11 + Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể sử dụng ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng … Phân loại chất mang : Tất cả chất mang dùng trong cố đònh enzyme được chia làm 2 nhóm : Chất mang polymer hữu cơ. Chất mang vô cơ. a. Chất mang là polymer hữu cơ Trong nhóm chất mang là polymer hữu cơ được chia làm 2 nhóm là polymer tổng hợp và polymer tự nhiên. Chất mang là polymer tự nhiên (natural polymer) Chất mang là polysaccharide (gluxit) : Là nhóm chất mang đang thònh hành và được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng. Agarose là vật liệu ổn đònh, đồng nhất dễ dàng tạo hạt. Tuy nhiên do vấn đề về giá cả nên agarose chỉ thường được sử dụng trong nghiên cứu và mục đích y học (theo signa : 800 2000 USD/kg). Cellulose và các dẫn suất của chúng như CM Cellulose, DEAE Cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ nhưng lại không đồng nhất và ổn đònh nên chỉ sử dụng ở dạng sợi và dạng vi hạt. Alginate và carrageenam là hai loại vật liệu khá mới mẻ. Cả hai loại vật liệu này tạo gel trong dung dòch CaCl 2 dùng để nhốt tế bào và enzyme. Tuy nhiên, hai loại vật liệu này có một nhược điểm căn bản là gel không ổn đònh trong môi trường có phosphate. Tinh bột là vật liệu phong phú và rẻ tiền. Từ lâu tinh bột, tinh bột khâu mạch, diathanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố đònh enzyme như lipase, glucoisomerase, tripsin, amilase. Tuy nhiên tinh bột có nhược điểm là độ trương còn hạn chế và thiếu các nhóm chức năng (functional groups). Vì vậy khả 12 năng cố đònh và hoạt tính enzyme cố đònh còn thấp : để khắc phục nhược điểm này tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước, acrylamide, acrylic acid vừa cải thiện tính chất cơ lý, độ trương, vừa tạo các nhóm chức năng trên bề mặt như [ NH 2 ], [ COOH] làm tăng diện tích tiếp xúc và khả năng cố đònh enzyme. Chitin và chitosan là vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố đònh tế bào và enzyme. Chitin là một polymer rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng thứ hai sau cellulose, chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là polymer của 2 acetomido deoxy D glucose. Chitin tham gia vào thành phần cấu trúc của vỏ tôm cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật. Chitosan là dẫn xuất của chitin khi xử lý bằng kiềm đặc. Chitin, chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn đònh, thường được dùng cố đònh enzyme qua cầu nối glutaraldehyde. Tuy nhiên cả chitin và chitosan đều có một nhược điểm là tính chất kỵ nước, độ trương kém, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay đang có xu hướng ghép copolymer với monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid, hydroxy ethylmethacrylate. Hiện nay, cũng có xu hướng chung là các vật liệu tự nhiên được ghép copolymer với các polymer tổng hợp để cải thiện tính chất cơ lý. Chất mang là Protein : Chất mang là protein thường dùng là getalin, keratin, albumin. Vật liệu thuộc nhóm này thường dễ tạo màng, tạo hạt, có nhóm chức năng là nhóm NH 2 và vì vậy thường dùng sử dụng nhốt enzyme trong khuôn gel với tác nhân khâu mạch là glutaraldehyde. Nhóm chất mang này là protein có nhược điểm là thường kém bền, dễ nhiễm khuẩn. 