Nghiên cứu sử dụng enzyme lipase xúc tác phản ứng trans ester sản xuất hương sinh học.Enzyme lipase được phân bố ở cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong đó nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn đều có khả năng tổng hợp lipase.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long LỜI CẢM ƠN Sau năm học trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng em tích lũy nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý giá đặc biệt giúp em hoàn thiện nhân cách sống tốt Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giúp đỡ tất thầy cô công tác trường đại học Bách Khoa Đà Nẵng, thầy khoa Hóa, đặc biệt thầy mơn Cơng Nghệ Sinh Học tích cực, nhiệt tình giúp đỡ, dạy dỗ em suốt thời gian ngồi ghế giảng đường Trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp em xin chân thành cảm ơn thầy TS Đặng Đức Long hướng dẫn tận tình giúp em có cách làm việc khoa học, cho em lời khuyên lúc em gặp khó khăn để giúp em hoàn thành tốt đề tài Em xin cảm ơn chân thành tới anh chị phụ trách phịng thí nghiệm mơn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng thầy Võ Công Tuấn cô Phạm Thị Kim Thảo tạo điều kiện thuận lợi nhất, cố gắng muộn để giúp em hoàn thành thí nghiệm Con xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ba mẹ tất anh chị em gia đình ln ln động viên an ủi, nguồn động lưc giúp vượt qua khó khăn q trình học tập để hồn thành tốt cơng việc giao Đồng thời xin cảm ơn tất bạn thành viên lớp 10SH nói chung, người bạn thân bạn làm đề tài phịng thí nghiệm nói riêng ln bên cạnh lúc khó khăn nhất, nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian học tập làm thí nghiệm Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Cán phản biện thầy cô Hội đồng bảo vệ dành thời gian để xem xét đánh giá góp ý cho đồ án em Đà Nẵng, ngày 01 tháng 06 năm 2015 Phan Thị Thu Hiền ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phản ứng tổng hợp sử dụng enzyme 1.1.1 Khái niệm động học enzyme 1.2 Enzyme lipase( EC.3.1.1.3) 1.2.1 Bản chất enzyme lipase 1.2.2 Phân loại enzyme lipase .6 1.2.3 Trình tự axit amin 1.2.4 Cấu trúc không gian .8 1.2.5 Tính đặc hiệu chất 1.2.6 Ứng dụng enzyme lipase 10 1.3 Các nghiên cứu sử dụng lipase tổng hợp hóa học 13 1.4 Giới thiệu sản phẩm 15 1.4.1 Tính chất sản phẩm BA (C6H12O2) 15 1.4.2 Ứng dụng 16 1.4.3 Phương pháp sản xuất 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.1 Nguyên liệu thiết bị 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Thiết bị dụng cụ .18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long 2.2.1 Xác định hoạt tính enzyme lipase 19 2.2.2 Nghiên cứu tổng hợp butyl acetat sinh học 22 2.2.3 Phương pháp tính tốn 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết xác định nồng độ enzyme lipase 27 3.1.1 Mục đích .27 3.1.2 Kết .27 3.2 Kết thí nghiệm tổng hợp BA 28 3.2.1 Đặt vấn đề công nghệ 28 3.2.2 Kết khảo sát thông số 29 3.2.3 Kết tối ưu thông số quy hoạch thực nghiệm 33 3.3 Cảm quan sản phẩm cách bảo quản 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Kiến nghị 40 SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 So sánh phản ứng hóa học sinh học 16 Bảng 2.1 Các thiết bị dùng nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Thiết bị phản ứng tổng hợp BA 23 Bảng 2.3 Hóa chất cho thí nghiệm tạo BA 23 Bảng 2.4 Mức yếu tố khoảng biến