Luận văn : BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ AFLP part 1 pdf

1 Phần 1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, máy luân nhiệt (Thermocycles - PCR) được sử dụng rộng rãi tại các trường Đại học, phòng thí nghiệm, bệnh viện, viện nghiên cứu… Máy PCR là công cụ không thể thiếu đối với các thí nghiệm liên quan đến khuếch đại đoạn DNA. Những máy PCR đang sử dụng tất cả đều nhập từ nước ngoài với giá thành cao, hơn nữa trong quá trình sử dụng gặp hư hỏng chi phí sửa chữa khá cao; đôi khi trong nước không sửa chữa được phải ra nước ngoài, tốn thời gian và chi phí vận chuyển. Với những thiết bị đắt tiền như vậy, sinh viên khó tiếp cận thực hiện các thí nghiệm của mình, chỉ có thể kiến tập hoặc nhiều sinh viên thực tập trên một máy. Số lượng máy PCR hiện nay tại các trường đại học còn khiêm tốn, trong khi lượng sinh viên ngày một nhiều. Do vậy, việc chế tạo máy PCR trong nước với giá thành hạ rất cần thiết. Khi chưa có máy PCR, ta cũng có thể thực hiện khuếch đại đoạn DNA với các hộp chứa nước ở nhiệt độ khác nhau. Tuy nhiên, việc làm này tốn nhiều thời gian và công sức, độ tin cậy không cao, không thích hợp khi lượng mẫu cần phân tích nhiều. Máy PCR lúc đầu mới ra dùng dầu, còn có nhiều nhược điểm như: hút DNA ra khó dễ bị lẫn dầu, thu được lượng DNA sạch ít hơn dự kiến v.v… Để khắc phục những khuyết điểm đó, dòng máy thứ hai ra đời dùng nguyên lý điện nhiệt học để chuyển tải nhiệt có thêm nắp chống ngưng tụ, khắc phục được những khuyết điểm trên. Đề tài nghiên cứu này, được thực hiện với mục đích hạ thấp giá thành của máy, kiểm tra độ hoạt động ổn định của máy và kiểm tra chạy phản ứng PCR. 1.2. Yêu cầu Máy được thiết kế tiện dụng, dễ nâng cấp, sử dụng, sửa chữa và bảo trì. Có độ bền cao, hoạt động ổn định, cho kết quả trong việc chạy PCR. Khoảng nhiệt độ 4 o C – 95 o C và không ngưng tụ hơi nước trên nắp ống eppendorf trong khoảng nhiệt độ này. Sai số nhiệt độ nằm trong giới hạn cho phép. 2 Chạy chương trình trực tiếp không lưu vào bộ nhớ. 1.2. Giới hạn của đề tài Đây là máy lần đầu chế tạo tại Việt Nam, thời gian chế tạo có hạn vì vậy độ tin cậy có thể không cao bằng máy nhập ngoại hiện đại. Vì vậy, cần có thời gian chạy thử để tối ưu từng bộ phận của máy và đưa ra tiêu chuẩn cụ thể cho từng bộ phận và linh kiện của máy. 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Nguyên lý phản ứng PCR PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun nóng (khoảng 95 o C), làm nguội (37 – 65 o C) và ủ lâu ở khoảng 72 o C. Trong dung dịch có các primer (đoạn mồi), mỗi loại primer sẽ bắt cặp bổ sung với mạch đơn tương ứng. Nhờ vậy 1 đoạn mạch kép DNA, sau một chu kỳ phản ứng do DNA polymerase thực hiện, thành hai mạch DNA kép và có thể thực hiện chu trình khuếch đại mới : 2 thành 4 và 4 thành 8 theo cấp số nhân với công bội là 2 theo lý thuyết. Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ (eppendorff), có DNA khuôn mẫu, primer và DNA polymerase, được gắn vào hệ thống nung nóng có điều chỉnh thành chu kỳ nung nóng và làm nguội theo chương trình gọi là thermocycler, đây chính là máy PCR. 2.2. Các thành phần của phản ứng Trong các ống nghiệm plastic nhỏ có các thành phần chủ yếu sau:  Khuôn mẫu (Template) tức là đoạn DNA cần khuyếch đại.  Các oligonucleotide primer (các mồi) còn gọi là amplifier (nhân tố khuyếch đại), oligo hay primer.  DNA polymerase chịu nhiệt.  