Luận văn : XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU ĐỂ THU SINH KHỐI VÀ ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC part 4 pdf

18 2.4.5.2. Ngoài nước • Nhóm nghiên cứu của Alexopoulos (Đức) đã nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm Bioplus 2B (chứa Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis) lên trình trạng sức khỏe, tính năng sinh đẻ của heo nái và lên chất lượng thịt của heo thịt. Kết quả ghi nhận được khi bổ sung chế phẩm Bioplus 2B cho heo nái con và mẹ làm hạn chế sự giảm trọng lượng của heo mẹ trong thời kỳ tiết sữa (15,3 ± 3,6 đối với chế phẩm Bioplus 2B so với đối chứng là 18,8 ± 3,1. Làm cải thiện các thông số của máu và sữa (ngoại trừ lactose và chất rắn). Ngoài ra nhóm nghiên cứu còn kết luận chế phẩm Bioplus 2B có ảnh hưởng đến tình trạng sức khỏe và tính năng sinh sản của heo nái và làm tăng phẩm chất quầy thịt ở heo đang lớn. • Nhóm nghiên cứu của Sirirat Rengpipat (Thái Lan) về tác dụng của probiotic trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon) ghi nhận rằng Bacillus dòng S11 không hạn chế quá trình nở của Artemia, làm tăng trọng lượng và chiều dài của ấu trùng tôm (trọng lượng là 43,8 mg so với 26 mg so với đối chứng, chiều dài (cm) là 1,83 ± 0,31 so với đối chứng là 1,71 ± 0,2. Tôm có tỷ lệ sống sót cao (13% so với 4% đối chứng) khi thử nghiệm với Virio harveyi (vi khuẩn gây bệnh phát sáng). Ngoài ra nhóm còn kết luận Bacillus dòng S11 không có ảnh hưởng đến chất lượng nước ao nuôi và Arterma là vật mang probiotic có hiệu quả. 2.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME Enzyme hay còn gọi là “men” là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Chúng có trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật. Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống) gọi là “invivo” mà nó còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào “invitro”. Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzyme còn được gọi là chất xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. 19 2.5.1. Enzyme amylase Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác trong đời sống. Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm 1811 - 1814. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Cho mãi tới thời gian gần đây người ta mới thu nhận amylase từ malt. Hiện nay người ta thu amylase từ canh trường vi sinh vật chủ yếu là từ vi khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men (Nguyễn Quyết, 2004). Hình 2.3. Enzyme α-amylase 2.5.1.1. Đặc điểm enzyme α-amylase Enzyme amylase có thể thu được từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Hiện nay người ta đã biết enzyme amylase được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợp nhiều nhất, còn ở các loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn. Các loại enzyme amylase thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: α-amylase (α- 1,4 glucan-4-glucanhydrolase), ß-amylase (α-1,4glucan-4-maltohydrolase), γ-amylase (glucoamylase). Trong đó vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tổng hợp nên α-amylase. α-amylase thủy phân liên kết α -1,4 glucoside ở giữa mạch polysaccharide chính vì thế nhiều tài liệu còn gọi chúng là endoamylase. Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt bị giảm rất nhanh, α-amylase thường bền nhiệt hơn các loại amylase khác. Khi có mặt ion calci cấu trúc của α-amylase sẽ bền hơn, và kém bền trong môi trường acid. Khi α-amylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản ứng này bao gồm: dextrin (trong đó chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp), maltose, glucose. α-amylase từ nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau, song chúng đều có khá nhiều tyrosin và tryptophan còn methionin rất ít và chỉ có khoảng 7 - 10 gốc cystein. α-amylase của Bacillus subtilis không có các liên kết disulfit và disunithidin. Hoạt độ của chúng có liên quan mật thiết với sự có mặt của ion calci trong phân tử vì ion này được dùng để duy trì hình thể hoạt động của enzyme, từ đó nó có vai trò quan trọng trong việc ổn định hoạt tính của enzyme và tăng cường độ bền của α-amylase trước các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy protease. 20 Phản ứng thủy phân tinh bột bằng α-amylase thường xảy ra hai giai đoạn: • Giai đoạn đầu: Chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh, người ta gọi đây là giai đoạn dịch hóa. • Giai đoạn 2: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành. Nhờ đó tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iốt và một ít maltose. Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Bacillus subtilis là giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2. Còn số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6 – 7, bị vô hoạt hoàn toàn ở pH = 1 và bị vô hoạt một phần ở pH = 8. 2.5.1.2. Ứng dụng của α-amylase Amylase là một trong những enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, lên men, công nghiệp dệt, sản xuất giấy và trong nông nghiệp. ¾ Trong công nghiệp rượu – bia Vài chục năm trở lại đây chế phẩm amylase từ nấm mốc (Aspergillus oryzae, Asp. awamori,…) hoặc từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus) được thay thế malt (đại mạch nảy mầm) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có tinh bột. ¾ Trong sản xuất bánh mì Khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượng của bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng, độ xốp của bánh mì. ¾ Trong công nghiệp dệt Chế phẩm amylase được dùng để rủ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Trong vải mộc thường chứa 5% tinh bột và nhiều tạp chất khác. Để làm vải mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt thì phải tách tinh bột và người ta thường sử dụng enzyme amylase từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus mesentricus) hay từ nấm mốc. Khi rủ hồ vải thì lượng chế phẩm tính cho dung dịch là 0,3 – 0,6g. Nhiệt độ xử lý là 90 o C, thời gian từ 5 – 15 phút. 21 ¾ Trong sản xuất thức ăn gia súc Sử dụng amylase của Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay B. subtilis thêm vào thức ăn giàu tinh bột của động vật nhất là động vật còn non làm tăng khả năng đồng hóa thức ăn dẫn đến tăng trọng nhanh. ¾ Trong nghiên cứu sinh học Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng của amylase. Một dung dịch bền vững chứa α-amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao. 2.5.2. Enzyme protease 2.5.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, xạ khuẩn, Str. griseus, Str. rimosus… và một số loài nấm mốc Asp. oryzae, Asp. niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.5.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các protein • Protease – xerin ase vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: ại Một số rotease ra ba nhóm dự ứng • h: proteinase trung tính là metalloenzyme, chúng có pH Hình 2.4. Enzyme protease • Protease – tiol • Protease – kim lo • Protease – acid tác giả khác chia p a vào pH hoạt động của chúng bao gồm: • Protease acid: pH < 3 được dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease trung tín hoạt động 6 - 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus. 22 • Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 - 11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serine. Trong bốn nhóm kể trên, các protease-xerin và protease-tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của aminoacid. Các protease-xerin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000 - 27.000 dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin vào khoảng 33.800 - 48.400 dalton. Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 – 40.000 dalton. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc aminoacid khác. Ví dụ histidin thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các proteae-xerin, protease tiol còn tyrosin là trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E – S E – S’ + P 1 E + P 2 Trong đó: E – là enzyme, S – là cơ chất. E - S – là phức chất enzyme – cơ chất E - S’ – là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hóa (axilenzyme). P 1 – là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amine tự do mới được tạo thành) P 2 – là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành). 2.5.3. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme Hiện nay người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động của enzyme. Ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.5.3.1. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme Hiện nay người ta sử dụng một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme: 23 • Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước. • Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định. • Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm. 2.5.3.2. Đơn vị hoạt độ Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme. Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt độ. Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị: • Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI) • Đơn vị Katal (Kat) • Đơn vị hoạt độ riêng • Đơn vị hoạt độ riêng phân tử • Ngoài ra còn có nhiều cách biểu thị đơn vị hoạt độ của enzyme như: đơn vị Wohgemuth cải tiến (MWU), đơn vị SKB, GAU, NU, HU, AU Các đơn vị hoạt độ này được trình bày chi tiết ở mục 3.7 phần phụ lục. 24 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Khóa luận được thực hiện từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005 tại phòng thí nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1. Giống vi khuẩn Chế phẩm chúng tôi sản xuất sử dụng hai loại vi khuẩn: • Bacillus subtilis ATCC - 6633 được cung cấp từ khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh. • Lactobacillus acidophilus được phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất. 3.2.2.Thiết bị - dụng cụ • Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy, giá đỡ ống nghiệm, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, giấy đo pH, kính hiển vi, cân, máy lắc, đường kế, bếp điện… • Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, pipet, micropipet, đầu type vô trùng, que cấy trang, đũa thủy tinh, khăn giấy… 3.2.3. Hóa chất • Các loại thuốc nhuộm: crystal violet, fushin, lugol… • Thuốc thử kowac, methyl red, NaOH 1N, HCl 1N, H 2 O 2 30%, dầu soi kính, cồn • Dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch iốt 0,02%, dung dịch casein 0,1% 3.2.4. Môi trường nuôi cấy 3.2.4.1. Đối với Bacillus subtilis • Môi trường tăng sinh nutrien broth (NB) • Môi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào nutrien agar (NA) • Môi trường nhân giống cấp1: môi trường Frage, môi trường pepton – gelatin, môi trường chứa mật rỉ đường + 2 % tinh bột, môi trường Edward và môi trường Nomura. • Môi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột mì… Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục. 25 3.2.4.2. Đối với Lactobacillus acidophilus • Môi trường tăng sinh chọn lọc MRSB • Môi trường phân lập MRSA • Môi trường nuôi cấy và thử các phản ứng sinh hóa • Môi trường sản xuất: môi trường sữa đặc có đường và môi trường sữa đậu nành. Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục. 3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1. Đối với Bacillus subtilis 3.3.1.1. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1 Cách tiến hành: Giống gốc chứa Baclillus subtilis được tăng sinh trong môi trường NB có pH = 7 trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37 o C. Sau 24 giờ cho dung dịch tăng sinh này vào từng loại môi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh bột 2%, và pepton- gelatin với các điều kiện khảo sát: • Nhiệt độ: nhiệt độ phòng • Lượng giống: 5% • pH = 7 • Thời gian nuôi cấy là 48 giờ • Nhu cầu oxi: sử dụng máy lắc Sau 48 giờ nuôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase và protease. Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trực tiếp trên lame (được trình bày ở mục 3.6 phần phụ lục) Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme: o Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth (xem mục 3.1 phần phụ lục) o Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld (Xem mục 3.2 phần phụ lục) 26 Sau khi kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường chúng tôi chọn được môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất để tiếp tục nhân giống trên môi trường nhân giống cấp 2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần. Số lượng tế bào vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Môi trường Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3 Edward Fragie Nomura Pepton - gelatin Rỉ đường + tinh bột 2% 27 Giống gốc Bacillus subtilis Môi trường NB ( nutrien broth ) Tăng sinh Môi trường Nomura Môi trường Fragie Môi trường rỉ đường +2 % tinh bột Môi trường Edwards Môi trường pepton - gelatin 5 % giống 48 giờ, t o phòng Kiểm tra Hoạt tính enzyme amylase Số lượng vi khuẩn có trong 1ml Hoạt tính enzyme protease Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Bảo quản, kiểm tra Chọn môi trường tối ưu nhất Môi trường A Môi trường B Môi trường D Môi trường C 10 % giống Chọn môi trường tối ưu nhất Môi trường E Sơ đồ 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis . phân lập MRSA • Môi trường nuôi cấy và thử các phản ứng sinh hóa • Môi trường sản xuất: môi trường sữa đặc có đường và môi trường sữa đậu nành. Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình. môi trường tối ưu nhất Môi trường A Môi trường B Môi trường D Môi trường C 10 % giống Chọn môi trường tối ưu nhất Môi trường E Sơ đồ 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis. trường nhân giống cấp 1: môi trường Frage, môi trường pepton – gelatin, môi trường chứa mật rỉ đường + 2 % tinh bột, môi trường Edward và môi trường Nomura. • Môi trường sản xuất: bắp, đậu nành,