Luận văn : Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP part 2 potx

11 Bảng2.2. Tình hình sản xuất, xuất nhập khẩu nhân điều của Việt Nam. Năm Hạt điều thô (tấn) Xuất khẩu (tấn) Giá trị kim ngạch (triệu USD) Sản xuất trong nước Nhập khẩu Hạt điều thô Nhân điều 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 1530 1449 468 12.000 28.000 31.000 47.000 60.000 90.000 100.000 110.000 140.000 100.000 70.000 135.000 140.000 - 10.000 20.000 25.000 40.000 - - - 300 11.000 27.000 30.000 40.000 30.000 50.000 - - 33,6 261 286 360 1.400 6.000 9.526 18.257 23.791 33.000 26.000 16.000 30.000 38.000 63.000 14 23 29 49 75 90 110 133 117 100 150 135 214 12 Bảng2.3. Thị phần xuất khẩu nhân điều của Việt Nam 3 năm 2000, 2001 và 2002. STT Quốc gia và khu vực 2000 (%) 2001 (%) 2002 (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hoa Kỳ Trung Quốc Úc Anh Hà Lan Nhật Canada Hồng Kông Đức New Zealand Đài Loan Các nước khác 18 32 17 8 8 3 3 3 2 1 1 1 24 28 18 7 10 2,5 .2,5 4 1 1 1 5 33,7 20,3 10,8 5,3 10,9 2,2 2,3 4,8 1 1 1,1 6,6 Nguồn: [4]. 13 Bảng2.4. Tình hình phát triển sản xuất điều tại Việt Nam dự kiến đến năm 2010. ĐVT: ha 1997 2005 2010 Toàn quốc 250.000 340.000 500.000 Duyên hải Nam Trung Bộ Quảng Nam Quảng Ngãi Bình Định Phú Yên Khánh Hòa Ninh Thuận Bình Thuận 61.000 4.000 3.000 15.000 8.000 7.000 3.000 21.000 100.000 10.000 10.000 15.000 15.000 15.000 10.000 25.000 180.000 25.000 25.000 25.000 20.000 25.000 20.000 40.000 Tây Nguyên Kon tum Gia Lai Đắc Lắc Lâm Đồng 27.000 500 10.500 10.000 6.000 60.000 16.000 17.000 15.000 12.000 120.000 25.000 35.000 30.000 30.000 Đông Nam Bộ Đồng Nai Bà Rịa – Vũng Tàu Bình Dương Bình Phước Tây Ninh Tp. Hồ Chí Minh 149.000 35.000 20.000 32.000 50.000 10.000 2.000 170.000 40.000 25.000 28.000 65.000 10.000 2.000 190.000 40.000 30.000 28.000 65.000 25.000 2.000 Đồng bằng sông Cửu Long 13.000 10.000 10.000 Nguồn: [4]. Năm Vùng/Tỉnh 14 2.1.7. Tình hình canh tác cây điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Bà Rịa – Vũng Tàu là tỉnh mới thành lập năm 1991, thế mạnh là công nghiệp dầu khí và du lịch, ngoài ra còn phát triển mạnh cây công nghiệp như cao su, cà phê, tiêu, điều, đem lại nguồn thu nhập khá cao, chủ yếu là cho các huyện của tỉnh. Cũng như các địa phương khác, cây điều được trồng ở tỉnh chủ yếu là trồng từ hạt, có độ tuổi trung bình cao. Trong những năm gần đây đang phát triển mạnh cây điều cao sản cho năng suất cao và ổn định hơn so với các giống điều địa phương. Đất nông nghiệp của tỉnh khá màu mỡ, có diện tích đất đỏ bazan lớn, cùng với điều kiện khí hậu khá ổn định, nhiệt độ trung bình trong năm là 24 o C – 28 o C, có mùa khô và mùa mưa phân biệt, hệ thống thủy lợi phát triển và rộng khắp,…là những điều kiện thuận lợi cho phát triển cây điều. Bảng2.5. Sản lượng điều tại tỉnh BR – VT phân theo đơn vị hành chính. ĐVT: tấn 1996 2000 2001 2002 2003 Tổng số TP. Vũng Tàu TX. Bà Rịa H. Tân Thành H. Châu Đức H. Xuyên Mộc H. Long Đất H. Côn Đảo 6.257 153 109 1.630 1.387 2.589 384 6 5.102 48 73 413 742 3.575 250 1 6.010 48 71 812 1.272 3.575 231 1 7.316 24 72 1.462 1.447 4.009 301 1 10.417 28 143 1.462 2.206 6.138 440 1 (Nguồn: Sở Nông Nghiệp – Phát Triển Nông Thôn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu; Cục Thống kê tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.) Nói chung, giá trị đóng góp của các loại nông sản vào tổng thu nhập của toàn tỉnh không nhiều, song có một vai trò quan trọng trong sự phát triển chung của tỉnh, góp 15 phần đem lại thu nhập tương đối cho một bộ phận khá đông những người nông dân, giúp ngăn chặn tình trạng phân hóa giàu nghèo giữa thành thị và nông thôn. Với những vùng đất khô cằn, bạc màu thì cây điều là giải pháp thích hợp nhất để giúp bà con có được thu nhập cao. Tỉnh chủ trương đến năm 2010 thay thế dần các giống điều địa phương, trồng lâu năm, cho năng suất không cao, không ổn định bằng các giống điều cao sản cho năng suất cao, ổn định, kháng sâu bệnh và chất lượng đồng đều, phấn đấu đến năm 2010 đạt 16.000 tấn/năm (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh BR – VT). Chính vì vậy, việc đánh giá từng vùng quần thể và nhận diện các giống có giá trị cao là rất cần thiết. 2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử Tế bào là đơn vị của sự sống, được phân ra làm 2 loại: Tế bào tiền nhân (Prokaryote) và tế bào nhân thật (Eukaryote). Bộ máy di truyền của 2 loại tế bào trên được hình thành từ 2 loại nucleic acid: DNA (Deoxyribonucleic acid) và RNA (Ribonucleic acid). Ở sinh vật có tế bào nhân thật (Eukaryote), thông tin di truyền là phân tử DNA – là chuỗi xoắn kép mạch đôi gồm 2 chuỗi polynucleotide song song, có trình tự các nucleotide bắt cặp bổ sung với nhau. Các nucleotide được cấu tạo từ 3 thành phần: nhóm photphat, đường ribose và một trong 4 loại bazơ hữu cơ (adenine, cytoxine, thymine và guanine). Có 4 loại nucleotide khác nhau: A (nucleotide có chứa base adenine), T (nucleotide có chứa base thymine), C (nucleotide có chứa base cytoxine) và G (nucleotide có chứa base guanine). Các nucleotide trong cùng một mạch đơn được nối với nhau bằng liên kết photphat và 2 mạch đơn sắp xếp đối song với nhau theo nguyên tắc bổ sung A – T, G – C [1] [5] [8]. Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là tính đa dạng di truyền [1]. 