thiên 26 Bảng 2.5 Ma trận thực nghiệm TYT23 26 Bảng 3.1 Ảnh hưởng pH đến enzyme lipase PP 27 Bảng 3.2 Kết đo hoạt độ enzyme lipase PTN 28 Bảng 3.3 Kết chọn độ pha loãng 28 Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm TYT23 kết chuẩn độ sản phẩm 34 Bảng 3.5 Bảng giá trị ttn tính theo chuẩn Student 36 Bảng 3.6 Bảng kết tổng bình phương độ lệch giá trị hàm mục tiêu theo thực nghiệm giá trị hàm mục tiêu tính theo phương trình hồi quy 37 SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Biểu đồ phản ứng có khơng có enzyme phản ứng .3 Hình 1.2: Cấu trúc khơng gian lipase Candida rugosa [19] Hình 1.3: Hình ảnh 3D BA 16 Hình 1.4: Phản ứng hóa học 18 Hình 2.1: Chuẩn độ xác định hệ số hiệu chỉnh k 23 Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm .25 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ thời gian hiệu suất điều kiện 10% lượng enzyme, 360C số vòng lắc 150v/p 30 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ lượng enzyme hiệu suất điều kiện 360C, 18h số vòng lắc 150v 31 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nhiệt độ hiệu suất điều kiện 10% lượng enzyme, thời gian 18h só vịng lắc 150v/p .32 Hình 3.4: Sản phẩm sau phản ứng 33 Hình 3.5: Hình ảnh sản phẩm 40 SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - BA : Butyl acetate LPP : Lipase Porcine Pancreas CRL : lipase từ Candida rugosa TLL : lipase từ Thermomyces lanuginose RT: ẩn số thời gian T : ẩn số nhiệt độ (E) : lượng enzyme E: Enzyme S: Cơ chất ES: Phức hợp enzyme-cơ chất P: Sản phẩm GHS: Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals Hệ thống tồn cầu hài hịa phân loại ghi nhãn hóa chất TĨM TẮT Mục tiêu nghiên cứu nghiên cứu phương thức điều kiện thực họ phản ứng tổng hợp hóa học với xúc tác enzyme, cụ thể phản ứng ester hóa acid hữu đơn giản sử dụng enzyme lipase Các thông số ảnh hưởng điều SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long kiện là: thời gian, nhiệt độ, lượng enzyme đến hiệu suất phản ứng nghiên cứu tối ưu hóa Kết cho thấy điều kiện tối ưu để tổng hợp BA thời gian 19.5h, nhiệt độ 360C, 20% lượng enzyme (v/v thể tích tổng dung mơi), điều kiện lắc ngang 150 vịng/p Phân tích tối ưu cho thấy hiệu suất đạt 85% BA tạo Từ khóa – Ester hóa; acid acetic; Butyl Acetate; butanol; enzymelipase; Porcine pancreas ABSTRACT The objective of this research is to study the methods and conditions for their implementation a chemical fusion with the catalytic enzyme, namely esterification of organic acid used simple lipase enzyme All of these conditions affect as: time, temperature, amount of enzyme reactions to the performance were studied and optimized Results showed that the optimum conditions for synthesis BA in time 19.5h, temperature 360C, 20% of the enzyme (v / v total volume of solvent), in conditions oscillate at 150 rpm Optimal Analysis showed the highest performance 85% of BA was produced Key words – Transesterification; acid acetic; Butyl Acetate; butanol; lipase enzymes; Porcine pancreas; corn starch SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long LỜI MỞ ĐẦU Cùng với phát triển khoa học cơng nghệ, cơng trình nghiên cứu khoa học ngày có ý nghĩa sống Hiện nay, Việt Nam sử dụng enzyme Lipase nhiều ngành công nghiệp công nghiệp thực phẩm, cơng nghiệp hóa học, cơng nghiệp mỹ phẩm, cơng nghiệp da, y dược ngành công nghiệp khác