dNTP : các loại nucleotide triphosphate.  Dung dịch đệm (buffer) tích hợp và MgCl 2 .  Nước 2.2.1. Các enzyme polymerase chịu nhiệt Lúc đầu, các enzyme polymerase bình thường được sử dụng, nhưng hiệu quả kém do phải chờ hạ nhiệt độ xuống thấp (30 – 50 o C). Hiện nay, hầu như chỉ sử dụng enzyme polymerase chịu nhiệt là Taq polymerase bắt nguồn từ vi khuẩn Thermophilus 4 aquaticus và một số khác cải biến từ chủng này. Phản ứng PCR có thể thực hiện cả với RNA. 2.2.2. DNA khuôn mẫu Độ nhạy cao là một đặc tính hấp dẫn của PCR. Sự khuếch đại có thể thực hiện với một phân tử ban đầu được nhân lên. Yêu cầu tối thiểu này đối với đoạn DNA mẫu tương phản với kĩ thuật tạo dòng. Cũng do sự nhạy cảm cao này mà kết quả PCR dễ bị sai nếu bị nhiễm DNA khác. Dễ bị nhiễm tạp là nhược điểm lớn của PCR. Ưu thế khác đối với mẫu là không cần sự tinh sạch cao. Nhờ vậy có thể sử dụng PCR với các vết máu, mẫu khảo cổ, DNA cổ xưa hoặc vi khuẩn đã bị hấp khử trùng. Tuy vậy, trong nhiều trường hợp cần chuẩn bị mẫu tốt để kết quả chắc chắn hơn. 2.2.3. Primer Primer là thành phần quan trọng trong PCR. Primer được tổng hợp hóa học trên chất nền rắn được sử dụng trong máy tổng hợp oligonucleotide (oligonucleotide synthestizer). Các primer có vai trò quan trọng đối với thành công của PCR. Trình tự primer phải có kích thước hợp lý, khoảng 18 – 25 nucleotide. Việc lựa chọn trình tự primer cũng có vai trò quan trọng. Cần chọn thế nào để tránh sự bắt cặp bổ sung bên trong hoặc bên ngoài phân tử không như ý và tránh có tỉ lệ G + C cao. 2.3. Nguyên lý hoạt động của máy PCR Hình 2.1 Mô hình hoạt động của máy PCR Sensor nhiệt cảm ứng nhiệt độ truyền tín hiệu về cổng chuyển đổi được tích hợp trên chip, tín hiệu điện được chuyển sang dạng số. Vi điều khiển nhận tín hiệu số này và xử lý theo chương trình được lập trình. Kết quả chip xuất ra dạng số và được Bộ điều khiển Cảm biến Bộ công suất Nguồn cung cấp Te, quạt, điện trở 5 chuyển thành dạng tương tự (Analog) là tín hiệu điều khiển bộ khuếch đại, dựa vào đó mà bộ khuếch đại cung cấp điện áp và đảo cực cho thermoelectric module, quạt, điện trở. 2.4. Nguyên lý Peltier Năm 1834, nhà khoa học Pháp Jean Charles Althanase Peltier đã phát hiện khi điện áp một chiều khi thông qua một mạch điện tạo bởi hai mạch điện dẫn điện khác nhau, điểm nối của nó sẽ sinh ra một hiện tượng hút nhiệt. Hiện tượng này gọi là hiệu ứng Peltier (Hoàng Oanh, 2002, trang 30). 2.5. Thermoelectric module 2.5.1. Giới thiệu Thermoelectric module là ứng dụng cụ thể trong kỹ thuật của hiệu ứng Peltier. Hình 2.2 Thermoelectric module Các vật liệu bán dẫn dùng để làm lạnh có rất nhiều loại chẳng hạn như: PbTe, ZnSb, SiGe, AgSbTe v.v… Vật liệu bán dẫn có hiệu suất cao hay thấp phụ thuộc vào tham số chính, được đánh giá bởi hệ số Z, Z càng lớn thì hiệu suất càng cao. Z = a 2 /(k.ρ) (2.1) Trong công thức: Z là hệ số ưu trị a là điện thế điện động sai lệch nhiệt độ k là dẫn xuất nhiệt ρ là điện trở suất 6 Hiện nay, nghiên cứu sử dụng nhiều nhất là các vật liệu bán dẫn P-Bi 2 Te 3 /Sb 2 Te 3 , N-Bi 2 Te 3 /Bi 2 Se 3 là hợp kim với 3 nguyên tố chuẩn. Chúng có hệ số ưu trị tương đối tốt, hệ số ưu trị vật liệu bán dẫn kiểu P có hệ số Zp > 3,5x10 -3 k -1 . Các hệ số ưu trị của vật liệu bán dẫn kiểu N có hệ số Zn > 3x10 -3 k -1 nếu làm cho việc làm lạnh bán dẫn về mặt kinh tế đạt tới mức độ tương đương như làm lạnh kiểu máy nén, hệ số ưu trị có thể đạt tới 13x10 -3 k -1 (Hoàng Oanh, 2002, trang 30) 2.5.