13 Chất mang là các polymer tổng hợp : Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố đònh enzyme như polyacrylamide, polyester, polyvinilalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxylethylacrylate, polystyren, polyethylen ghép với vinyl monomer, …Ưu điểm chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh được kích thước siêu lỗ, … – Polyhydroxyethylmethacrylate : khả năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm quan trọng nữa là do quá bền vững, không phân hủy trong tự nhiên. Vì vậy gây ô nhiễm môi trường. Đây là vấn đề quan trọng đòi hỏi con người cần quan tâm giải quyết. – Polyacrylamide là một polymer rất đồng nhất, độ trương tốt, kích thước lỗ gel có thể điều chỉnh được và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Polyacrylamide và polyacrylate thường được nạp vào cột, và có rất nhiều dạng khác nhau như polymer có nhóm amin hoặc aldehyde. Phương pháp cố đònh chủ yếu là nhốt enzyme tế bào trong khuôn gel khi được polymer bằng hóa chất như ammoniumpersulphate, bức xạ gamma, tia rơnghen, thường thì để tăng khả năng khâu mạnh của gel poly acrylamide, cần phải bổ sung thêm N, N methylenbisacrylamide làm chất khâu mạch (crosslinking agent). Ngoài ra còn có thể cố đònh enzyme trên các vật liệu này bằng phương pháp hấp thụ, liên kết cộng hóa trò và microcapsule. b. Chất mang vô cơ Ngoài các polymer được sử dụng làm chất mang, còn có một số chất mang vô cơ đã được sử dụng thương mại như sợi bông thủy tinh (contra pore glass), oxyde silica, oxyde nhôm, oxyde magie. Đây là những dạng oxyde có cấu trúc lỗ và có khả năng hấp thụ tốt. Một số vấn đề cần chú ý khi dùng các vật liệu có nguồn gốc từ silic là khá đắt tiền, nên chỉ sử dụng trong sắc ký lọc gel và cố đònh những enzyme đặc biệt. Nhược điểm của các vật liệu này là tan trong kiềm, có pH > 7.5. 14 Để hạn chế điều này pore glass, pore silics được phủ lớp ziconia để tạo một lớp ổn đònh với kiềm, hoặc để tránh vấn đề này có thể sử dụng ceramic xốp để cố đònh enzyme. Gần đây một số vật liệu vô cơ được giới thiệu thương mại hóa là các sản phẩm diatomic, có tên thương mại là celite. Đây là một vật liệu không đồng nhất, chứa nhiều ion kim loại, là loại vật liệu rẻ tiền, nhưng có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong cố đònh enzyme và trong công nghiệp. Vật liệu từ tính (magnetic materials) có rất nhiều dạng đã được sử dụng trong cố đònh enzyme. Burns đã so sánh dạng hạt của vật liệu từ tính với các vật liệu khác và với sự cải tiến của tổ hợp alginite/ vi hạt từ tính. Alginite thường sử dụng ở dạng cộng hóa trò vì ligand với enzyme hơn là ở dạng nhốt. Vi hạt (microphere) của vật liệu alginite/ vi hạt từ tính có tính chất cơ lý tốt, diện tích bề mặt và độ phân tán tốt, các khả năng cố đònh bằng phương pháp cộng hóa trò cao. Những ứng dụng của vật liệu này vô cùng phong phú. 2.2.3. Các phương pháp cố đònh enzyme Hiện nay có 4 phương pháp chính điều chế enzyme cố đònh dựa trên cơ sở lý hóa học như sau : – Phương pháp hấp thụ vật lý enzyme lên các vật liệu cố đònh không hòa tan có mang hoặc không mang điện tích. – Phương pháp nhốt enzyme ở bên trong polymer tạo thành xung quanh enzyme một hệ thống lưới có lỗ nhỏ để không cho phân tử enzyme đi khỏi màng, nhưng các lỗ đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra đi qua được dễ dàng. – Phương pháp hóa học : liên kết cộng hóa trò và liên lết ion. – Phương pháp khâu mạch. a. Phương pháp hấp thụ vật lý (Physical Absortion) Phương pháp này có ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là trong giai đoạn đầu của việc nghiên cứu enzyme cố đònh. Quá trình thực hiện hấp thụ khá đơn giản : chất 15 hấp thụ và enzyme được trộn lẫn với nhau, ủ một thời gian rồi lọc, rửa phần enzyme không hấp thụ. Enzyme gắn được trên giá thể nhờ tương tác của các liên kết yếu như liên kết : ion, kỵ nước, hydrogen và lực Vander Waals. Khả năng hấp thụ của enzyme phụ thuộc vào các điều kiện môi trường như : nhiệt độ, nồng độ enzyme, diện tích bề mặt tiếp xúc của vật liệu cố đònh. Vật liệu cố đònh hữu cơ chủ yếu được sử dụng là các dẫn xuất của polysacchride tự nhiên như : cellulose và dextran. Theo Mitz và Schlueter thì các enzyme có tính acid như