Enzyme lipase phân bố động vật, thực vật vi sinh vật Trong nấm mốc, nấm men, vi khuẩn xạ khuẩn có khả tổng hợp lipase Với ứng dụng rộng rãi tiềm công tác nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase vô cần thiết Enzyme lipase chất xúc tác sinh học có nhiều ứng dụng cho sản xuất quy mô công nghiệp nhằm rút ngắn giai đoạn, giảm chi phí, tính độc hại giảm tối đa nhiễm môi trường so với phương pháp cũ Hầu hết ứng dụng enzyme lipase (bao gồm dạng tự dạng cố định) dựa tính chất thủy phân hợp chất béo, có khoảng 100 loại lipase khác dùng để chuyển đổi lipit thành chất khác Tuy nhiên khả tham gia xúc tác phản ứng thủy phân, enzyme lipase cịn xúc tác số phản ứng tổng hợp số hợp chất có tính chất đặc biệt ứng dụng phong phú hiệu Xuất phát từ ý tưởng với lợi ích mặt kinh tế, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường, em thực đề tài: “Nghiên cứu sử dụng enzyme lipase xúc tác phản ứng trans- ester sản xuất hương sinh học” Mục tiêu đề tài giúp có nhìn mẻ ứng dụng enzyme lipase, bên cạnh đưa giải pháp cho việc sản xuất loại hương liệu tạo tiền đề để nghiên cứu sản phẩm sinh học, xanh, thân thiện với môi trường SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phản ứng tổng hợp sử dụng enzyme Lipase chất xúc tác sinh học linh hoạt không phục vụ chức q trình thủy phân, mà cịn có khả xúc tác phản ứng ngược lại để tạo ester điều kiện định Các chất xúc tác sinh học (enzyme từ nguồn khác nhau) sử dụng dung mơi hữu có hàm lượng nước thấp, phản ứng nhiều người lựa chọn [2;10;19] Mục tiêu đề tài: - Tổng hợp thành cơng BA sinh học Tối ưu hóa điều kiện để tổng hợp BA với hiệu suất phản ứng cao 1.1.1 Khái niệm động học enzyme 1.1.1.1 Khái niệm Trong thể sống (các tế bào) ln xảy q trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sống khơng cịn tồn Quá trình trao đổi chất tập hợp quy luật nhiều phản ứng hóa học khác Các phản ứng hóa học phức tạp liên quan chặt chẽ với điều chỉnh lẫn Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống Chúng có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme gọi chất xúc tác sinh học (bio catalysts) nhằm để phân biệt với chất xúc tác hóa học Giống tất chất xúc tác, enzyme không làm thay đổi lượng tự phản ứng trạng thái cân mà làm tăng giảm tốc độ phản ứng Enzyme làm giảm lượng hoạt hóa phản ứng cách làm cho phản ứng xảy theo nhiều giai đoạn SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: T.S Đặng Đức Long No table of figures entries found Hình 1.1: Biểu đồ phản ứng có khơng có enzyme phản ứng 1.1.1.2 Động học enzyme Trong phát triển hóa sinh học, bước nhảy vọt đạt người ta thực thành công việc tách chiết chất xúc tác sinh học khỏi tế bào nghiên cứu tính chất chúng, lúc người ta nhận biết enzyme có chất protein Năm 1926, Sumner người thu urease dạng kết tinh Cho đến có khoảng 150 enzyme rút dạng tinh khiết Trong số enzyme đó, số biết trọn vẹn cấu trúc bậc I ribonuclease, trypsin, chymotrypsin, … SVTH : Phan Thị Thu Hiền – Lớp 10SH Trang Trong đó: b0: hệ số tự b1,b2, b3 hệ số tuyến tính b12, b23, b13, b123 hệ số tương tác Từ phương án chọn điều kiện thí nghiệm bảng 3.5 xây dựng ma trận thực nghiệm với biến ảo tiến hành thí nghiệm theo ma trận, kết thu sau xà phịng hóa 1ml sản phẩm Kết chuẩn độ thí nghiệm biểu diễn bảng 3.4 với biến x mã hóa từ biến thực X tương ứng theo công thức: xj X j X 0j j (3.2) [18] Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm TYT23 kết chuẩn độ sản phẩm STT xo x1 x2 x3 V Y + + + + 11.5 81.26 + - + + 16.3 72.82 + + - + 3.5 94.67 + - - + 7.2 88.84 + + + - 11.1 82.15 + - + - 9.7 84.44 + + - - 5.8 90.81 + - - - 6.7 89.62 T1 + 0 9.8 84.11 T2 + 0 8.5 85.63 T3 Trong đó: + 0 7.9 86.27 T1, T2, T3 thí nghiệm tâm phương án xo, x1, x2, x3 biến không thứ nguyên y hàm mục tiêu, hiệu suất phản ứng (y tính theo V với V số ml NaOH 0.1 N dư sau xà phịng hóa xác định HCl 0.1 N) Vì phương án chọn hoạch trực giao cấp I yếu tố ảnh hưởng nên hệ số b phương trình hồi quy (3.1) tính theo cơng thức sau: � � u 1 � N � bj x juYu � � N u 1 � i # j #1 1, k � N (3.3) � bij xiu x juYu � � N u 1 [18] � N bijl xiu x ju xluYu � � � N u 1 � b0 N N �x 0u Yu a Tính hệ số b theo công thức (3.3) b0 = 85.58 b123 = 0.766 b2 = - 5.411 b13 = 1.931 b1 = 1.651 b12 =-0.118 b3 = - 1.176 b23 = - 1.941 b Kiểm tra ý nghĩa hệ số b phương trình hồi quy Để kiểm tra ý nghĩa hệ số b phương trình hồi quy trước tiên phải tính phương sai tái Để xác định phương sai tái chúng tơi thực thí nghiệm tâm m = Vì ma trận thực nghiệm phương án quy hoạch trực giao cấp I ma trận trực giao, phân tử đường chéo ma trận tương quan nên hệ số b phương trình hồi quy độc lập xác định với độ xác Sbj Các hệ số b kiểm định theo tiêu chuẩn Student (t) Các bước kiểm tra sau: Kết thí nghiệm tâm: y10 = 84.11 y20 = 85.63 y30 = 86.27 Bảng 3.5 Bảng giá trị ttn tính theo chuẩn Student t t0 t1 t t12 t23 t13 t123 0.368 6.065 6.033 2.39 267.43 5.15 16.9 4.675 Tra bảng phân vị chuẩn Student (tb): tb(p,f) với mức ý nghĩa p=0,05 bậc tự f = m-1=2 với m số lần lặp thí nghiệm tâm thực nghiệm ta có t(0,05;2) = 4,3 [5] So sánh ta thấy giá trị t12, t123 nhỏ tb nên hệ số b12, b123 bị loại khỏi phương trình hồi quy Vậy phương trình hồi quy có dạng: % y b0 b1 x1 b2 x2 b3 x3 b13 x1 x3 Y = 85.58 + 1.651x1 - 5.411x2 - 1.176x3 + 1.931x1x3 – 1.941x2x3 (3.4) c Kiểm tra tương thích phương trình hồi quy Sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm kiểm tra theo chuẩn Fisher (F) Với cơng F tính sau: Phương sai tương thích: (3.6) [18] Trong đó: yu : giá trị thực nghiệm thí nghiệm thứ u ghi bảng 3.8 : giá trị hàm mục tiêu tính theo phương trình hồi quy (3.4) với điều kiện thứ u ghi bảng( 3.7) ftt : Độ tự tương ứng với phương sai tương thích f tt =N-L=8–6= N: số thí nghiệm, N = L: số hệ số có ý nghĩa phương trình hồi quy kiểm tra trên, L=6 Ta lập bảng kết tổng bình phương độ lệch giá trị hàm mục tiêu theo thực nghiệm giá trị hàm mục tiêu tính theo phương trình hồi quy (3.4) sau: Bảng 3.6 Bảng kết tổng bình phương độ lệch giá trị hàm mục tiêu theo thực nghiệm giá trị hàm mục tiêu tính theo phương trình hồi quy (3.4) STT Object 3 Vậy, Sth2 81.26 80.634 0,391 72.80 73.47 0,448 94.67 95.338 0,446 88.8 88.174 0.391 82.1 83.006 0.820 84.4 83.566 0.746 90.81 89.946 0.746 89.6 90.506 0.820 684.47 684.64 4.813 = 0.820 Tra bảng � u1 chuẩn Fisher, Fb(p,f1,f2) với mức ý nghĩa p = 0,05, f1 = N - L, f2 = m-1 = Fb(0,05;2,2) = 19.2 Do F < Fb nên phương trình hồi quy (3.4) tương thích với thực nghiệm phương trình sử dụng để tìm kiếm tối ưu Sử dụng phần mềm Excel Solve để tìm nghiệm tối ưu hàm mục tiêu với miền ràng buộc: -1 ≤ x1,x2,x3 ≤ Sau chạy chương trình tìm kiếm tối ưu ta kết sau: ymax = 87.568 ; x1opt = 0, x2opt =-1, x3opt = Do x1, x2, x3 biến mã hóa