Nghiên cứu tiền xử lý rơm rạ để nâng cao hiệu suất thủy phân bằng enzyme cho sản xuất etanol sinh học

iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ Biorefinery Tinh chế sinh khối Bột sunfat Bã rắn thu được sau tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH +Na2S Bột xút Bã rắn thu được sau tiền xử lý rơm rạ bằ

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong luận án này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng quy định

TẬP THỂ HƯỚNG DẪN TÁC GIẢ

HD1: PGS.TS Doãn Thái Hòa Nguyễn Thị Minh Phương

HD2: TS Lê Quang Diễn

ii

LỜI CẢM ƠN

Luận án được hoàn thành là kết quả của sự nỗ lực của bản thân và sự giúp đỡ, động

viên tinh thần của các thầy cô giáo, gia đình, đồng nghiệp, bạn bè

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội,

Trung tâm Nghiên cứu Vật liệu Polyme, Viện Kỹ thuật Hóa học, Viện Đào tạo Sau đại học

đã tạo điều kiện cho tôi học tập, thực hiện luận án tại Trường

Với tất cả sự chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến tập thể hướng

dẫn: PGS.TS Doãn Thái Hòa, TS Lê Quang Diễn đã gợi mở các ý tưởng khoa học, tạo

mọi điều kiện về vật chất cũng như tinh thần cho tôi hoàn thành luận án Các thầy cô giáo

đã hướng dẫn tôi tận tình bằng lòng nhiệt huyết của nhà giáo và bằng sự say mê, hiểu biết

sâu sắc về chuyên môn của nhà khoa học Qua luận án, tôi xin bày tỏ sự cảm phục, lòng

kính trọng và biết ơn to lớn của mình đối với các thầy cô giáo hướng dẫn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ về mọi mặt của các Thầy Cô giáo và

đồng nghiệp trong Bộ môn Công nghệ Xenluloza và Giấy–Viện Kỹ thuật Hoá học, Trung

tâm nghiên cứu vật liệu Polyme, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Cảm ơn đề tài

04/ĐT.04.09/ NLSH, đề tài nhánh Nghị định thư với Vương quốc Anh của PGS.TS Doãn

Thái Hòa đã cung cấp các enzyme thương phẩm, các dụng cụ phân tích và hỗ trợ một phần

kinh phí cho một số nghiên cứu trong luận án

Ngoài ra, luận án còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ nghiên cứu phần lên men dịch

đường thành etanol, chỉnh sửa và hoàn thiện luận án của PGS.TS Trần Đình Mấn – Viện

CNSH & TP, Viện Hàn lâm KHCNVN, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và sự tri ơn sâu sắc

Bản luận án là món quà xin dành tặng cho Bố mẹ, các anh chị em, gia đình nhỏ và

con gái Bùi Nguyễn Tường Vy

Hà Nội, ngày 17 tháng 08 năm 2015

TÁC GIẢ

Nguyễn Thị Minh Phương

i

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ETANOL SINH HỌC 4

1.1.Tổng quan về nhiên liệu sinh học 4

1.1.1 Khái niệm và phân loại 4

1.1.2 Công nghệ sản xuất etanol sinh học 4

1.1.3 Tình hình sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học trong và ngoài nước 5

1.2 Sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulose 7

1.2.1 Khái niệm sinh khối 7

1.2.2 Công nghệ tiền xử lý sinh khối lignocellulose cho sản xuất nhiên liệu 8

1.2.3 Thủy phân sinh khối bằng enzyme cho sản xuất etanol sinh học 18

1.2.4 Lên men etanol từ dịch thủy phân sinh khối bằng enzyme 24

1.3 Sản xuất etanol sinh học từ rơm rạ 30

1.3.1 Tiềm năng rơm rạ ở Việt Nam 30

1.3.2 Một số đặc điểm thực vật của rơm rạ 30

1.3.3 Công nghệ TXL rơm rạ hiệu quả cho sản xuất etanol sinh học 32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 38

2.1 Vật liệu 38

2.1.1 Rơm rạ và phương pháp lấy mẫu 38

2.1.2 Hóa chất 38

2.1.3 Enzyme 38

2.1.4 Chủng vi sinh vật lên men etanol 39

2.2 Phương pháp xác định thành phần sinh khối, cấu tạo giải phẫu và một số tính chất lý học của rơm rạ 40

2.2.1 Phương pháp xác định thành phần sinh khối của rơm rạ 40

2.2.2 Phương pháp xác định cấu tạo giải phẫu của rơm rạ 40

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu tính chất xơ sợi của rơm rạ 41

2.2.4 Phương pháp xác định khối lượng thể tích của rơm rạ 41

ii

2.2.5 Phương pháp xác định thành phần nguyên tố 41

2.2.6 Xác định chỉ số kết tinh của cellulose rơm rạ 42

2.3 Phương pháp xác định thành phần hóa học của rơm rạ 42

2.4 Phương pháp tiền xử lý rơm rạ 42

2.4.1 Phương pháp TXL rơm rạ bằng axit axetic 44

2.4.2 Phương pháp tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm 44

2.4.3 Phương pháp thu bột xút tẩy trắng từ bột xút rơm rạ 45

2.5 Phương pháp thủy phân rơm rạ 46

2.6 Phân tích thành phần và nồng độ đường 46

2.6.1 Phân tích nồng độ đường bằng phương pháp DNS 46

2.6.2 Phân tích thành phần dung dịch đường bằng phương pháp HPLC 48

2.7 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme xylanase và cellulase 48

2.7.1 Xác định hoạt độ endoglucanase 48

2.7.2 Xác định hoạt độ exoglucanase 48

2.7.3 Hoạt độ enzyme β-glucosidase 49

2.7.4 Xác định hoạt lực xylanase 49

2.8 Phương pháp lên men etanol 49

2.8.1 Lên men etanol dịch đường thủy phân 49

2.8.2 Xác định hàm lượng etanol bằng phương pháp hóa học 50

2.9 Phương pháp xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm Box−Behnken sử dụng phần mềm Design−Expert 7.0.0 52

