Luận văn : XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU ĐỂ THU SINH KHỐI VÀ ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC part 8 docx

2.5. Lugol Indine 1 g Potassium iodone 2 g Nước cất 300 ml 2.6. Fuchin kiềm Fuchin kiềm 10 ml (dung dịch bão hòa trong rượu etylic 95%) Phenol 5 ml Nước cất 100 ml Lắc đều lọc qua giấy 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase (Phương pháp Wolhgemuth) Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột với chất chỉ thị màu iodine. Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 30 o C, khi có ion clorine có thể phân giải 1 mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với iodine. Hoạt tính của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth trên 1 ml dịch môi trường hoặc 1 ml dung dịch chiết enzyme. 3.1.1. Thiết bị, vật liệu và hóa chất 9 Bình tam giác hay bình cầu 9 Ống nghiệm 9 Máy ly tâm hay máy lọc 9 Pipet tự động 9 Dung dịch enzyme: Nghiền cẩn thận môi trường thạch có chứa vi sinh vật, cân 20 – 100 g cho vào bình tam giác hay bình cầu, thêm 500 – 1000 ml dung dịch NaCl 1%, lắc liên tục từ 1 - 2 giờ trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Lọc hoặc ly tâm để thu được dịch chiết trong suốt. Nếu môi trường nuôi cấy là dịch thể chỉ cần ly tâm tách sinh khối rồi sử dụng phần chất lỏng trong suốt thu được để phân tích. 9 Dung dịch tinh bột 0,1% 9 Dung dịch NaCl 0,1% 9 Dung dịch iod 0,02% 3.1.2. Cách tiến hành Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1ml dung dịch NaCl 0,1%. Thêm vào ống thứ nhất 1ml enzyme rồi lắc đều, lấy 1 ml chuyển sang ống thứ hai lại lắc đều và lấy 1ml chuyển sang ống thứ ba… Cứ thế cho đến ống thứ 10, sau cùng lấy 1ml ở ống thứ 10 bỏ đi. Cho vào mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều, giữ ở 30 o C trong 30 phút. Làm lạnh, cho vào một giọt dung dịch iodine 0,02 N. Ghi nhận ống có độ pha loãng lớn nhất mà không tạo màu với iodine. Ví dụ: Các ống từ 1 đến 4 không tạo màu, nhưng ống thứ 5 trở đi có màu thì hoạt tính của enzyme trong 1ml dung dịch enzyme là 16 ° 2 = 32 đơn vị. Trong đó 16 là độ pha loãng của dung dịch enzyme trong ống thứ 4, 2 là số mg tinh bột trong mỗi ống nghiệm. 3.2. Phương pháp kiểm tra hoạt tính protease (phương pháp Gross và Fluld) Trong môi trường kiềm yếu, casein bị hòa tan nhưng khi thêm acid acetic trong ethanol, casein bị kết tủa. Trái lại, các sản phẩm thủy phân của casein lại không bị kết tủa trong điều kiện này. Phương pháp Gross và Fluld dựa trên cơ sở xác định lượng enzyme ít nhất cần thiết để phân giải 2 mg casein đến mức không bị kết tủa bởi acid acetic trong ethanol. Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme 1 ml dung dịch nghiên cứu có khả năng phân giải 1 mg casein ở 38 o C trong thời gian 30 phút. 3.2.1. Thiết bị, vật liệu và hóa chất 9 Bể điều nhiệt hay tủ ấm (38 o C) 9 Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) 9 Ống nghiệm 9 Dung dịch casein 0,1% 9 Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol 3.2.2. Cách tiến hành Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô Cho vào mỗi ống 1 ml nuớc cất, trừ ống thứ nhất