pepsin dễ dàng kết hợp với DEAE Cellulose, còn các enzyme có tính kiềm như trypsin và chymotrypsin thì kết hợp dễ dàng với CM cellulose, phosphate cellulosehoặc citrate cellulose. Các dẫn xuất cellulose này có thể gắn được 2 50% enzyme. Vật liệu cố đònh vô cơ như: thủy tinh xốp, silicagel, cytochrom cũng được sử dụng, các vật liệu này có ưu điểm là chúng có khả năng thay đổi độ xốp lớn và có khả năng hấp thụ cao đối với protein. Phương pháp này có nhược điểm là quá trình giải hấp thụ enzyme (enzyme cố đònh trở thành dễ hòa tan) dễ dàng xảy ra khi thay đổi pH, nhiệt độ và thành phần ion. Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố đònh của vật liệu Nồng độ enzyme : nồng độ enzyme càng cao thì sự hấp thụ càng nhiều, theo công thức của Freundlick. 2 . 1 K CKm Với : K 1 , K 2 hằng số. m số lượng enzyme có khả năng hấp thụ lên bề mặt vật liệu. C : Nồng độ enzyme Công thức của Langmuiz : CK CKK m .1 2 21 16 Thời gian tiếp xúc : cho enzyme tiếp xúc với bề mặt của vật liệu cố đònh, tốc độ hấp thụ phụ thuộc vào đặc tính lý hóa của chất hấp thụ và enzyme. Kích thước của vật liệu cố đònh : tốc độ hấp thụ càng tăng khi kích thước càng giảm. Nhiệt độ : khi nhiệt độ tăng, tốc độ hấp thụ tăng, quá trình hấp thụ xảy ra rất nhanh chỉ sau vài phút thì enzyme sẽ hấp thụ lên trên bề mặt. pH : quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm khả năng hấp thụ, thông thường sự hấp thụ tối đa ở pH điểm đẳng điện. Thành phần môi trường : các chất làm giảm tính hòa tan của enzyme trong pha nước, sẽ làm tăng khả năng hấp thụ. Như vậy muốn hấp thụ càng nhiều, càng làm giảm tính hòa tan của enzyme. b. Phương pháp “nhốt” enzyme (Entrapment Method) Đây là phương pháp đơn giản, enzyme ít bò biến đổi bởi quá trình cố đònh. Phương pháp này có thể cố đònh nhiều enzyme cùng một lúc. Giới hạn của phương pháp này là hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, do đó hoạt tính enzyme thường thấp, nhất là trong trường hợp cơ chất có trọng lượng phân tử lớn. Enzyme được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với enzyme và các chất có trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu qua một cách dễ dàng. Phương pháp này cho phép giữ enzyme trong dung dòch gần giống với tự nhiên và sử dụng enzyme nhiều lần vì có thể tách và thu nó dễ dàng khỏi sản phẩm của quá trình phản ứng bằng cách lọc. Các phương pháp nhốt enzyme trong màng bán thấm : Hình 2.8: Nhốt Enzym trong sợi có lỗ nhỏ E E E 17 Hình 2.9: Enzym được nhốt trong sợi mãûnh Hình 2.10: Nhốt enzym trong gel Hình 2.11: Nhốt enzym trong micro – capsule Nhốt trong cấu trúc mạng Gel Enzyme được nhốt trong cấu trúc mạng gel của các polymer như poly sacchride, protein, polymer tổng hợp như polyacrylamide, polyhydroethylacrylate … Các polysaccharide thường dùng là gel alginate và carrageenan là các poly anion dễ dàng tạo hạt trong dung dòch muối Ca, K và không bền trong môi trường có phosphate. Khắc phục nhược điểm này bằng cách cho gel khâu mạch trong dung dòch glutaraldehyde. Gel chitosan ổn đònh hơn, chitosan được tạo hạt trong dung dòch khâu mạch là polyphosphate, K 4 Fe(CN) 6 thường được sử dụng nhốt tế bào và enzyme. Protein thường dùng là gelatin, enzym được trộn với gel gelatin sau đó được khâu mạch trong dung dòch glutaraldehyde hoặc aldehyte collagen là vật liệu protein có thể dùng để nhốt enzyme trong gel của nó, nhờ khả năng khâu mạch của gel trong dung dòch khâu mạch glutaraldehyde khi được khâu mạch hạt gel không tan và ổn đònh cao. E E E E E E 18 Giới thiệu về gel alginate thương phẩm Là loại vật liệu thích hợp nhốt enzyme. Phương pháp tạo hạt rất đơn giản. Hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dòch CaCl 2 để tạo hạt gel bao bọc lấy