2.9.1 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm và quy hoạch thực nghiệm 52

2.9.2 Tối ưu hóa các quá trình chế biến rơm rạ 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Đặc điểm cấu tạo, tính chất lý học và thành phần hóa học cơ bản của rơm rạ một số giống lúa phổ biến ở Việt Nam 53

3.1.1 Đặc điểm thành phần sinh khối của thân cây lúa 53

3.1.2 Cấu tạo hiển vi của thân cây lúa 54

3.1.3 Một số tính chất lý học của rơm rạ 57

iii

3.1.4 Thành phần nguyên tố của rơm rạ 60

3.1.5 Thành phần hóa học của rơm rạ 61

3.2 Tiền xử lý rơm rạ cho quá trình đường hóa bằng enzyme 62

3.2.1 Tiền xử lý rơm rạ bằng axit axetic 62

3.2.2 Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm ở áp suất khí quyển 73

3.2.3 Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm theo phương pháp nấu kín 81

3.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân rơm rạ đã qua tiền xử lý và lên men dịch đường thành etanol 105

3.3.1 Tối ưu hóa quá trình thủy phân cellulose rơm rạ từ bột xút tẩy trắng 105

3.3.2 Tối ưu hóa quá trình thủy phân bột xút 109

3.3.3.Tối ưu hóa quá trình thủy phân bột sunfat 113

3.3.4 Tối ưu hóa thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý bằng axit axetic 116

3.3.5 Lên men dịch đường thu etanol 120

KẾT LUẬN 122

KIẾN NGHỊ NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO 125 DANH MỤC CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

PHỤ LỤC

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

Biorefinery Tinh chế sinh khối

Bột sunfat Bã rắn thu được sau tiền xử lý rơm rạ bằng (NaOH +Na2S)

Bột xút Bã rắn thu được sau tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH

CBH Exo β-1,4-glucanases (β-1,4-exoglucane hydrolase) (Cellobiohydrolase hay

Exoglucanase) DMC (Direct microbial conversion) Chuyển hóa bằng vi sinh vật trực tiếp

DNS Dinitrosalicylic axit

EDX (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy) Phổ tán xạ năng lượng tia X

EG Endo-β-1,4-glucanases (Endoglucanase)

EMP (Embden-Meyerhoff-Panass) Con đường đường phân

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HRTEM (High-resolution transmission electron microscopy) Kính hiển vi điện tử

truyền qua độ phân giải cao IPCC (Intergovernmental Panel on Climate Change) Ban Liên Chính phủ về biến đổi

khí hậu Kiềm hoạt tính Là kiềm hữu hiệu quy đổi sang đơn vị Na2O trong trường hợp nấu xút là

NaOH, trong trường hợp nấu sunfat là (NaOH+Na2S) KLTB Khối lượng trung bình

Nấu kiềm Nói chung cả tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH và bằng hỗn hợp (NaOH +Na2S) Nấu sunfat Tiền xử lý rơm rạ bằng hỗn hợp (NaOH +Na2S)

Nấu xút Tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH

NLSH Nhiên liệu sinh học

SEM (Scanning Electron Microscopy) Kính hiển vi điện tử quét

SHF (Separate hydrolysis and fermentation) Thủy phân và lên men riêng biệt SSF (Simultaneous saccharification and fermentation) Đường hóa và lên men đồng

thời TAPPI (The Technical Association of the Pulp and Paper Industry)

Hiệp hội giấy và bột giấy của Mỹ Trích ly kiềm Xử lý bột axetic thu được bằng dung dịch NaOH ở điều kiện “mềm”

XRD (X-ray diffraction) Phổ nhiễu xạ tia X

v

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Đặc điểm của enzyme Cellic® CTec2 và Cellic® HTec2 38

Bảng 2.2 Xác định thành phần hóa học của rơm rạ theo phương pháp TAPPI 42

Bảng 2.3 Bảng pha loãng cồn 0,25% cho phân tích nồng độ etanol 51

Bảng 3.1 Thành phần sinh khối của thân cây lúa không hạt 54

Bảng 3.2 Kích thước xơ sợi của một số loại cây thân thảo ngắn ngày 58

Bảng 3.3 Khối lượng thể tích của rơm rạ một số giống lúa 59

Bảng 3.4 Thành phần nguyên tố của rơm rạ một số giống lúa 60

Bảng 3.5 Thành phần hóa học của rơm rạ một số giống lúa 61

Bảng 3.6 Biến đổi của cellulose trong quá trình TXL bằng (CH3COOH+HCl) 72

Bảng 3.7 Chỉ số độ kết tinh của cellulose rơm rạ sau TXL bằng kiềm 78

Bảng 3.8 Thành phần tinh thể, vô định hình của cellulose trong rơm rạ sau nấu xút 78

Bảng 3.9 Thành phần tinh thể, vô định hình của cellulose trong rơm rạ sau nấu sunfat 78

Bảng 3.10 Bảng thống kê các yếu tố khảo sát và khoảng biến đổi 82

Bảng 3.11 Thiết kế thực nghiệm TXL rơm rạ bằng xút theo Box-Behnken 82

Bảng 3.12 Tối ưu hóa hàm mục tiêu đường khử khi thủy phân bột xút theo các biến 85

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của NaOH đến sự thay đổi thành phần của cellulose 89

Bảng 3.14 Thành phần dịch đường sau thủy phân bằng enzyme của bột xút 91

Bảng 3.15 Thiết kế thí nghiệm TXL rơm rạ bằng sunfat theo Box-Behnken 93

Bảng 3.16 Tối ưu hóa hàm mục tiêu đường khử khi thủy phân bột sunfat theo các biến 98

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của (NaOH+Na2S) đến sự thay đổi thành phần của cellulose 100

Bảng 3.18 Thành phần dịch đường sau quá trình thủy phân bằng enzyme của bột sunfat 104

Bảng 3.19 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bột xút tẩy trắng từ rơm rạ 106