ma trận thực nghiệm nhận giá trị nên ta phải tiến hành đổi chúng biến thực theo công thức sau: x max j Z mjax Z 0j j 1 (3.7) [18] Vậy theo thực nghiệm, điều kiện tối ưu để tổng hợp BA là: Lượng enzyme : 10% Nhiệt độ phản ứng : 360C Thời gian phản ứng : 19h30´ 3.3 Cảm quan sản phẩm cách bảo quản - Sản phẩm Butyl acetate sau tổng hợp có mùi thơm nồng đặc trưng ester thơm, dung dịch suốt - Vì sản phẩm chất lỏng, không màu, suốt nên cần bảo quản bình tối màu, kín để tránh bay mùi - Ester dễ cháy, có khả bắt lửa cao nên cần bảo quản lạnh Giữa phân tử ester không tạo liên kết hiđro với liên kết hiđro phân tử ester với nước Bảo quản tủ đơng Hình 3.5: Hình ảnh sản phẩm Như vậy, trình tối ưu hồn tồn phù hợp độ xác cao Kết thí nghiệm kiểm tra sau tối ưu tương đương với kết tính tốn theo mơ hình tối ưu Tuy nhiên q trình tiến hành thí nghiệm xác định hiệu suất phản ứng dựa vào đồ thị gặp phải vấn đề sai số Việc sử dụng bình penicelin để thực phản ứng hạn chế việc lắc mẫu, có mẫu lắc nhiều, mẫu lắc Điều ảnh hưởng tới hiệu suất cho q trình tính tốn Bài tốn có ý nghĩa thực tế lớn sử dụng phương pháp tổng hợp cho việc sản xuất sản phẩm với quy mô lớn Hướng đến sản phẩm có chất lượng, sản xuất quy trình êm dịu, tiết kiệm lượng nhiều chi phí khác CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu tiến hành thí nghiệm, khẳng định rằng: enzyme lipase (LPP) thực phản ứng tổng hợp ester Butyl acetate từ Butanol acid acetic Kết tổng hợp có hiệu suất tốt Chất lượng sản phẩm ổn định Quá trình nghiên cứu để tổng hợp BA phụ thuộc vào yếu tố : nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme Trong đó, có lẽ nồng độ enzyme yếu tố quan trọng cho trình nghiên cứu sản xuất công nghiệp Bởi không chọn lượng enzyme khơng phù hợp việc xác định sản phăm khó khăn làm hao tổn lượng enzyme khơng đáng Vì việc khảo sát nồng độ enzyme với hiệu suất cần thực chi tiết, đầy đủ xác Sau thực tối ưu hóa kết điều kiện tối ưu là: Nhiệt độ phản ứng 360C; thời gian phản ứng 19h30 nồng độ enzyme (w/w) 20% Kết thí nghiệm nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu tương tự, nghiên cứu sử dụng enzyme lipase từ Rhizomucor miehei (Lipozyme RMIM) để sản xuất BA có thông số sau: thời gian phản ứng 18h; nhiệt độ phản ứng 370C lượng enzyme 25%(v/v) Điều chứng tỏ khả xúc tác phản ứng enzyme lipase từ nguồn gần tương tự Nếu có sai khác khơng q cao có sai khác cấu trúc chúng Ngồi cịn điều kiện thực thí nghiệm mà có chênh lệch 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu thật có ý nghĩa thực vào đời sống, từ ý tưởng tiếp tục nghiên cứu cách thay đổi nguồn enzyme Lipase cho kết tốt hơn, đảm bảo phản ứng xảy với hiệu suất cao Nếu tiếp tục, nên nghiên cứu thêm phần cố định enzyme lipase để sử dụng cho phản ứng nhằm tiết kiệm nguồn enzyme công việc tinh sản phẩm đảm bảo Sau ta thực cố định enzyme Lipase, sử dụng chúng quân át chủ nhằm thực nghiên cứu tương tự từ nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm tinh bột, lipit ( loại dầu) loại rượu Tiến hành phản ứng tổng hợp điều kiện cụ thể nhằm tạo sản phẩm khác (cùng chất ester) có nhiều ứng dụng quan trọng sống Biến tính (ester hóa) tinh bột acid oleic, axit lauric axit palmitic nhờ enzyme lipase [12] Phản ứng ester hóa nước cốt dừa 2phenyl acid Phản ứng ancol phenolic ester [14] Ester hóa trực tiếp acetic , butyric , caproic axit , với