Cho vào ống thứ nhất và ống thứ hai mỗi ống 1 ml dịch chứa enzyme, lắc đều. Chuyển 1ml dung dịch của ống thứ hai vào ống thứ ba, lắc đều. Chuyển 1ml dung dịch của ống thứ ba vào ống thứ tư, lắc đều. Cứ như vậy cho đến ống thứ 12. Lấy 1 ml từ ống thứ 12 bỏ đi. Như thế thể tích chất lỏng trong tất cả các ống đều là 1 ml. Tăng nhiệt độ của các ống đến nhiệt độ 38 o C bằng cách đặt chúng vào bể điều nhiệt cài ở 38 0 C từ 10 – 15 phút. Thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch casein 0,1% có nhiệt độ 38 o C, lắc đều. Giữ ở 38 o C trong 30 phút. Đúng 30 phút làm lạnh ngay trong nuớc đá để ngừng phản ứng. Nhỏ theo vách mỗi ống vài giọt dung dịch acid acetic trong dung dịch ethanol. Nếu thấy tất cả các ống đều kết tủa trắng, chứng tỏ lượng enzyme không đủ để phân giải hết casein. Cần phải chuẩn bị lại dung dịch enzyme có nồng độ cao hơn. Còn nếu ở tất cả các ống đều không xuất hiện kết tủa cần phải pha loãng dung dịch enzyme đem phân tích. Trong trường hợp có một số ống xuất hiện kết tủa, số còn lại không kết tủa thì chọn lấy ống không kết tủa cuối cùng (đứng trước ống bắt đầu cho kết tủa) là ống có lượng enzyme bé nhất có khả năng phân giải hoàn toàn 2 mg casein. Ví dụ, ở ống thứ 7 là ống cuối cùng không cho kết tủa, lượng enzyme ban đầu bị pha loãng 64 lần trong ống này, tương đương với 0,0156 ml dung dịch enzyme ban đầu, và như vậy 1 ml dung dịch enzyme ban đầu có hoạt độ là 2/0,0156 = 128 đơn vị. Từ đó tính ra hoạt độ của enzyme trong 1 gam chế phẩm. 3.3. Cách Nhuộm Gram 9 Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn. 9 Cho thuốc nhuộm cristal violet (để 2 phút). 9 Cho thuốc nhuộm lugol (2 phút). 9 Tẩy màu bằng ethanol nguyên chất cho tới khi bạc màu. 9 Rửa qua nước. 9 Làm khô tiêu bản, soi trên kính hiển vi. Kết Quả: Vi khuẩn gram dương có màu nâu tím còn gram âm có màu đỏ nếu nhuộm với fuchin hoặc màu hồng nếu nhuộm với safrain. 3.4. Phương pháp chuẩn độ Therne Mục đích: việc định lượng acid lactic sản sinh từ việc lên men đường lactose bởi tác động của vi khuẩn lên men acid lactic đồng hình hay dị hình trong sữa là một mặt cho phép xác định độ acid của sữa, mặt khác cho phép kiểm tra tiến trình lên men trong quá trình chế biến. Cách làm: lấy 20ml sữa chua, thêm 80ml nước cất và một hay hai giọt phenoltalein. Sau đó chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng đỏ bền hay trong 30 giây thì dừng lại. Độ acid được tính 0 T ( Therner) = số NaOH 0,1N tiêu tốn x 5 % acid lactic = 0 T x 0,009 3.5. Phương pháp gián tiếp đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch Nguyên tắc của phương pháp này là cấy 1 thể tích xác định dung dịch huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trong đĩa petri và sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên sau khi ủ. Khi đó ta coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào. Thực hành: - Trước tiên phải ghi độ pha loãng và ngày cấy lên đĩa petri - Lắc đều 3 ống pha loãng liên tiếp, dùng ống hút vô trùng (loại 1 ml) để hút 0,5 ml dd pha loãng vào sữa mặt thạch bằng que gạt thủy tinh vô trùng. Mỗi độ pha loãng cấy 3 petri lặp lại. Đặt trong