enzyme. Sản phẩm khi hòa tan hoàn toàn trong nước sẽ tạo thành dạng gel liên kết thành một chuỗi các polyanion với sự sắp xếp của 2 thành phần: mannuronate và glucuronate có thể là một chuỗi (M M M) (G G G) hoặc có thể đó là (M G M G). Tỉ lệ cao của glucuronate làm gia tăng sự bền vững của gel. Cấu trúc liên kết do Phillips, Wedlock and Williams đưa ra : Khi cho hỗn hợp enzyme và sodium alginate nhỏ từng giọt xuống dung dòch CaCl 2 sẽ tạo thành những hạt kết tủa có cấu trúc bền vững (0.5 4mm) chứa enzyme bên trong. Enzyme được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với enzyme và các chất có trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu qua một cách dễ dàng. Điều này cho phép giữ enzyme trong dung dòch gần giống với tự nhiên và sử dụng enzyme nhiều lần. Enzyme + alginate CaCl 2 Hạt Calcium alginate với enzyme cố đònh 19 Phương trình phản ứng : NainateACaCainateANa 2)lg()lg(2 2 Đặc điểm của gel alginate Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn tế bào và enzyme, hiệu suất nhốt enzyme cao, thao tác và kỹ thuật tiến hành đơn giản. Hạt gel có kích thước có thay đổi từ 0.5 4mm. Hạt có cấu trúc bền vững. Để ổn đònh hạt gel có thể cho hạt gel khâu mạch trong dung dòch glutaraldehyde hoặc các chất khâu mạch khác. Tuy nhiên gel này lại không bền trong môi trường có phosphate. Phương pháp nhốt gel trong hệ sợi Năm 1972, Dinelli đã tiến hành một thí nghiệm khá độc đáo là nhốt enzyme trong hệ sợi và những nghiên cứu này được kết thúc năm 1978. Theo kết quả nghiên cứu của Dinelli, enzyme khi được nhốt vào hệ sợi phát huy khả năng xúc tác rất tốt. Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn phương pháp nhốt enzyme trong gel. Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường là sợi nhân tạo. Các loại sợi này có độ bền với acid, kiềm, các loại ion và các loại dung môi hòa tan. Tính chất trên phụ thuộc rất nhiều vào bản chất hóa học của các polymer tạo ra loại sợi này. Phương pháp tạo vi nang (microcapsule) Khác với phương pháp nhốt trong gel, ở phương pháp này enzyme được nhốt trong một màng bán thấm, nhưng cơ chất và sản phẩm dễ dàng đi qua. Vì hoạt động trong môi trường dung dòch, nên khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme lớn hơn trong trường hợp nhốt trong khuôn gel. 20 Hình 2.12: Qui trình nhốt enzyme trong microcapsule Phương pháp siêu lọc (ultrafilitration) Nguyên tắc của phương pháp này cũng tương tự phương pháp micro capsule. Enzyme được giữ lại trong các màng, sợi siêu lọc. Phương pháp này đã được ứng dụng cố đònh glucose amylase, glucose isomerase, galactosidase. c. Phương pháp hóa học Liên kết cộng hóa trò Cố đònh enzyme bằng liên kết cộng hóa trò với các polymer đã được hoạt hóa, là một trong những phương pháp cố đònh enzyme phổ biến nhất, đảm bảo liên kết vững chắc của enzyme với vật liệu cố đònh. Ưu điểm Do liên kết chặt chẽ với vật liệu cố đònh bằng liên kết cộng hóa trò, nên enzyme không bò ly giải trong suốt quá trình sử dụng. Enzyme dễ dàng tiếp xúc cơ chất do enzyme được gắn trên bề mặt vật liệu cố đònh. Enzyme có khả năng ổn đònh với sự thay đổi nhiệt độ. Monomer ưa nước Pha nước Pha hữu cơ Monomer kỵ nước hóa polymer polymer . dụng enzyme nhiều lần. Enzyme + alginate CaCl 2 Hạt Calcium alginate với enzyme cố đònh 19 Phương trình phản ứng : NainateACaCainateANa 2) lg()lg (2 2 Đặc điểm của gel. màng bán thấm : Hình 2. 8: Nhốt Enzym trong sợi có lỗ nhỏ E E E 17 Hình 2. 9: Enzym được nhốt trong sợi mãûnh Hình 2. 1 0: Nhốt enzym trong gel Hình 2. 1 1: Nhốt enzym. phú. 2. 2.3. Các phương pháp cố đònh enzyme Hiện nay có 4 phương pháp chính điều chế enzyme cố đònh dựa trên cơ sở lý hóa học như sau : – Phương pháp hấp thụ vật lý enzyme lên các vật liệu cố