ethanol , butanol , isopentanol , ( Z ) -3- Hexen - l – ol Bột từ nảy mầm lúa mì , lúa mạch, hạt cải dầu , ngơ , linola tổng hợp phân tử ester trọng lượng nhỏ môi hữu ( hexane )[16] Hoàn thiện dây chuyền sản xuất, thiết kế thiết bị phù hợp để đưa vào sản xuất với quy mơ lớn Tuy chi phí có tốn so với sản xuất thơng thường tính lâu dài có tính bền vững cho việc kinh doanh đảm bảo chất lượng môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Anh A.B Majumder, B Singh, D Dutta, S Sadhukhan and M.N Gupta 2006 “Lipase catalyzed synthesis of benzyl acetate in solvent using vinyl acetate as acyl donor” Bioorg Med Chem Lett 4041- 4044, (RT), reaction (E) The optimums 37oC 0408) A Guvenc, N Kapucu and U Mehmetoğlu(2002) “The production of isoamyl acetate using immobilized lipases in a solvent Biochem., vol 38, pp 379386 A.E.Frisssen, C.MDavidescu, R croitoru.L.A.M vanden Broek F.Petter.C.R Boreiu(2008) Lipase catalyzed synthesis of aromatic esters of sugar alcohols Habib Hỏcharni; Moncef Chaabouni; Youssef Gargouri, Adel Sayari, 2009 Solvent-free lipase- catalyzed synthesis of long chain starch esters using microwave heating: Optimization by response surface methodology Hui Shan Grace Tan, Bin Yu, Philip Curran, Shao Quan Liu; 2010 Lipase – catalyed synthesis of natural aroma- active 2- Phenylethy ester in coconut cream M Karra-Chaabouni, H Ghamgui, S Bezzine Gargouri Y, 2006 “Production of flavor esters by immobilized simulans lipase in a solvent-free system” J Process Biochempp 1692-1698 P.T Anastas, L.B Bartlett, M.M Kirchhoff and T.C Williamson, 2000 “ Role of catalysis in the design, development and implementation of green chemistry” Catal Today, vol 55, pp 11-22 R Ben Salah, H Ghamghui, N Miled, H Mejdoub and Y Gargouri Y 2007 “Production of butyl acetate by lipase from novel of J Biosci Bioeng” vol 104, pp 268-372 S.H Krishna, S Divakar, S.G Prapulla and N.G Karanth, 2001 “Enzymatic synthesis of isoamyl acetate using immobilized lipase from miehei” J Biotechnol., vol 87, pp.193 201 10 Kebba Sabally, Salwa Karboune, Faustinus K Yebaoh, and Selim Kermasha, , 2005 “Enzymatic esterification of dihydrocaffeic acid with linoleyl alcohol in organic solvent media” 11 S Mat Radzi, W.A.F Mustafa, S.S Othman, H.M Noor, 2005 “ Green synthesis of Butyl Acetate , A Pineapple Flavour through Lipase catalyzed reactions” World Academy of Science, Engineering and Technology 59 12 Sergio García & Gerardo Saucedo-Castañeda & Ernesto Favela-Torre (2011) Organic Phase Synthesis of Ethyl Oleate Using Lipases Produced by Solidstate FermentationAntonio Martínez-Ruiz & Hugo 13 Funda Yagiz, 14 Hong-yan Zeng, Kai-bo Liao, Xin Deng, He Jiang and Fan Zhang (2009) Characterization of the lipase immobilized on Mg–Al hydrotalcite for biodiesel, Biotechnology Institute College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, Hunan, Chinese Academy of Sciences, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Kunming 650223, Yunnan, China, Process Biochemistry, V 4, No 3, pp 791 798 15 Julio C Santos, Gisele F M Nunes, Ana B R Moreira, Victor H Perez and Heizir F de Castro (2007) Characterization of Candida rugosa Lipase Immobilized on Poly(N-methylolacrylamide), and Its Application in Butyl Butyrate Synthesis, Chem Eng Technol Engineering School of Lorena University of São Paulo, Lorena, Brazil 