tủ ấm nuôi dưỡng ở nhiệt độ thích hợp. Số lượng tế bào trong 1g mẫu khô tuyệt đối được tính bằng công thức: Số tế bào / g = M x a x 10 n x N M: số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa petri a: thể tích mẫu được cấy vào hộp petri 10 n : độ pha loãng N : hệ số tính theo trọng lượng mẫu khô tuyệt đối 3.6. Đếm tế bào vi sinh vật trên các vết bôi đã được cố định 3.6.1. Vật liệu và dụng cụ Phiến lam sạch Micropipet loại 0,01 ml Que cấy vòng, thuốc nhuộm gram, kính hiển vi, dầu soi kính… 3.6.2. Làm vết bôi Dùng micropipet lấy chính xác một thể tích nhất định dịch huyền phù cần nghiên cứu trải lên miếng kính sạch, làm khô và đặt trên giấy kẻ ly để có được các ô có diện tích 4 cm 2 . Thêm vào một giọt dịch huyền phù này một giọt dung dịch thạch agar 0,03% vô trùng. Dùng que cấy đầu tròn vô trùng trộn nhanh chúng rồi phân bố đều ra trên diện tích đã được vạch lên giấy, vết bôi được làm khô trong không khí, cố định bằng đèn cồn sau đó cho 1 - 2 giọt thuốc nhuộm crytal violet trong 2 phút sau đó rửa lại bằng nuớc sạch. Tiêu bản chuẩn bị xong được làm khô trong không khí. 3.6.3. Cách tính toán số lượng vi sinh vật Đếm số lượng vi sinh vật trong vi trường, mỗi vết bôi đếm 3 - 5 vi trường để lấy giá trị trung bình của số vi sinh vật có trong một vi trường. Số lượng vi sinh vật có trong 1 ml dịch mẫu X = A × 0004,0 400 × hV × 1 Trong đó: X : số vi khuẩn có trong 1ml mẫu A : số vi sinh vật trung bình có trong một hiển vi trường h: hệ số pha loãng V : thể tích vi sinh vật cho vào ô vuông để làm vết bôi 3.7. Đơn vị hoạt độ Người ta biểu thị đơn vị hoạt độ qua những đơn vị hoạt độ như sau: • Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI) Đơn vị hoạt độ quốc tế là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1µmol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1UI = 1µmol cơ chất (10 -6 mol)/phút • Katal (Kat). Đơn vị Kat là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa đựơc một mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 Kat = 1 mol cơ chất/giây 1UI = 60 1 10 -6 Kat = 16,67 nKat (nanoKatal) • Hoạt độ riêng Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị WI (hoặc một đơn vị Katal) ứng với một militre dung dịch (nếu là dung dịch) hoặc một miligram protein (nếu là bột khô) của chế phẩm enzyme. Khi biết được khối lượng phân tử của enzyme ta hoàn toàn có thể tính được hoạt độ riêng của phân tử. • MWU (đơn vị Wohlgemuth cải tiến) Đơn vị MWU là đơn vị biểu thị một lượng enzyme cần thiết chuyển hóa một mg tinh bột hòa tan đến dextrin trong 30 phút ở điều kiện thí nghiệm. • SKB (đơn vị hoạt động enzyme này do Sandstedt, Kneen, Blish đưa ra). Đơn vị SKB là đơn vị hoạt độ enzyme được đo bằng lượng enzyme cần thiết để dextrin hóa một gam ß-dextrin giới hạn đến kích thước xác định sau một giờ ở điều kiện thí nghiệm . • GAU (đơn vị đo hoạt độ của glucoamylase). Đơn vị GAU là số lượng enzyme cần thiết đưa vào phản ứng để giải phóng một gam đường glucose sau một giờ trong điều kiện thí nghiệm. • NU (đơn vị Nothrop). Đơn vị NU là số lượng enzyme cần thiết đưa vào phản ứng, giải phóng ra 67,08 mg nitrogen phi protein