Luận văn : XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU ĐỂ THU SINH KHỐI VÀ ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC part 1 pps

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP X X Á Á C C Đ Đ Ị Ị N N H H M M Ô Ô I I T T R R Ư Ư Ờ Ờ N N G G T T Ố Ố I I Ư Ư U U Đ Đ Ể Ể T T H H U U S S I I N N H H K K H H Ố Ố I I V V À À E E N N Z Z Y Y M M E E C C Ủ Ủ A A V V I I K K H H U U Ẩ Ẩ N N B B A A C C I I L L L L U U S S S S U U B B T T I I L L I I S S , , L L A A C C T T O O B B A A C C I I L L L L U U S S A A C C I I D D O O P P H H I I L L U U S S . . T T H H Ử Ử N N G G H H I I Ệ Ệ M M S S Ả Ả N N X X U U Ấ Ấ T T C C H H Ế Ế P P H H Ẩ Ẩ M M S S I I N N H H H H Ọ Ọ C C Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện : NGUYỄN ĐỨC DUY ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP X X Á Á C C Đ Đ Ị Ị N N H H M M Ô Ô I I T T R R Ư Ư Ờ Ờ N N G G T T Ố Ố I I Ư Ư U U Đ Đ Ể Ể T T H H U U S S I I N N H H K K H H Ố Ố I I V V À À E E N N Z Z Y Y M M E E C C Ủ Ủ A A V V I I K K H H U U Ẩ Ẩ N N B B A A C C I I L L L L U U S S S S U U B B T T I I L L I I S S , , L L A A C C T T O O B B A A C C I I L L L L U U S S A A C C I I D D O O P P H H I I L L U U S S . . T T H H Ử Ử N N G G H H I I Ệ Ệ M M S S Ả Ả N N X X U U Ấ Ấ T T C C H H Ế Ế P P H H Ẩ Ẩ M M S S I I N N H H H H Ọ Ọ C C GVHD: CN. TÔ MINH CHÂU SVTH: NGUYỄN ĐỨC DUY ANH TS. LÂM THỊ THU HƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 Ba, Mẹ ! Kính dâng lên ba mẹ những gì thiêng liêng nhất. Con rất hạnh phúc khi có được một người cha như ba và thật tự hào về mẹ. Muôn đời biết ơn đến ba, mẹ. Người đã dạy dỗ và nuôi con khôn lớn cho đến ngày hôm nay. Xin được tỏ lòng kính trọng đến họ hàng cùng lời thân thương đến các anh chò trong gia đình. LỜI CẢM ƠN Xin được tỏ lòng biết ơn đến cô Tô Minh Châu. Người đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt cho tôi hoàn thành khóa luận này. Ngàn lần gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Lâm Thị Thu Hương. Người đã định hướng, dìu dắt và luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập ở trường. Chân thành gửi lời cám ơn đến Ban Giám Hiệu, quý Thầy Cô đặc biệt là quý Thầy Cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức vô cùng quý báo cho tôi trong suốt thời gian học tập ở trường. Xin gửi lời cám ơn đến những người bạn của tôi. Đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong học tập và ngoài cuộc sống. v TÓM TẮT NGUYỄN ĐỨC DUY ANH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005. GVHD: CN. TÔ MINH CHÂU TS. LÂM THỊ THU HƯƠNG Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus. Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm số lượng tế bào, xác định hoạt độ enzyme amylase, protease và khả năng tạo độ chua của hai vi khuẩn nghiên cứu trên nhiều loại môi trường khác nhau. Kết quả chúng tôi ghi nhận được như sau: Đối với Bacillus subtilis Môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường nhân giống cấp 1 có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme amylase, protease cao nhất. Môi trường A là môi trường nhân giống cấp 2 có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme amylase, protease cao nhất. Thời gian nuôi cấy thích hợp là 72 giờ. Chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản có số lượng vi khuẩn giảm dần nhưng hoạt độ enzyme amylase và protease không thay đổi. Đối với Lactobacillus acidophilus Môi trường sữa đậu nành có nồng độ 15% đậu và bổ sung 15% đường là môi trường thích hợp nhất để sản xuất chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. Chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus sau thời gian bảo quản ở nhiệt độ thường số lượng vi khuẩn giảm dần. MỤC LỤC TRANG Trang tựa Lời cảm ơn Tóm tắt v Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt x Danh sách các bảng xi Danh sách các hình xii Danh sách các sơ đồ xiii Danh sách các biểu đồ xiii Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.2. MỤC ĐÍCH 2 1.3.YÊU CẦU 2 1.3.1. Đối với Bacillus subtilis 2 1.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 2 Phần 2. TỔNG QUAN 3 2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 3 2.1.1. Lịch sử 3 2.1.2. Phân loại và đặc điểm .3 2.1.2.1. Phân loại 3 2.1.2.2. Đặc điểm 3 2.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC 4 2.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 4 2.2.1.1. Lịch sử 4 2.2.1.2. Đặc điểm 5 2.2.1.3. Quá trình trao đổi chất 5 2.2.1.4. Sự thay đổi thành phần của sữa trong quá trình lên men 6 2.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic 7 2.2.2.1. Trong công nghiệp 7 vi 2.2.2.2. Trong nông nghiệp và môi trường 8 2.2.2.3. Trong y dược 8 2.2.2.4. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm 8 2.3. KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI SINH VẬT. 8 2.3.1. Đối với Bacillus subtilis 9 2.3.1.1. Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cao 9 2.3.1.2. Nguyên liệu để sản xuất enzyme α-amylase từ vi khuẩn 9 2.3.1.3. Nguyên liệu để sản xuất enzyme protease từ vi khuẩn. 