16 Wei Du, Yuanyuan Xu, Dehua Liu and Jing Zeng (2004) Comparative study on lipase-catalyzed transformation of soybean oil for biodiesel production with different acyl acceptors Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 30, 125–129 Tài liệu Tiếng Việt 17 Hà Dun Tư (2009) Phân tích hóa học thực phẩm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 18 Nguyễn Thị Lan (2012) Giáo trình Mơ hình thống kê tối ưu hóa trường Đại học bách khoa Đà Nẵng 19 Đặng Thị Thu (2004) Nghiên cứu công nghệ sản xuất số loại dầu béo Lipase Đề tài cấp nhà nước Mã số KC 04 – 07 20 Lê Thị Thanh Hương (2011) Nghiên cứu tổng hợp biodiesel phản ứng alcol phân từ mỡ cá da trơn ĐBSCL xúc tác acid base Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Bách Khoa TP HCM 21 Lê Thanh Hải (2013) Giáo trình thực hành thí nghiệm môn Proteinenzyme Trường cao đẳng kinh tế công nghệ Hồ Chí Minh Khoa Cơng Nghệ Sinh Học 22 Trần Thị Bé Lan, Nguyễn Phương Phi Phan Ngọc Hòa (2012) Nghiên cứu enzyme lipase từ Candida rugosa Porcine pancereas xúc tác phản ứng transester hóa dầu dừa Tạp chí khoa học 2012:23b 105-114, Trường đại học Cần Thơ 23 Trần Thị Bé Lan, Nguyễn Minh Nam, Tạ Thị Thanh Thúy Phan Ngọc Hòa (2012) So sánh số tính chất hai chế phẩm enzyme Lipase từ Candida rugosa Porcine pancereas Tạp chí khoa học 2012:22b 210-220, Trường đại học Cần Thơ Tài liệu internet 24 https://vi.scribd.com/doc/39534723/Do-an-Biodiesel Truy cập: 04/03/2015 25 https://vi.scribd.com/doc/89582320/Enzym-Lipase Truy cập: 12/03/2015 26 http://123doc.org/document/195384-tong-quan-ve-enzym-lipase.htm? page=7 Truy cập: 21/04/2015 27.http://www.docs.vn/vi/sinh-hoc-38/41511-tong-quan-ve-san-xuat-butanolbang.html Truy cập: 27/04/2015 28.http://doc.edu.vn/tai-lieu/do-an-phuong-phap-noi-chuyen-hoa-ester-bangenzyme-53024/ Truy cập: 10/05/2015 29.http://www.sch.vn/luu-tru/310-tin-tuc/4942-ung-dung-lipase-trong-doisong Truy cập ngày 11/05/2015 30.http://hoachatsuongmai.com/uploads/tailieu/20140115205158YArhCWv8w y.pdf Truy cập ngày 13/05/2015 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Dụng cụ, thiết bị dùng cho trình nghiên cứu - Bình penicillin: 20 lọ - Chậu, rổ nhựa: - Túi nilon, dây buộc - Cốc đong 50, 100, 250, 500ml: loại - Máy ly tâm nhỏ, máy ly tâm lạnh, máy đo pH - Cân kỹ thuật, cân phân tích - Đũa thủy tinh, đầu cơn, pipet loại - Bình tam giác: bình - Bể điều nhiệt lắc ngang - Tủ sấy, máy khuấy từ - Găng tay, trang y tế Phụ lục 2: Hóa chất dùng cho q trình nghiên cứu - Cồn 700 - 990 - Hóa chất pha đệm: KCl, acid boric - NaOH 0.1N, HCl 0.1 N, H2SO4 0.1N, - Sữa tươi không đường - Dầu olive - Phenolphatalain - Giấy quỳ Phụ lục 3: Hình ảnh thiết bị q trình nghiên cứu Hình 3.1 Bể điều nhiệt lắc ngang nóng lạnh Hình 3.4 Tủ sấy Hình 3.2 Cân điện tử Hình 3.3 Cân phân tích Phụ lục 4: Chuẩn bị hóa chất (Tính hoạt tính enzyme lipase chất sữa tươi) Pha hóa chất: - KOH 0.1 N : dùng 0.56g KOH tinh thể hòa tan 100ml nước cất Phenolphtalain 1% : dùng 0.2g phenolphtalain hòa tan 20ml cồn 96% Ống chuẩn H2SO4 0.1N pha 1l nước cất Pha dung dịch enzyme: 1g enzyme hòa 10ml dung dịch đệm Borat pH= - 8.5 cho vào máy khuấy từ v= 300 v/p Dung dịch đệm pha sau: cân 0.6185 g a.boric 0.2455g KCl hòa tan 50ml nước cất Sau cho thêm 11.66 ml dung dịch NaOH 0.2 N Bảng Bảng pha dung dịch đệm Borat pH 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 