Bảng 3.20 Thiết kế thí nghiệm thủy phân bột xút tẩy trắng từ rơm rạ theo Box– Behnken 107

Bảng 3.21 Thành phần hóa học của rơm rạ ban đầu và bột xút tối ưu 109

Bảng 3.22 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bột xút rơm rạ 110

Bảng 3.23 Thiết kế thí nghiệm thủy phân bột xút tối ưu từ rơm rạ theo Box−Behnken 110

vi

Bảng 3.24 So sánh các chế độ thủy phân khác nhau của bột xút tối ưu từ rơm rạ 113Bảng 3.25 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bột sunfat rơm rạ 113Bảng 3.26 Thiết kế thí nghiệm thủy phân bột sunfat tối ưu từ rơm rạ theo Box−Behnken 114Bảng 3.27 So sánh các chế độ thủy phân khác nhau của bột sunfat tối ưu từ rơm rạ 116Bảng 3.28 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bột rơm rạ sau TXL 117Bảng 3.29 Thiết kế thí nghiệm thủy phân bột rơm rạ sau TXL bằng (CH3COOH+HCl) và trích ly kiềm theo Box−Behnken 117Bảng 3.30 So sánh điều kiện thủy phân tối ưu của các loại bột từ rơm rạ 119Bảng 3.31 Hiệu suất lên men etanol dịch đường bột rơm rạ sau thủy phân 120

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Sản xuất etanol sinh học từ sinh khối lignocellulose 5

Hình 1.2 Sản lượng nhiên liệu sinh học trên thế giới 6

Hình 1.3 Cấu tạo vách tế bào thực vật 8

Hình 1.4 Cấu tạo phân tử cellulose 9

Hình 1.5 Các đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin 10

Hình 1.6 Thủy phân cellulose bằng cellulase 19

Hình 1.7 Cơ chế thủy phân xylan bằng xylanase 22

Hình 1.8 Sơ đồ phân giải glucose thành Pyruvate 26

Hình 1.9 Cấu tạo thân cây lúa 31

Hình 1.10 Cấu tạo hiển vi của thân cây lúa 31

Hình 2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính enzyme CTec 2 39

Hình 2.2 Hình thái chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae BG1và vị trí phân loại 39

Hình 2.3 Hình ảnh minh họa cây lúa, rơm rạ và tách hạt lúa Khang Dân 40

Hình 2.4 Hình ảnh minh họa chuẩn bị nguyên liệu rơm rạ cho nghiên cứu 43

Hình 2.5 Thiết bị tiền xử lý rơm rạ bằng theo phương pháp nấu kín 45

Hình 2.6 Bột xút tẩy trắng từ rơm rạ 45

Hình 2.7 Thủy phân bột sau tiền xử lý bằng hỗn hợp enzyme CTec2 và HTec2 46

Hình 2.8 Bột sunfat tối ưu cho nghiên cứu quá trình thủy phân bằng enzyme 46

Hình 2.9 Sự phụ thuộc của nồng độ đường khử và mật độ quang học 47

Hình 3.1 Rơm và rạ của lúa Khang Dân 54

Hình 3.2 Cấu tạo hiển vi lóng thân cây lúa Khang Dân 55

Hình 3.3 Cấu tạo hiển vi của lóng thân cây lúa Q5 56

Hình 3.4 Cấu tạo hiển vi của đốt thân cây lúa 57

Hình 3.5 Phổ XRD của rơm rạ Khang Dân 59

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ axit clohydric đến sự chuyển hóa rơm rạ 64

Hình 3.7 Ảnh SEM rơm rạ Khang Dân trước tiền xử lý 65

Hình 3.8 Ảnh SEM bột rơm rạ sau TXL bằng axit axetic (có bổ sung 1% HCl về thể tích) 65

viii

Hình 3.9 Ảnh SEM bột rơm rạ sau TXL bằng axit axetic (có bổ sung 2% HCl về thể

tích) 66

Hình 3.10 Ảnh SEM bột rơm rạ sau TXL bằng axit axetic (có bổ sung 3% HCl về thể tích) 66

Hình 3.11 Ảnh SEM bột rơm rạ sau TXL bằng axit axetic (có bổ sung 4% HCl về thể tích) 66

Hình 3.12 Ảnh SEM bột rơm rạ sau TXL bằng axit axetic (có bổ sung 5% HCl về thể tích) 67

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất đường khử 67

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu suất đường khử 68

Hình 3.15 Ảnh hưởng của quá trình trích ly kiềm đến hiệu suất bột và hiệu suất đường hóa 69

Hình 3.16 Ảnh hưởng của trích ly kiềm đến mức tách loại các hợp chất của rơm rạ 70

Hình 3.17 Sự biến đổi của các thành phần hóa học của rơm rạ sau quá trình TXL bằng axit axetic kết hợp với trích ly kiềm 71

Hình 3.18 Phổ XRD của rơm rạ và bột rơm rạ sau tiền xử lý bằng (CH3COOH+HCl) 72

Hình 3.19 Ảnh hưởng của mức sử dụng kiềm hoạt tính tới hiệu suất bột và hiệu suất đường khử 74

Hình 3.20 Ảnh hưởng của mức sử dụng kiềm hoạt tính tới mức tách loại lignin 75

Hình 3.21 Ảnh hưởng của mức sử dụng kiềm đến mức tách loại các chất vô cơ 76

Hình 3.22 Ảnh hưởng của mức sử dụng kiềm đến lượng cellulose bị hòa tan (1-Nấu xút; 2-Nấu sunfat) 76

Hình 3.23 Phổ XRD của rơm rạ ban đầu và bột xút sau TXL 77

Hình 3.24 Phổ XRD của rơm rạ ban đầu và bột sunfat sau TXL 77

Hình 3.25 Ảnh SEM của rơm rạ trước và sau TXL 80

Hình 3.26 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ trong tiền xử lý rơm rạ bằng xút theo phương pháp nấu kín 83

