trị pH, mà ở đó vận tốc phản ứng enzyme đạt giá trị cực đại gọi là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme Vượt quá giá trị pH này hoạt động enzyme sẽ giảm
Nhiệt độ Tốc độ
phản ứng
Trang 6Hình 2.4: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme
Mỗi loại enzyme sẽ có khoảng pH tối ưu và điểm pH tối ưu
pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES
d Ảnh hưởng của các chất kìm hãm các hoạt tính enzyme
Hoạt tính của enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm Những chất kìm hãm là những chất hoa học có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme Các chất kìm hãm thường là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ và cả protein
Các chất chia ra làm 2 loại :
Chất kìm hãm cạnh tranh
Chất kìm hãm không cạnh tranh
Chất kìm hãm cạnh tranh : Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc không gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất Do đó, chúng có khả năng kết hợp với enzym, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành phức chất ES
pH
Vận tốc phản ứng
pH op
Trang 7Hình 2.5 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh đến hoạt tính enzyme
Chất kìm hãm không cạnh tranh :
Các chất kìm hãm không cạnh tranh tham gia kết hợp với enzym không phải ở trung tâm hoạt động của enzym mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzym Người ta còn gọi vị trí này là trung tâm kìm hãm của enzym
Khi chất kìm hãm kết hợp với enzym ở ngoài trung tâm hoạt động của enzym sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzym Nhờ vậy, chúng sẽ làm giảm tốc độ phản ứng của enzym Trong rất nhiều trường hợp, sản phẩm cuối của chuỗi phản ứng hay của một phản ứng thường là chất kìm hãm không cạnh tranh
Hình 2.6 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm không cạnh tranh đến hoạt tính enzyme
Trang 8e Ảnh hưởng của chất hoạt hóa đến hoạt tính của enzym
Các chất hoạt hóa (activator) là những chất làm tăng khả năng xúc tác của enzym Các chất hoạt hóa có bản chất hóa học khác nhau Các amin, các chất hữu
cơ có cấu trúc hóa học khác nhau
Khả năng làm tăng hoạt tính của enzym của những chất hoạt hóa cũng có một giới hạn nhất định, vượt quá giới hạn này rất có thể lại làm giảm hoạt tính của enzym
2.2 NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM CỐ ĐỊNH
2.2.1 Khái niệm, đặc điểm của enzym cố định
a Khái niệm enzym cố định
Enzym cố định (immobilised enzym) hay enzym không hòa tan (insolube enzym) được hiểu theo cả nghĩa hẹp và nghĩa rộng
Theo nghĩa hẹp : được hiểu theo Michael Trevan: thuật ngữ enzyme cố
định là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn
Pha enzyme // Pha dung dịch tự do
Hình 2.7 : Mô hình hệ thống hai pha của enzym cố định
Theo nghĩa rộng : Theo Kkaus Mosbach : Các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại Như vậy theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme đã được cố định và một
Trang 9chất mang, bao gồm cả enzyme có trong tế bào sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần Enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quá trình gắn này enzyme chuyển từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan
b Đặc điểm của enzyme cố định
Nhờ những tính chất ưu việt do đó ngày nay enzyme cố định đang ngày càng sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghệ : Những ưu điểm nổi bật của enzyme cố định
Enzyme là những chế phẩm sinh học đắt tiền, nếu sử dụng ở dạng hòa tan thì chỉ sử dụng được một lần và khó thu hồi trở lại Ngược lại khi enzyme được cố định trên giá thể polymer nên có thể sử dụng liên tục trong nhiều ngày, thậm chí hàng tháng mà không mất hoặc chỉ giảm hoạt tính, vì vậy rất kinh tế
Do được cố định ở một pha riêng, do đó dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi enzyme, vì vậy sản phẩm dễ tinh sạch hơn do không trộn lẫn với enzyme Điều này đặc biệt có ý nghĩa khi ứng dụng enzyme cố định trong dược học, trong công nghệ sản xuất hóa chất và trong phân tích
Có thể dừng hóa trình chuyển hóa ở bất kỳ giai đoạn nào cần thiết khi dễ dàng tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất trong trường hợp yêu cầu sản phẩm chỉ là các sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa
– Khi được cố định trên giá thể enzyme có khả năng bền vững hơn, hoạt tính ổn định hơn khi có những thay đổi của môi trường như nhiệt độ, pH,… so với enzyme tự do Nhờ được cố định trên giá thể nên enzyme ít bị biến tính hơn khi môi trường thay đổi
Sử dụng chế phẩm enzyme cố định, đặc biệt thích hợp với các qui trình công nghệ liên tục, tự động hóa ngày nay Thường thì enzyme cố định được nhồi
Trang 10vào các cột, tháp, fermentor, với dòng cơ chất liên tục được chảy vào và đầu ra là sản phẩm
Tuy nhiên enzyme cố định cũng có những nhược điểm nhất định là vì được cố định nên đã hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất Vì vậy hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme tự do, đặc biệt là trong trường hợp cơ chất là các chất có trọng lượng phân tử lớn như : protein, tinh bột, chitosan Trong trường hợp enzyme được cố định bằng phương pháp nhốt (entrapment method) trong khuôn gel thì chỉ một phần enzyme nằm ở lớp vỏ ngoài của gel là hoạt động Đặc biệt khi enzyme được cố định bằng phương pháp cộng hóa trị thì một lượng đáng kể enzyme bị mất hoạt tính
do chất hoạt hóa và có thể do liên kết không đặc hiệu xảy ra ở trung tâm hoạt động của enzyme
2.2.2.Chất mang dùng để cố định enzyme
Theo Michael Trevan, một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau đây :
+ Chất mang lý tưởng trong sử dụng cố định enzyme điều trước hết là cần phải rẻ Điều này liên quan đến hiệu quả kinh tế của qui trình công nghệ
+ Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định
+ Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme
+ Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật
+ Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định enzyme vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố định và số lần tái sử dụng