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động 2.5.2.1. Cấu tạo Thermoelectric module, cấu tạo bởi hai loại bán dẫn loại P và N nối tiếp nhau bởi các cầu nối thường được làm bằng kim loại đồng (Cu) có vai trò dẫn điện và chuyển tải nhiệt. Để module hoạt động ổn định và độ bền cao, đòi hỏi cách điện tốt và chống hơi nước ngưng tụ bên trong thermoelectric module trong quá trình làm lạnh. Vì vậy, nhà sản xuất thường dùng vật liệu ceramic cách điện hai mặt. Ceramic này có đặc tính cách điện, dẫn nhiệt tốt và có độ bền cơ học cao. Muốn cho thermoelectric dẫn nhiệt tốt, hai bề mặt phải phẳng và nhẵn, thường phủ thêm một lớp mỏng silicon làm tăng thêm vai trò dẫn nhiệt và chống hơi nước ngưng tụ bên trong. Bên trong thermoelectric module các bán dẫn P và N nối tiếp nhau, có cùng chiều truyền nhiệt tùy vào mục đích sử dụng mà nhà sản xuất tạo ra nhiều thermoelectric có số lượng cặp PN khác nhau. Số lượng PN càng nhiều độ chênh lệch nhiệt độ trên bề mặt càng thấp và chịu được lực nén cao. Hình 2.3 Cấu tạo Thermoelectric module 7 2.5.2.2. Nguyên lý hoạt động Hoạt động dựa trên nguyên lý Peltier. Khi có dòng điện một chiều chạy qua, tùy theo bán dẫn loại P hay N mà có sự truyền tải nhiệt khác nhau so với chiều dòng điện đi qua. Đối với bán dẫn loại N sự truyền tải nhiệt ngược chiều với chiều dòng điện, đối với bán dẫn loại P truyền tải nhiệt cùng với chiều dòng điện. Vì vậy, thermoelectric một mặt nóng và một mặt lạnh khi có dòng điện một chiều đi qua (hình 2.4). Hình 2.4 Sự truyền tải nhiệt Công suất truyền tải nhiệt của thermoelectric module cao hay thấp phụ thuộc vào vật liệu bán dẫn, dòng điện đi qua và độ chênh lệch nhiệt độ hai bề mặt của thermoelectric. Nếu dòng điện quá thấp thì truyền tải nhiệt kém, nếu quá cao truyền tải nhiệt cũng giảm do dòng điện có tác dụng sinh nhiệt theo định luật Jun-Lenxơ. Tùy theo vật liệu cấu tạo và kết cấu của thermoelectric mà ΔT Max khác nhau. Nếu chênh lệch nhiệt độ hai bề mặt của vật liệu bán dẫn vượt qua giới hạn này thì truyền tải nhiệt bằng không, xét theo tác dụng truyền tải nhiệt của thermoelectric. Mỗi loại thermoelectric chịu được nhiệt độ nóng trong giới hạn nếu nhiệt độ lớn hơn dẫn đến hư hỏng. Vì vậy, dùng tản nhiệt cho mặt nóng của thermoelectric là cần thiết cho quá trình làm lạnh, hoặc tăng nhanh làm nóng. Máy PCR có đặc tính thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ liên tục. Đòi hỏi thermoelectric dùng cho máy phải thích hợp. Thermoelectric thông thường dùng cho làm lạnh hoặc làm nóng không đáp ứng cho sự thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ. Nếu 8 dùng loại này cho máy PCR, máy sẽ hoạt động không ổn định sau một thời gian, do điện trở của thermoelectric thay đổi lớn (www. ferotech.com). 2.6. Bán dẫn loại N và bán dẫn loại P Chất bán dẫn thuần khiết nếu được pha thêm tạp chất, chẳng hạn như Si được pha thêm tạp chất nhóm 5 là Phosphore hoặc Asenic đối với Ge. Với hàm lượng thích hợp sao cho các nguyên tử tạp chất này chiếm chỗ một trong những nút của mạng tinh thể thì cơ chế dẫn điện sẽ thay đổi. Nguyên tử tạp chất (chẳng hạn như Phosphore), vỏ ngoài cùng có 5 điện tử; trong đó 4 điện tử tham gia liên kết hóa trị với các nguyên tử lân cận, điện tử thứ năm liên kết yếu hơn với hạt nhân và các nguyên tử xung quanh. cho nên, chỉ cần cung cấp một năng lượng nhỏ (nhờ nhiệt độ, ánh