NaOH 0.2N(ml) 3.9 6.0 8.6 11.8 15.8 20.8 26.4 32.1 36.9 Phụ lục Giá trị chuẩn số Student Độ tự f2 Mức có ý nghĩa P từ 0,2 �0,001 0,20 0,10 0,05 0,02 3,08 6,31 12,71 31,82 1,89 2,92 4,30 6,97 1,64 2,35 3,18 4,54 1,53 2,13 2,78 3,75 0,01 63,66 9,93 5,84 4,60 0,005 127,32 14,09 7,45 5,60 0,001 636,62 31,60 12,94 8,61 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120 � 1,48 1,44 1,42 1,40 1,38 1,37 1,36 1,36 1,35 1,34 1,34 1,33 1,33 1,33 1,33 1,32 1,32 1,32 1,32 1,32 1,32 1,32 1,31 1,31 1,31 1,31 1,30 1,30 1,29 1,28 2,02 1,94 1,90 1,86 1,83 1,81 1,80 1,78 1,77 1,76 1,75 1,75 1,74 1,73 1,73 1,73 1,72 1,72 1,71 1,71 1,71 1,71 1,70 1,70 1,70 1,70 1,68 1,67 1,66 1,64 2,57 2,45 2,37 2,31 2,26 2,23 2,20 2,18 2,16 2,15 2,13 2,12 2,11 2,10 2,09 2,09 2,08 2,07 2,07 2,06 2,06 2,06 2,05 2,05 2,04 2,04 2,02 2,00 1,98 1,96 3,37 3,14 3,00 2,90 2,82 2,76 2,72 2,68 2,65 2,62 2,60 2,58 2,57 2,55 2,54 2,53 2,52 2,51 2,50 2,49 2,48 2,48 2,47 2,47 2,46 2,47 2,42 2,39 2,36 2,33 4,03 3,71 3,50 3,36 3,25 3,17 3,11 3,06 3,01 2,98 2,95 2,92 2,90 2,88 2,86 2,85 2,83 2,82 2,81 2,80 2,79 2,78 2,77 2,76 2,76 2,75 2,70 2,66 2,62 2,58 4,77 4,32 4,03 3,83 3,69 3,58 3,50 3,43 3,37 3,33 3,29 3,25 3,22 3,20 3,17 3,15 3,14 3,12 3,10 3,09 3,08 3,07 3,06 3,05 3,04 3,03 2,97 2,91 2,86 2,81 6,86 5,96 5,41 5,04 4,78 4,59 4,44 4,32 4,22 4,14 4,07 4,02 3,97 3,92 3,88 3,85 3,82 3,79 3,77 3,75 3,73 3,71 3,69 3,67 3,66 3,65 3,55 3,46 3,37 3,29 Phụ lục Giá trị chuẩn số Fisher mức ý nghĩa p = 0,05 f2=m-1 10 f1=N-L 164,4 18,5 10,1 7,7 6,6 6,0 5,6 5,3 5,1 5,0 199,5 19,2 9,6 6,9 5,8 5,1 4,7 4,5 4,3 4,1 215,7 19,2 9,3 6,6 5,4 4,8 4,4 4,1 3,9 3,7 224,6 19,3 9,1 6,4 5,2 4,5 4,1 3,8 3,6 3,5 230,2 19,3 9,0 6,3 5,1 4,4 4,0 3,7 3,5 3,3 234,0 19,3 8,9 6,2 5,0 4,3 3,9 3,6 3,4 3,2 12 244,6 19,4 8,7 5,9 4,7 4,0 3,6 3,3 3,1 2,9 24 249,0 19,5 8,6 5,8 4,5 3,8 3,4 3,1 2,9 2,7 � 254,3 19,5 8,5 5,6 4,4 3,7 3,2 2,9 2,7 2,5 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 24 26 28 30 40 60 120 � 4,8 4,8 4,7 4,6 4,5 4,5 4,5 4,4 4,4 4,4 4,3 4,3 4,2 4,2 4,2 4,1 4,0 3,9 3,8 4,0 3,9 3,8 3,7 3,7 3,6 3,6 3,6 3,5 3,5 3,4 3,4 3,4 3,3 3,3 3,2 3,2 3,1 3,0 3,6 3,5 3,4 3,3 3,3 3,2 3,2 3,2 3,1 3,1 3,1 3,0 3,0 2,9 2,9 2,9 2,8 2,7 2,6 3,4 3,3 3,2 3,1 3,1 3,0 3,0 2,9 2,9 2,9 2,8 2,8 2,7 2,7 2,7 2,6 2,5 2,5 2,4 3,2 3,1 3,0 3,0 2,9 2,9 2,8 2,8 2,7 2,7 2,7 2,6 2,6 2,6 2,5 2,5 2,4 2,3 2,2 3,1 3,0 2,9 2,9 2,8 2,7 2,7 2,7 2,6 2,6 2,6 2,5 2,4 2,4 2,4 2,3 2,3 2,2 2,1 2,8 2,7 2,6 2,5 2,5 2,4 2,4 2,3 2,3 2,3 2,2 2,2 2,1 2,1 2,1 2,0 1,9 1,8 1,8 2,6 2,5 2,4 2,3 2,3 2,2 2,2 2,1 2,1 2,1 2,0 2,0 1,9 1,9 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2,1 2,0 2,0 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,7 1,7 1,8 1,5 1,4 1,3 1,0 ... ? ?Nghiên cứu sử dụng enzyme lipase xúc tác phản ứng trans- ester sản xuất hương sinh học? ?? Mục tiêu đề tài giúp có nhìn mẻ ứng dụng enzyme lipase, bên cạnh đưa giải pháp cho việc sản xuất loại hương. .. lớn [29] 1.3 Các nghiên cứu sử dụng lipase tổng hợp hóa học Lipase xúc tác phản ứng sinh học linh hoạt thể nhiều phản ứng biến đổi sinh học: thủy phân, nội ester hoá, ester hoá,… Lipase hoạt động... hợp sử dụng enzyme Lipase chất xúc tác sinh học linh hoạt khơng phục vụ chức q trình thủy phân, mà cịn có khả xúc tác phản ứng ngược lại để tạo ester điều kiện định Các chất xúc tác sinh học (enzyme