Hình 3.27 Ảnh hưởng đồng thời của mức sử dụng xút và nhiệt độ 84

Hình 3.28 Ảnh hưởng đồng thời của mức sử dụng xút và thời gian 85

Hình 3.29 Ảnh hưởng đồng thời của thời gian xử lý và nhiệt độ 85

Hình 3.30 Tối ưu hóa hiệu suất đường khử bột xút rơm rạ theo các yếu tố ảnh hưởng 86

ix

Hình 3.31 Ảnh SEM của bột xút sau TXL rơm rạ bằng NaOH 87

Hình 3.32 Ảnh hưởng của tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH đến sự phân hủy cellulose 88

Hình 3.33 Phổ XRD của rơm rạ ban đầu và bột xút tối ưu 89

Hình 3.34 Ảnh hưởng của NaOH đến mức tách loại lignin trong rơm rạ 90

Hình 3.35 Ảnh hưởng của tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH đến mức tách loại các chất vô cơ 90

Hình 3.36 Phổ HPLC của dịch đường từ bột xút tối ưu 91

Hình 3.37 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ trong quá trình TXL rơm rạ bằng tác nhân sunfat theo phương pháp nấu kín 94

Hình 3.38 Ảnh hưởng đồng thời mức sử dụng (NaOH+Na2S) và nhiệt độ đến hiệu suất bột sunfat 95

Hình 3.39 Ảnh hưởng đồng thời mức sử dụng (NaOH+Na2S) và thời gian đến hiệu suất bột sunfat 95

Hình 3.40 Ảnh hưởng đồng thời của thời gian xử lý và nhiệt độ đến hiệu suất bột sunfat 96 Hình 3.41 Ảnh hưởng của TXL rơm rạ bằng (NaOH+Na2S) đến hiệu suất đường khử 96

Hình 3.42 Ảnh hưởng đồng thời của mức dùng (NaOH+Na2S) và nhiệt độ 97

Hình 3.43 Ảnh hưởng đồng thời của mức dùng (NaOH+Na2S) và thời gian 97

Hình 3.44 Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất đường khử 97

Hình 3.45 Tối ưu hóa hiệu suất đường khử sau TXL rơm rạ bằng (NaOH+Na2S) 99

Hình 3.46 Ảnh hưởng của TXL bằng (NaOH+Na2S) đến mức phân hủy cellulose 99

Hình 3.47 Phổ XRD của rơm rạ sau TXL theo phương pháp sunfat nấu kín 100

Hình 3.48 Ảnh hưởng của mức sử dụng kiềm hoạt tính đến mức độ phân hủy lignin 101

Hình 3.49 Ảnh hưởng của mức dùng kiềm hoạt tính đến sự tách loại các chất vô cơ 102

Hình 3.50 Ảnh SEM của bột sunfat rơm rạ 103

Hình 3.51 Thành phần hóa học của rơm rạ ban đầu và bột cellulose tẩy trắng từ rơm rạ 105 Hình 3.52 Ảnh hưởng của mức sử dụng enzyme đến hiệu suất đường hóa cellulose rơm rạ 106

Hình 3.53 Ảnh hưởng đồng thời của mức sử dụng enzyme−nồng độ bột xút tẩy trắng 108

Hình 3.54 Ảnh hưởng đồng thời của mức sử dụng enzyme − thời gian thủy phân 108

Hình 3.55 Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ bột xút tẩy trắng − thời gian thủy phân 108

x

Hình 3.56 Tối ưu hóa quá trình thủy phân bột xút tẩy trắng từ rơm rạ bằng enzyme 109

Hình 3.57 Ảnh hưởng đồng thời của mức dùng enzyme và nồng độ bột xút 111

Hình 3.58 Ảnh hưởng đồng thời của mức dùng enzyme và thời gian thủy phân 111

Hình 3.59 Ảnh hưởng đồng thời của thời gian thủy phân và nồng độ bột xút 112

Hình 3.60 Tối ưu hóa quá trình thủy phân bột xút rơm rạ bằng enzyme 112

Hình 3.61 Ảnh hưởng đồng thời của mức dùng enzyme và nồng độ bột sunfat 114

Hình 3.62 Ảnh hưởng đồng thời của thời gian và mức dùng enzyme 115

Hình 3.63 Ảnh hưởng đồng thời của mức dùng enzyme nồng độ bột sunfat 115

Hình 3.64 Tối ưu hóa thủy phân bột sunfat bằng hỗn hợp enzyme CTec2 và HTec2 116

Hình 3.65 Ảnh hưởng đồng thời của mức dùng enzyme và nồng độ bột rơm rạ sau TXL 118

Hình 3.66 Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ bột rơm rạ sau TXL và thời gian thủy phân 118

Hình 3.67 Ảnh hưởng đồng thời của thời gian thủy phân và mức dùng enzyme sau TXL 118

Hình 3.68 Tối ưu hóa thủy phân bột rơm rạ sau TXL bằng hỗn hợp enzyme 119

Hình 3.69 Sơ đồ chuyển hóa rơm rạ thành etanol 121

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Etanol là một trong những dung môi quan trọng, được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp chế biến (hóa học, thực phẩm, dược phẩm, .) Những năm gần đây, etanol còn được sử dụng làm nhiên liệu, bởi có khả năng pha trộn với xăng và được đánh giá là dạng nhiên liệu sinh học tiềm năng, thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đang có nguy

cơ cạn kiệt dần vào năm 2050 [25] Do được sản xuất từ nguồn nguyên liệu tái tạo (sinh khối thực vật), nên etanol sinh học có thể đáp ứng nhu cầu lâu dài và là nguồn năng lượng bền vững cho nhân loại, vốn đang có nhu cầu ngày càng cao [86]