sáng …), điện tử này sẽ thoát khỏi trạng thái ràng buộc, trở thành hạt dẫn tự do. Nguyên tử tạp chất khi đó bị ion hóa và trở thành một ion dương. Nếu có điện trường đặt vào, các hạt dẫn tự do trên sẽ chuyển động có hướng, tạo nên dòng điện. Như vậy tạp chất nhóm 5 cung cấp điện tử cho bán dẫn ban đầu nên được gọi là tạp chất cho. Chất bán dẫn có pha tạp chất cho gọi là bán dẫn loại N. Trường hợp tạp chất pha vào thuộc nhóm 3 của bảng tuần hoàn các nguyên tố, do lớp vỏ ngoài cùng của nguyên tử tạp chất chỉ có 3 điện tử khi tham gia vào mạng tinh thể của chất cơ bản chỉ tạo nên 3 mối liên kết hoàn chỉnh, còn mối liên kết thứ tư bị bỏ hở. Khi có kích thích nhỏ là một trong những điện tử của các mối liên kết hoàn chỉnh bên cạnh sẽ đến thế vào liên kết bỏ hở nói trên. Nguyên tử tạp chất lúc đó sẽ trở thành một ion âm. Tại mối liên kết mà điện tử vừa đi khỏi sẽ dư ra một điện tích dương, nghĩa là xuất hiện một lỗ trống. Nếu có điện trường đặt vào, các lỗ trống này sẽ tham gia dẫn điện. Như vậy, tạp chất nhóm 3 tiếp nhận điện tử từ chất cơ bản để làm sản sinh các lỗ trống nên được gọi là tạp chất nhận. Chất bán dẫn có pha tạp chất nhóm 3 như trên gọi là bán dẫn loại P. Như vậy, tùy theo tạp chất pha vào thuộc nhóm 3 hay nhóm 5 (xét với Si hoặc Ge) mà chất bán dẫn thuần trở thành bán dẫn P hay N. Hạt dẫn đa số tương ứng là lỗ trống hoặc điện tử. Ở trạng thái cân bằng, mỗi chất bán dẫn đều trung hòa điện, nghĩa là tổng 9 điện tích dương bằng tổng điện tích âm trong thể tích (Dương Vũ Văn, 2002, trang 43). p-type n-type Si 100%, 0 0 K Hình 2.5 Điện tích và lỗ trống của bán dẫn 2.7. Sensor nhiệt Để đo nhiệt độ ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau, dùng sensor nhiệt là thích hợp nhất trong điều khiển, chúng có nhiều loại khác nhau. Để đo được nhiệt độ chính xác cao và gia tốc biến thiên nhiệt nhanh, hai loại sensor nhiệt là „cặp nhiệt điện‟ và „điện trở palatin‟ đáp ứng tốt. 2.7.1. Nhiệt điện trở Platin Platin là vật liệu cho nhiệt điện trở được dùng rộng rãi với dải đo nhiệt từ -200 đến 850 o C. Nhiệt điện trở platin có nhiều loại: Pt – 100 là trị số điện trở ở định mức 0 o C là 100Ω, Pt – 500, Pt – 1000. Các loại Pt – 500, Pt – 1000 có hệ số nhiệt độ lớn hơn. Do đó, độ nhạy lớn hơn (điện trở thay đổi mạnh theo nhiệt độ). Với Pt – 1000, sự thay đổi nhiệt khoảng chừng 4 Ω/ 0 K. Các tính chất của nhiệt điện trở này được qui định theo tiêu chuẩn quốc tế DIN IEC 751. Theo tiêu chuẩn này, dải đo nhiệt độ của điện trở platin từ -200 đến 850 o C. Cho dải đo đầu tiên từ -200 đến 0 o C ta có đa thức cấp ba: R(t) = R 0 (1 + At + Bt 2 + C[t-100 o C ].t 3 ) (2.2) Cho dải đo từ 0 đến 850 o C ta có đa thức cấp hai: R(t) = R 0 (1 + At + Bt 2 ) (2.3) Các hệ số có giá trị như sau: A = 3,90802 . 10 -3 0 C -1 B = -5,802 . 10 -7 0 C -2 C = -4,2735 . 10 -12 0 C -3 . – 10 0 l trị số điện trở ở định mức 0 o C l 10 0Ω, Pt – 500, Pt – 10 00. Các loại Pt – 500, Pt – 10 00 có hệ số nhiệt độ l n hơn. Do đó, độ nhạy l n hơn (điện trở thay đổi mạnh theo nhiệt đ ) được đánh giá bởi hệ số Z, Z càng l n thì hiệu suất càng cao. Z = a 2 /(k. ) (2. 1) Trong công thức: Z l hệ số ưu trị a l điện thế điện động sai l ch nhiệt độ k l dẫn xuất nhiệt ρ l . trị có thể đạt tới 13 x10 -3 k -1 (Hoàng Oanh, 2002, trang 3 0) 2.5.2. Cấu tạo và nguyên l hoạt động 2.5.2 .1. Cấu tạo Thermoelectric module, cấu tạo bởi hai loại bán dẫn loại P và N nối