16 Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài. Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị [1]. Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng: - Chỉ thị hình thái. - Chỉ thị allozyme. - Chỉ thị phân tử. 2.2.1.1. Chỉ thị hình thái Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể phát hiện được. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp. 2.2.1.2. Chỉ thị allozyme Là những chỉ thị protein. Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một vài gene, do vậy người ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị. Dựa vào hàng loạt những enzyme giống nhau được mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một locus. Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, allozyme có thể được phân tách bằng điện di. Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ. Kết quả mà chỉ thị allozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lượng chỉ thị có thể phát hiện được nhiều hơn, tuy nhiên số lượng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng. 2.2.1.3. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA Là những chỉ thị phân tử DNA được tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử. Có thể nói rằng kể từ khi con người biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử được phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho 17 công tác nghiên cứu khoa học do số lượng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Càng ngày người ta càng tìm ra được nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị, tuy nhiên có thể được chia ra làm 2 nhóm:  Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…  Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP [1] [8]. 2.2.2. Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống được nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA được cắt ra này được lai với những probe được đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả được quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tượng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [1]. 2.2.3. Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi cấu trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA dịch chuyển trên gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có quy trình thực hiện khó nhưng kết quả có độ tin cậy không cao [1]. 2.2.4. Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites) Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, dựa trên nguyên lý: Trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di [6]. Kỹ thuật này có nhược điểm là phải biết trình tự gene của đối tượng nghiên cứu. 18 2.2.5. Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: Giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides được lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Điều quan trọng là phải biết được những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng giống. Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu được dùng để định danh những giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền [6]. 2.2.6. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội [1] [6]. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD được minh họa trong hình 2.1. 19 Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật RAPD 2.2.6.1. Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RAPD  Bước 1: Tách chiết DNA DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều). 5 ` 5 ` 5* 5* 3 ` 3 ` 3 ` 3 ` Primer ngẫu nhiên Thực hiện PCR với những primer ngẫu nhiên Sau phản ứng PCR, kết quả đem điện di phát hiện band. 20 Sử dụng phương pháp của Doyle và Doyle (1988) [1] [13]. Phương pháp này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,…. Phức hợp này sau đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol, bằng cách hình thành 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch sạch ở phía trên có chứa DNA, pha thứ hai đặc hơn ở dưới chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…). Sau khi ly tâm, thu được DNA. Thông thường quy trình ly trích DNA ở thực vật gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tế bào lá được nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng các thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích. Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…). Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với muối. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. Có RNA trong mẫu DNA. Có polysaccharide trong mẫu DNA. Có polyphenol trong mẫu DNA. Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA được trình bày trong bảng 2.6. . trên kỹ thuật PCR (PCR based ): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP, …  Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based ): điển hình l RFLP [1] [8]. 2. 2 .2. Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length. nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh BR – VT). Chính vì vậy, việc đánh giá từng vùng quần thể và nhận di n các giống có giá trị cao l rất cần thiết. 2. 2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền. 1.4 62 2. 206 6.138 440 1 (Nguồn: Sở Nông Nghiệp – Phát Triển Nông Thôn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu; Cục Thống kê tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu .) Nói chung, giá trị đóng góp của các loại nông sản vào