Hiện nay, phần lớn etanol sinh học đang được sản xuất từ nguồn nguyên liệu chứa đường hoặc tinh bột, được gọi chung là nhiên liệu sinh học (NLSH) thế hệ I Mặc dù công nghệ sản xuất đã tương đối hoàn thiện, nhưng có những hạn chế nhất định, như nguồn nguyên liệu hạn chế và giá thành cao (chiếm đến 2/3 giá thành etanol) [40], hơn nữa sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột, như ngô, sắn hay một số loại ngũ cốc khác, ảnh hưởng đến lớn đến sản xuất lương thực, vì vậy hiện nay sản xuất NLSH thế hệ I bị đánh giá là kém bền vững, ít tính cạnh tranh trong tương lai [123] Trong khi đó, sản xuất etanol từ nguồn sinh khối lignocellulose có nhiều triển vọng và thực sự cần thiết, do nguồn nguyên liệu lignocellulose rất phong phú và tiềm năng hơn, được phân bố tương đối đồng đều trên khắp thế giới [52] Hơn nữa, nhiều dạng sinh khối lignocellulose có giá rẻ hơn và trong nhiều trường hợp việc tận dụng nguồn sinh khối lignocellulose là phế thải, phế phụ phẩm nông, lâm nghiệp hay rác thải sinh hoạt còn góp phần bảo vệ môi trường và phát triển bền vững Chính vì vậy, những năm gần đây nghiên cứu công nghệ sản xuất etanol từ sinh khối lignocellulose đã thu hút sự chú ý, đầu tư lớn của nhiều quốc gia trên thế giới, kể cả ở Việt Nam [17,160]

Công nghệ sản xuất etanol từ sinh khối lignocellulose (gỗ và phế phụ phẩm nông nghiệp) theo phương pháp thủy phân bằng axit, đã được áp dụng ở quy mô công nghiệp tại nhiều nước trên thế giới (chủ yếu tại các nước thuộc Liên Xô cũ, Mỹ và Đức) [117, 70] Tuy nhiên, đối với công nghệ sản xuất etanol (bioetanol) theo phương pháp thủy phân bằng enzyme, mặc dù nhưng năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu, với số lượng công bố tương đối lớn trong một thời gian ngắn, tuy nhiên công nghệ khả thi ở quy mô công nghiệp vẫn còn gặp rất nhiều những khó khăn Lý do chủ yếu nằm ở sự khác biệt về quá trình chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành etanol [73] Khác với đường và tinh bột, quá trình chuyển hóa sinh học của cellulose và hemicellulose, chứa trong thành phần của sinh khối lignocellulose, phức tạp hơn nhiều, bởi sinh khối lignocellulose là một tổ hợp bao gồm 3 thành phần chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin, liên kết chặt chẽ với nhau trong vách tế bào thực vật [99] Cấu trúc đặc thù của sinh khối lignocellulose như vậy, không những hạn chế sự tiếp cận của enzyme đối với phản ứng thủy phân hemicellulose và cellulose thành các monosaccarit, mà còn cản trở quá trình chuyển hóa nói chung Vì vậy,

ở trạng thái bình thường, quá trình thủy phân sinh khối lignicellulose bằng enzyme hoặc là không thực hiện được, hoặc là diễn ra rất chậm, không hiệu quả [73]

2

Để thúc đẩy quá trình chuyển hóa sinh học sinh khối lignocellulose thành etanol, có hai cách tiếp cận vấn đề: hoặc là tách các “tạp chất” khác của sinh khối (như lignin, các chất trích ly, các chất vô cơ) ra khỏi phần carbohydrate, hoặc phải biến đổi sinh khối thành dạng phù hợp cho quá trình thủy phân bằng enzyme [28] Đến nay, công đoạn này có tên gọi là “tiền xử lý” (TXL), được xem là “chìa khóa” của công nghệ chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành etanol [156] Một số phương pháp biến tính sinh khối lignocellulose cho sản xuất etanol sinh học đã được nghiên cứu, nhưng hiệu quả kinh tế không cao và không khả thi ở quy mô công nghiệp Kỹ thuật tách loại lignin, được áp dụng từ lâu ở quy

mô công nghiệp để sản xuất vật liệu xơ sợi (như bột giấy, cellulose tan, ), cho phép tách loại lignin và các thành phần khác của sinh khối lignocellulose tương đối triệt để tới mức cần thiết, nhưng thường kéo theo sự phân hủy một phần carbohydrate, làm giảm hiệu suất đường thu được so với nguyên liệu ban đầu Hơn nữa, không tồn tại một quy trình công nghệ chung đối với tất cả các loại nguyên liệu Do vậy, tùy thuộc vào sinh khối lignocellulose sử dụng mà tiến hành nghiên cứu và áp dụng kỹ thuật xử lý thích hợp, nhằm nâng cao hiệu quả chuyển hóa sinh học carbohydrate cả về phương diện hóa học, lẫn mục tiêu thu được đường có khả năng lên men cao nhất có thể [32,86]

Trong số các nguồn sinh khối lignocellulose đa dạng thì nguồn sinh khối rơm rạ tương đối dồi dào Về tầm quan trọng, lúa là cây lương thực quan trọng thứ 3 sau lúa mỳ

và ngô Theo số liệu của FAO, sản lượng lúa trên thế giới năm 2014 đạt khoảng 751 triệu tấn, tương đương với khoảng 500,8 triệu tấn gạo Theo tính toán, với các giống lúa được canh tác hiện nay, có khoảng 1–1,5 tấn rơm rạ tạo thành trên 1 tấn lúa thu được Như vậy lượng rơm rạ hàng năm trên thế giới có thể đạt 751–1126,6 triệu tấn Trong số đó, chỉ phần nhỏ được thu gom và tận dụng, phần còn lại là thải bỏ và đốt bỏ, gây lãng phí và nhiều vấn đề môi trường nghiêm trọng [15,16, 92, 96]