10 2.3.1.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có khả năng sinh enzyme 10 2.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 11 2.3.2.1. Nhu cầu sinh trưởng 11 2.3.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng 11 2.3.2.3. Môi trường sản xuất 11 2.3.2.4. Điều kiện sản xuất 12 2.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PROBIOTIC 12 2.4.1. Định nghĩa probiotic 12 2.4.2. Cơ chế tác động 13 2.4.2.1. Duy trì hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột 13 2.4.2.2. Hoạt động đối kháng 13 2.4.2.3. Sự loại trừ cạnh tranh 14 2.4.2.4. Tăng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa 15 2.4.2.5. Sự trao đổi chất của vi khuẩn. 15 2.4.3. Vai trò của probiotic 15 2.4.4. Một số chế phẩm probiotic có chứa B. subtilis và L. acidophilus hiện nay 16 2.4.5. Một số đề tài đã nghiên cứu 17 2.4.5.1. Trong nước 17 2.4.5.2. Ngoài nước 18 2.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 18 2.5.1. Enzyme amylase 19 2.5.1.1. Đặc điểm enzyme α-amylase 19 2.5.1.2. Ứng dụng của α-amylase 20 2.5.2. Enzyme protease 21 vii 2.5.2.1. Nguồn thu nhận protease enzyme 21 2.5.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật 21 2.5.3. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme 22 2.5.3.1. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme 22 2.5.3.2. Đơn vị hoạt độ 23 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 24 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN 24 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24 3.2.1. Giống vi khuẩn 24 3.2.2. Thiết bị - dụng cụ 24 3.2.3. Hóa chất 24 3.2.4. Môi trường nuôi cấy 24 3.2.4.1. Đối với Bacillus subtilis 24 3.2.4.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 25 3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 25 3.3.1. Đối với Bacillus subtilis 25 3.3.1.1. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1 25 3.3.1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2 28 3.3.1.3. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis 29 3.3.1.4. Kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme 30 3.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 31 3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 32 3.3.2.2. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đặc có đường 33 3.3.2.3. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đậu nành 34 3.3.2.4. Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus 34 3.3.2.5. Kiểm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản 35 3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 35 3.4.1. Xử lý số liệu 35 viii 3.4.2. Biểu đồ 35 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1. ĐỐI VỚI BACILLUS SUBTILIS 36 4.1.1. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1 .36 4.1.1.1. Khả năng tăng sinh khối 36 4.1.1.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease 36 4.1.2. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2 38 4.1.2.1. Khả năng tăng sinh khối 39 4.1.2.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease 40 4.1.3. Kết quả kiểm tra số lượng B. subtilis và hoạt độ enzyme sau khi sản xuất chế phẩm 41 4.1.4. Kết quả kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản 42 4.2. ĐỐI VỚI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 44 4.2.1. Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus 44 4.2.1.1. Quan sát đại thể 44 4.2.1.2. Quan sát vi thể 44 4.2.1.3. Đặc điểm sinh hóa 44 4.2.2. Kết quả kiểm tra số lượng L. acidophilus và độ chua Therne trên từng loại môi trường .46 4.2.2.1. Trên môi trường sữa đặc có đường 46 4.2.2.2. Trên môi trường sữa đậu nành 46 4.2.3. Kết quả sản xuất thử và kiểm tra chế phẩm chứa L. acidophilus 47 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1. KẾT LUẬN 49 5.1.1. Đối với Bacillus subtilis 49 5.1.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 49 5.2. ĐỀ NGHỊ 50 5.3. TỒN TẠI 50 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC ix x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. awamori Aspergillus awamori B. subtilis Bacillus subtilis E. coli Escherichia coli L. acidophilus Lactobacillus acidophilus Str. Griseus Streptococcus griceus spp species plural MR Methyl red VP Voges proskauer ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate EMP Embden – Mayehoff phosphoryl NAD Nicotinamide adenin dinucleotic MRSA Deman, Rogosa, Shape agar MRSB Deman, Rogosa, Shape broth NA Nutrien agar NB Nutrian broth . Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh. với Bacillus subtilis 9 2.3 .1. 1. Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cao 9 2.3 .1. 2. Nguyên liệu để sản xuất enzyme α-amylase từ vi khuẩn 9 2.3 .1. 3. Nguyên liệu để sản xuất enzyme. vi khuẩn. 10 2.3 .1. 4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có khả năng sinh enzyme 10 2.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 11 2.3.2 .1. Nhu cầu sinh trưởng 11 2.3.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng 11