Luận văn : XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU ĐỂ THU SINH KHỐI VÀ ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC part 2 ppt

xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 1 36 Bảng 4.2. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp1 37 Bảng 4.3. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2 39 Bảng 4.4. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2 40 Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis trong thời gian bảo quản 42 Bảng 4.6. Kết quả thử phản ứng sinh hóa của Lactobacillus acidophilus 45 Bảng 4.7. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường 46 Bảng 4.8. Số lượng của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường 46 Bảng 4.9. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đậu nành 47 Bảng 4.10. Số lượng của L. acidophilus trên môi trường sữa đậu nành 47 Bảng 4.11. Số lượng vi khuẩn L. acidophilus sau thời gian bảo quản 48 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 Hình 2.2. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 5 Hình 2.3. Enzyme α-amylase 19 Hình 2.4. Enzyme protease 21 Hình 4.1. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Wolhgemuth 37 Hình 4.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Gross + Fuld 38 Hình 4.3 . Kiểm tra số lượng vi khuẩn B. subtilis trên môi trường A 39 Hình 4.4 . Sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường A và B 41 Hình 4.5 . Hoạt độ amylase trong chế phẩm chứa Bacillus subtilis 42 Hình 4.6 . Hoạt độ protease trong chế phẩm chứa Bacillus subtilis 42 Hình 4.7 . Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trên môi trường thạch MRSA 44 Hình 4.8. Khả năng lên men đường của Lactobacillus acidophilus 45 Hình 4.9. Chế phẩm chứa Bacillus subtilis và L. acidophilus sau khi đóng gói 48 xiii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis 27 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis 29 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus acidophilus 31 Sơ đồ 3.4. Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 32 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1. Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản 43 Biểu đồ 4.2. Số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sau thời gian bảo quản 48 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, con người có xu hướng trở dần về với tính chất thiên nhiên thông qua việc sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương pháp sinh học để ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường và để chữa bệnh. Lý do đơn giản là con người đã hiểu được mặt trái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh. Những chất này tuy có hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn. Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng những chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá Việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong muốn như sự kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng hơn và dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trong thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại rất lớn trong chăn nuôi. Để khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trực tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Kết quả đã chứng minh được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnh trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người. Điều quan trọng là nó không để lại những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi và thủy sản. 2 1.2. MỤC ĐÍCH Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng thủy sản. 1.3. YÊU CẦU 1.3.1. Đối với Bacillus subtilis 9 Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường khác nhau để xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease và amylase nhiều nhất. 9 Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis . 9 Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. 1.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 9 Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất. 9 Tìm môi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối và độ chua cao nhất. 9 Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. 9 Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. 3 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1. Lịch sử Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ chức y học Nari của Đức. Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957 Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “Subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa. 2.1.2. Phân loại và đặc điểm 2.1.2.1. Phân loại Theo khóa phân loại của Bergey vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.1.2.2. Đặc điểm Vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương (G + ), kích thước 0,5 - 0,8 µm × 1,8 – 3 µm. Đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 µm. Phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của bào tử. Chúng là loại vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36 - 50 o C, tối đa khoảng 60 o C, bào tử chịu nhiệt khá cao. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển của Bacilluss subtilis là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000). Chúng phân bố rộng rãi trong ngoại cảnh, nhất là trên bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây). Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatine nhanh chóng. Sữa cấy Bacillus subtilis trước tiên sau đó cấy men lactic trở nên acid nhanh chóng hơn sữa chỉ cấy men lactic. Vi khuẩn tác động bằng protease làm hình thành paraprotein từ casein, sữa cấy Bacillus subtilis bị kết tủa khi cho vào clorua calci (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). 4 Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa Bacillus subtilis có khuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán. Đường kính khuẩn lạc 3 – 5 mm, phát triển chậm, màu vàng xám ở giữa sậm màu, rìa có răng cưa. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trong môi trường canh (nutrian broth) chúng phát triển làm đục môi trường, tạo thành màng nhăn trên bề mặt, lắng cặn, ít hoặc không tạo nhớt. Bacillus subtilis cho một số phản ứng sinh hóa: • Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. • Indol (-), VP (+), nitrat (+), H 2 S (-), NH 3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), có khả năng di động và hiếu khí. 2.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC Theo hệ thống phân loại của Bergey năm 1979 thì vi khuẩn lactic được phân loại như sau: Họ: Lactobacteriaceae Họ phụ: Streptococcaceae Giống: Streptococcus Leuconostoc Họ phụ: Lactobacteriaceae Giống: Lactobacterium 2.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 2.2.1.1. Lịch sử Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại cũng như chức năng của vi khuẩn này. Năm 1906 Metchnikoff xuất bản cuốn “The prolongation of life optinistic studies”. Ông chứng minh rằng vi khuẩn lactic trong yoghurt bulgarian như là nhân tố chống lại sự thối rữa ruột và sự lão hóa. Tuy nhiên sau đó người ta khám phá ra rằng chủng vi khuẩn này không thể sống sót khi qua dạ dày và ruột. Do đó người ta nhanh chóng thay thế chủng vi khuẩn này bằng chủng L. acidophilus như là một probiotic trong ruột. Họ thấy rằng có rất nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình và dị hình sống trong ruột, miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài Lactobacillus lên men đồng hình tạo thành nhóm gọi là phức hợp Lactobacillus acidophilus. 5 2.2.1.2. Đặc điểm Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi khuẩn lactic. Chúng có dạng trực khuẩn dài và chịu nhiệt. Tế bào hình que, đầu tròn, kích thước 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µm đứng riêng rẻ, xếp thành đôi hay thành chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử, tế bào non bắt màu Gram dương khi nhuộm, tế bào già trở thành Gram âm. Vi hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37 o C, không phát triển ở 20 - 22 o C và 43 - 48 o C. Hình 2.2. Lactobacillus acidophilus Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm men khuẩn lạc có dạng tròn, nhỏ ở giữa dày và đục hơn mép ngoài. Trong môi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏ và có hình dạng không ổn định. Trên môi trường thạch nghiêng thì khuẩn lạc khô, phát triển kém và giới hạn theo vết cấy. Lên men lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acid lactic trong môi trường, không phát triển trong môi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt trên môi trường dịch thể cao nấm men. L. acidophilus là một dạng probiotic được sử dụng thường xuyên nhất. Là vi khuẩn có lợi cư trú trong ruột, âm đạo, trong phân người và động vật. Chúng có khả năng sinh Bacteriocin là chất có hoạt tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. L. acidophilus có khả năng lên men các loại đường: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose và không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol, mannitol, sorbitol, inositol. Cho các phản ứng: methyl red (+), indol (-), VP (-), citrate (-), catalase (-), khả năng đông vón sữa (+). 2.2.1.3. Quá trình trao đổi chất Hiện nay các thành viên của phức hợp Lactobacillus acidophilus được phân vào nhóm lên men đồng hình bắt buộc. Hexose được lên men để tạo thành acid lactic theo con đường EMP. Chúng có enzyme aldolase nhưng thiếu phosphoketolase, không lên men gluconat và pentose. Tất cả các loài đều tạo đồng phân dạng D và L của acid lactic (Lê Thị Hồng Tuyết, 2004). 6 2.2.1.4. Sự thay đổi thành phần của sữa trong quá trình lên men Trong quá trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có sự thay đổi sâu sắc các loại đường, casein và các thành phần khác. • Sự thay đổi đường sữa Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hóa lactose thành glucose và galactose. Lactase là một endoenzyme nên khi lactose muốn được chuyển hóa thì phải qua màng vi khuẩn. Lactose sẽ được chuyển hóa theo hai con đường: ¾ Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase (hay enzyme galactosidase) để bẻ gãy H 2 chuyển lactose thành glucose và galactose. ¾ Lactose được oxi hóa thông qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionat sau đó phân giải tiếp thành gluconat và galactose qua một giai đoạn diễn biến phức tạp, mỗi giai đoạn do một enzyme chuyên biệt phụ trách. • Sự thay đổi protein sữa Trong quá trình lên men, lượng acid hữu cơ các loại càng tích lũy càng làm tăng quá trình tách calci ra khỏi casein tạo pH đẳng điện. Do đó, casein bị vón lại làm tăng quá trình lên men tạo pepton và các sản phẩm khác nhau. 7 Con đường chuyển hóa chủ yếu của quá trình lên men sữa + CO 2 ADP ATP NAD + NADH ATP ADP Glucose-6 phosphat galactose Lactose glucose ATP ADP Fructose-6 phosphat 1,3 diphosphoglycerat Glyceraldehyd-3 phosphat Fructose-1,6 phosphat Dihydroxyaceton phosphat acid pyruvic Aldehyd acetic citric + 2H acid malic -CO 2 Acetyl- CoA acid propionic Chu trình acid citric Rượu etylic acid malic acid lactic +2H 2.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. 2.2.2.1. Trong công nghiệp Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic. Có vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Chúng được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid, ngoài ra còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo. . acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học để phục vụ trong chăn nuôi và thủy sản. 2 1 .2. MỤC ĐÍCH Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus. chất và thu c kháng sinh. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. . loại môi trường khác nhau để xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease và amylase nhiều nhất. 9 Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis . 9 Kiểm tra chất lượng của chế