Việt Nam là nước nông nghiệp có sản lượng lúa lớn Theo Tổng cục thống kê [14] năm 2013 diện tích lúa của cả nước là 7,9 triệu hecta, với sản lượng đạt khoảng 44,07 triệu tấn lúa Như vậy ước tính có khoảng 61 triệu tấn rơm rạ tạo thành [96] Thực tế cho thấy, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi Phương thức xử lý phổ biến nhất là đốt như hiện nay, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sinh hoạt và đời sống của

cư dân cả khu vực nông thôn lẫn đô thị Cho đến nay, việc đốt bỏ rơm rạ vẫn tiếp tục diễn

ra trên phạm vi rộng mà chưa có biện pháp giải quyết hiệu quả, gây nên những nỗi lo ngại lớn về môi trường, an sinh xã hội [6]

Khác với gỗ, rơm rạ là dạng sinh khối lignocellulose có thành phần hóa học đặc trưng của cây thân thảo ngắn ngày Về nguyên tắc, các hợp chất cao phân tử của chúng, như cellulose, hemicellulose và lingin, dễ phân hủy sinh-hóa học hơn so với các thành phần tương tự của gỗ [26], tuy nhiên rơm rạ lại có thành phần hóa học không ổn định, tùy thuộc vào giống lúa, thời vụ, phương pháp thu gom và bảo quản, đặc biệt có hàm lượng các chất vô cơ tương đối cao (có thể chiếm trên 12%), là yếu tố gây khó khăn cho quá trình chế biến sinh-hóa học Vì vậy để nâng cao hiệu quả chuyển hóa rơm rạ thành etanol sinh

học, cần có những nghiên cứu sâu và hệ thống Do đó, tác giả đã chọn đề tài: “Nghiên cứu

tiền xử lý rơm rạ để nâng cao hiệu quả thủy phân bằng enzyme cho sản xuất etanol sinh học” để góp phần giải quyết những vấn đề đã nêu ở trên

3

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

Mục tiêu của đề tài

- Góp phần bổ sung cơ sở lý luận trong công nghệ sản xuất etanol sinh học từ nguồn sinh khối lignocellulose, làm cơ sở xây dựng và áp dụng các quy trình công nghệ sản xuất etanol sinh học từ rơm rạ ở Việt Nam

- Xác lập được các chế độ công nghệ thích hợp TXL rơm rạ bằng axit hữu cơ và kiềm mạnh, nhằm nâng cao hiệu quả thủy phân bằng enzyme để thu đường có khả năng lên men thành etanol

- Xác định và làm sáng tỏ sự biến đổi của các thành phần hóa học cơ bản của rơm rạ trong quá trình TXL

- Đề xuất quy trình hiệu quả cao sản xuất etanol sinh học từ rơm rạ và khả thi ở quy

mô công nghiệp

Các nội dung nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu đặc điểm cấu tạo và một số tính chất lý − hóa học của rơm rạ một số giống lúa phổ biến ở Việt Nam;

Nghiên cứu TXL rơm rạ bằng axit axetic có bổ sung axit clohydric và kiềm cho quá trình đường hóa bằng enzyme;

Nghiên cứu tối ưu hóa thủy phân cellulose và hemicellulose bằng hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic®

CTec2, Cellic® HTec2; Thử nghiệm lên men etanol

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả của Luận án là cơ sở khoa học, là tiền đề cho các nghiên cứu xây dựng và áp dụng công nghệ phù hợp để chuyển hóa nguồn nguyên liệu sinh khối lignocellulose rơm rạ

là phế phụ phẩm nông nghiệp thành etanol sinh học, đồng thời là tài liệu tham khảo bổ sung vào cơ sở dữ liệu về tính chất của sinh khối lignocellulose của Việt Nam

Những đóng góp mới của Luận án

Về công nghệ: Đây công trình đầu tiên ở Việt Nam, nghiên cứu sâu và hệ thống về công nghệ TXL rơm rạ bằng axit axetic có bổ sung axit clohydric và hydroxit natri, hydroxit natri có bổ sung chất trợ tách loại lignin, kết hợp đường hóa bằng enzyme hoạt lực cao, làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình công nghệ khả thi sản xuất etanol sinh học

Về cơ sở lý luận: Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và thành phần hóa học chính của rơm rạ một số giống lúa năng suất cao phổ biến ở Việt Nam, sự phân hủy và biến đổi cấu trúc của chúng trong quá trình chuyển hóa thành etanol sinh học

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ETANOL SINH HỌC 1.1.Tổng quan về nhiên liệu sinh học

1.1.1 Khái niệm và phân loại

Nhiên liệu sinh học (Biofuels − NLSH) là loại nhiên liệu được hình thành từ các hợp chất có nguồn gốc sinh học (từ động, thực vật) như nhiên liệu chế xuất từ chất béo của động thực vật (mỡ động vật, dầu dừa ), ngũ cốc (sắn, lúa mỳ, ngô, đậu tương ), rỉ đường (đường mía, củ cải đường…), chất thải trong nông nghiệp (rơm rạ, trấu, phân gia súc ), phế thải trong công nghiệp (mùn cưa, vỏ bào, sản phẩm gỗ thải ), [25]

NLSH có nhiều ưu điểm so với các loại nhiên liệu truyền thống như phân bố đều trên

bề mặt trái đất, thân thiện với môi trường và là nguồn nhiên liệu tái tạo (giúp giảm sự lệ thuộc vào nguồn nhiên liệu không tái tạo, góp phần làm giảm khí gây hiệu ứng nhà kính) [40]

NLSH có thể được phân loại thành 03 nhóm chính tùy theo trạng thái phân tử của nhiên liệu như sau [40]:

 Khí sinh học (Biogas): Khí sinh học là hỗn hợp khí methane (CH4) và một số khí khác sinh ra từ sự phân huỷ các chất hữu cơ trong môi trường yếm khí, xúc tác nhờ nhiệt