trong điều kiện thí nghiệm. • HU (đơn vị dextrinogen). Đơn vị HU là số lượng enzyme cần thiết sử dụng để chuyển hóa một pound tinh bột đến dextrose trong 72 - 96 giờ ở pH = 4 và 60 o C. • AU (đơn vị Auson). Đơn vị Auson được đưa ra để đo hoạt tính enzyme sử dụng trong chất tẩy rửa. Mỗi một gam chứa 25 – 30 đơn vị Auson của enzyme sultilin tinh thể. Đơn vị được biểu diễn µ/g (đo bằng hemoglobin). KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ TRÊN BACILLUS SUBTILIS Trên môi trường nhân giống cấp 1 One-way ANOVA: soluong versus Moitruong Analysis of Variance for soluong Source DF SS MS F P Moitruon 4 3.5434 0.8858 10.19 0.001 Error 10 0.8697 0.0870 Total 14 4.4131 One-way ANOVA: Amylase versus Moitruong Analysis of Variance for Amylase Source DF SS MS F P Moitruon 4 139622.4 34905.6 1636.20 0.000 Error 10 213.3 21.3 Total 14 139835.7 One-way ANOVA: Protease versus Moitruong Analysis of Variance for Protease Source DF SS MS F P Moitruon 4 30353.07 7588.27 1778.50 0.000 Error 10 42.67 4.27 Total 14 30395.73 Trên môi trường nhân giống cấp 2 One-way ANOVA: Soluong versus Moitruong Analysis of Variance for Soluong Source DF SS MS F P Moitruon 4 258338 64584 16.92 0.000 Error 10 38176 3818 Total 14 296514 KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ TRÊN L. ACIDOPHILUS Trên môi trường sữa đặc có đường One-way ANOVA: Therne versus Nongdo Analysis of Variance for Therne Source DF SS MS F P Nongdo 2 0.18548 0.09274 35.57 0.000 Error 6 0.01564 0.00261 Total 8 0.20112 One-way ANOVA: Soluong versus Nongdo Analysis of Variance for Soluong Source DF SS MS F P Nongdo 2 2.9726 1.4863 35.66 0.000 Error 6 0.2501 0.0417 Total 8 3.2227 Trên môi trường sữa đậu nành General Linear Model: Therne versus Nongdo, %Duong Factor Type Levels Values Nongdo fixed 3 10 15 20 %Duong fixed 4 0.0 1.0 1.5 2.0 Analysis of Variance for Therne, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nongdo 2 0.31276 0.31276 0.15638 96.15 0.000 %Duong 3 1.58896 1.58896 0.52965 325.66 0.000 Nongdo*%Duong 6 0.14513 0.14513 0.02419 14.87 0.000 Error 24 0.03903 0.03903 0.00163 Total 35 2.08588 General Linear Model: Soluong versus Nongdo, %Duong Factor Type Levels Values Nongdo fixed 3 10 15 20 %Duong fixed 4 0.0 1.0 1.5 2.0 Analysis of Variance for Soluong, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nongdo 2 198.758 198.758 99.379 1033.63 0.000 %Duong 3 51.234 51.234 17.078 177.63 0.000 Nongdo*%Duong 6 20.074 20.074 3.346 34.80 0.000 Error 24 2.307 2.307 0.096 Total 35 272.374 . toán số lượng vi sinh vật Đếm số lượng vi sinh vật trong vi trường, mỗi vết bôi đếm 3 - 5 vi trường để lấy giá trị trung bình của số vi sinh vật có trong một vi trường. Số lượng vi sinh vật có. hV × 1 Trong đ : X : số vi khuẩn có trong 1ml mẫu A : số vi sinh vật trung bình có trong một hiển vi trường h: hệ số pha loãng V : thể tích vi sinh vật cho vào ô vuông để làm vết bôi 3.7 đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch Nguyên tắc của phương pháp này là cấy 1 thể tích xác định dung dịch huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trong đĩa petri và sau đó đếm số khuẩn