độ 20-40ºC Thành phần chính của biogas là CH4 (50-60%) và CO2 (>30%) còn lại là các chất khác như hơi nước N2, O2, H2S, CO, … do đó khó có thể sử dụng biogas làm nhiên liệu cho động cơ đốt trong Để sử dụng biogas làm nhiên liệu thì phải xử lý biogas trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất và tạo nên hỗn hợp nổ với không khí Khí H2S có thể ăn mòn các chi tiết trong động cơ, sản phẩm của nó là SOx cũng là một khí rất độc Hơi nước

có hàm lượng nhỏ nhưng ảnh hưởng đáng kể đến nhiệt độ ngọn lửa, giới hạn cháy, nhiệt trị thấp và tỷ lệ không khí/nhiên liệu của biogas Biogas có thể dùng làm nhiên liệu khí thay cho sản phẩm khí gas từ dầu mỏ

 Nhiên liệu lỏng: bao gồm biometanol, bioetanol, biobutanol, biodiesel… Trong số này, bioetanol là loại nhiên liệu thông dụng nhất hiện nay trên thế giới vì có khả năng sản xuất ở quy mô công nghiệp từ nguyên liệu chứa đường như mía, củ cải đường và nguyên liệu chứa tinh bột như ngũ cốc, khoai tây, sắn…, và hiện nay xu hướng đang chuyển dần sang sản xuất etanol từ nguyên liệu lignocellulose Diesel sinh học (biodiesel) là một loại nhiên liệu có tính chất tương đương với nhiên liệu dầu diesel được sản xuất từ dầu thực vật hay mỡ động vật bằng phản ứng este hóa (transesterification) [57,82]

 Nhiên liệu rắn: Một số loại NLSH rắn mà các nước đang phát triển sử dụng hàng ngày trong công việc nấu nướng hay sưởi ấm là gỗ, và các loại phân gia súc khô

1.1.2 Công nghệ sản xuất etanol sinh học

1.1.2.1 Công nghệ sản xuất etanol sinh học thế hệ I

Sản xuất etanol sinh học thế hệ I sử dụng enzyme để thủy phân đường từ mía, củ cải đường hoặc tinh bột từ ngũ cốc thành đường glucose và sau đó lên men đường thành etanol Etanol sau đó được chưng cất đến 96% và tinh cất để sử dụng làm nhiên liệu

5

Sản xuất diesel sinh học thế hệ I dựa trên nguyên lý thay thế glyxerin trong dầu mỡ béo bằng các nhóm metyl (từ metanol) hoặc ankyl mạch ngắn khác (từ các alcol khác) Tùy theo nguyên liệu, diesel sinh học thế hệ I được chia ra thành 3 loại như: RME: Metyl este của cây cải dầu (Brassica napus); SME: Metyl este của dầu cây đậu nành hay dầu cây hướng dương; PME: Metyl este của dầu dừa hay dầu hạt cau Bên cạnh đó còn có metyl este từ mỡ động vật như mỡ cá basa

1.1.2.2 Công nghệ sản xuất etanol sinh học thế hệ II

Sản xuất etanol sinh học thế hệ II sử dụng sinh khối lignocellulose thường dựa vào

ba phương pháp chính là: thủy phân sinh khối bằng enzyme, hóa lỏng hoặc khí hóa

Quá trình thủy phân sinh học sinh khối bằng enzyme thường gồm hai công đoạn chính là tách lignin từ sinh khối và tạo đường đơn từ phần carbohydrate sau đó thông qua quá trình lên men chuyển hóa đường thành cồn sinh học (hình 1.1) [18] Quá trình hóa lỏng sinh khối tạo dầu sinh học (bio-oil) tiếp theo là chuyển hóa bằng xúc tác, dehydro hóa-oxy hóa tạo nhiên liệu lỏng Quá trình khí hóa sinh khối tạo khí tổng hợp và qua tổng hợp Fischer-Tropsch tạo nhiên liệu: ankan, xăng và diesel [100]

Hình 1.1 Sản xuất etanol sinh học từ sinh khối lignocellulose Sản xuất diesel sinh học thế hệ II dựa trên nguồn nguyên liệu sinh khối, qua nghiền sấy rồi nhiệt phân và tổng hợp hóa học thành NLSH Diesel sinh học thế hệ II cũng có thể được sản xuất từ dầu thực vật không ăn được, dầu phế thải…

1.1.2.3 Công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ III

NLSH được chế tạo từ các loài vi tảo trong nước, trên đất ẩm, sinh ra nhiều năng lượng (7-30 lần) hơn NLSH thế hệ I, II trên cùng diện tích trồng Tuy nhiên, việc nghiên cứu chế tạo NLSH thế hệ III vẫn đang ở giai đoạn nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm

và pilot [83]

1.1.3 Tình hình sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học trong và ngoài

nước

1.1.3.1 Tình hình sản xuất và sử dụng NLSH trên thế giới

Hiện nay có khoảng 50 nước trên thế giới khai thác và sử dụng NLSH ở các mức độ khác nhau [15] Nhiên liệu sinh học được dùng làm nhiên liệu cho ngành giao thông bao

6

gồm: dầu thực vật sạch, etanol, diesel sinh học, dimetyl ether (DME), ethyl tertiary butyl ether (ETBE) và các sản phẩm từ chúng Năm 2013, toàn thế giới đã sản xuất 60,5 tỷ lít etanol nhiên liệu [16], dự kiến năm 2015 là 115 tỷ lít; năm 2005 sản xuất 4 triệu tấn diesel sinh học (B100), năm 2011 tăng lên khoảng 25 triệu lít (hình 1.2) [57]

Hình 1.2 Sản lượng nhiên liệu sinh học trên thế giới

Mỹ sản xuất NLSH chủ yếu từ ngô, hạt cao lương và thân cây cao lương ngọt, và củ cải đường Khoảng 17% sản lượng ngô sản xuất hàng năm ở Hoa Kỳ dùng để sản xuất etanol Hoa Kỳ đặt chỉ tiêu sản xuất cồn sinh học để cung cấp 46% nhiên liệu cho xe hơi năm 2010, 100% vào năm 2020 [21]

Đức là một nước tiêu thụ xăng sinh học nhiều nhất trong khối EU, trong đó có khoảng 0,48 triệu lít etanol Nguyên liệu chính sản xuất etanol là củ cải đường.Pháp là nước thứ hai tiêu thụ nhiều etanol sinh học trong cộng đồng Châu Âu với khoảng 1,07 triệu lít etanol và diesel sinh học năm 2006 Công ty Diester sản xuất diesel sinh học và Téréos sản xuất etanol sinh học là hai công ty lớn của Pháp

1.1.3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng NLSH ở trong nước

Để đảm bảo an ninh năng lượng, bảo vệ môi trường và thúc đẩy phát triển kinh tế

nông thôn tại các vùng sâu, vùng xa, ngày 20-11-2007, Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt

“Đề án phát triển NLSH đến năm 2015, tầm nhìn 2025” Đề án bao gồm hoạt động của các

cơ quan chính phủ và doanh nghiệp nhằm xây dựng lộ trình sử dụng NLSH của Việt Nam, khung pháp lý, các chính sách khuyến khích sản xuất, xây dựng mô hình thử nghiệm sản xuất và phân phối NLSH cũng như các dự án đầu tư của Chính phủ để phát triển NLSH đến năm 2025.Việt Nam sẽ đẩy mạnh phát triển NLSH và mục tiêu dự kiến đến năm 2025

sẽ sản xuất và đưa vào sử dụng xăng E5 và dầu B5 trên phạm vi cả nước, đáp ứng đủ nhu cầu thị trường.Đẩy mạnh phát triển NLSH là giải pháp thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống hiện nay, góp phần đảm bảo an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường.Nhóm nghiên cứu của PGS Doãn Thái Hòa, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nghiên cứu áp dụng cộng nghệ hiện đại để sản xuất 100 lít etanol sinh học thế hệ II từ phế liệu gỗ keo, gỗ bạch đàn năm 2010 [1] Nhóm nghiên cứu của PGS Tô Kim Anh đã nghiên cứu tạo enzyme tái tổ hợp thủy phân lignocelluloses phục vụ sản xuất cồn nhiên liệu [11] Nhóm của PGS Vũ Nguyên Thành đã nghiên cứu công nghệ và hệ thống thiết bị

từ nguồn rơm rạ Việt Nam bằng phương pháp nhiệt phân có và không có xúc tác [2,42] Việt Nam bắt đầu sản xuất NLSH từ khoảng 20 năm trước đây Tuy nhiên cho đến nay Việt Nam có ít kinh nghiệm trong nghiên cứu, sản xuất thử nghiệm và sản xuất thương mại NLSH Việc triển khai sản xuất vẫn còn rất xa mới đạt đến hiệu quả kinh tế và tiềm năng thực Về nguồn cầu, NLSH chưa được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam Mạng lưới phân phối và bán hàng vẫn chưa phát triển rộng rãi Việc sản xuất NLSH thí điểm và thương mại đã không ngừng gia tăng trong 5 năm qua trong đó năm 2009 được xem là năm khởi động cho ngành NLSH tại Việt Nam Trong năm 2009, nhiều nhà máy sản xuất etanol sinh học đã được xây dựng tại các tỉnh Quảng Nam, Phú Thọ, Quảng Ngãi (Dung Quất), Bình Phước và Đồng Nai từ sắn (NLSH thế hệ I) Đầu tư được tích luỹ từ các nhà máy nội địa bao gồm cả Petrovietnam

Hiện nay, một số dự án về NLSH ở Việt Nam chưa đạt tiến độ theo yêu cầu, nhưng những nghiên cứu về NLSH tiếp tục diễn ra quy mô trên khắp thế giới và thiên về xu hướng nghiên cứu tính khả thi và quy mô ứng dụng chuyển hóa các loại sinh khối thành nhiên liệu chứng tỏ tương lai đầy tiềm năng của công nghệ này Rõ ràng, chuyển hóa rơm

rạ nói chung thành etanol sinh học không chỉ giải quyết triệt để hơn vấn đề năng lượng, không ảnh hưởng đến lương thực mà còn giải quyết nhiều vấn đề môi trường, xã hội Dự báo trong tương lai không xa, sản xuất cồn từ rơm rạ và sinh khối nói chung sẽ thực sự được triển khai và thương mại hóa trên quy mô rộng [1,13]

1.2 Sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulose

1.2.1 Khái niệm sinh khối

Sinh khối (biomass) là thuật ngữ dùng để mô tả các vật liệu hữu cơ có nguồn gốc từ thực vật, cây cối hoa màu và các dạng vật liệu tương tự có khả năng thu thập và lưu trữ năng lượng mặt trời thông qua quá trình quang hợp Năng lượng sinh khối (bioenergy) là năng lượng thu được thông qua quá trình chuyển hóa sinh khối thành các dạng năng lượng

có ích khác như: nhiệt năng, điện năng, nhiên liệu lỏng (nhiên liệu sinh học) [110, 25] Lượng sinh khối lignocellulose hằng năm được tổng hợp khoảng 1010

đến 1011 tấn nhờ quá trình quang hợp, quy đổi ra năng lượng thì gấp 6 lần nhu cầu năng lượng trên toàn thế giới, tuy nhiên để có thể chuyển hóa sinh khối thành năng lượng là cả một vấn đề lớn, lâu dài Vì năng lượng sản xuất từ sinh khối có tuy có nhiều ưu điểm như: phân bố rộng rãi, có khả năng tái tạo, có thể dự trữ và chuyển đổi dễ dàng, không gây ô nhiễm môi trường nhưng lại có một số nhược điểm như sử dụng diện tích đất canh tác lớn, yêu cầu chi

8

phí cho bón phân, tưới nước, thay đổi chất lượng theo điều kiện ngoại cảnh bên ngoài, chính vì vậy nên sản xuất năng lượng từ sinh khối hiện nay vẫn chưa hoàn toàn thay thế được cho năng lượng hóa thạch [110, 25]

1.2.2 Công nghệ tiền xử lý sinh khối lignocellulose cho sản xuất nhiên liệu

1.2.2.1 Thành phần hóa học của tế bào gỗ

Sinh khối thực vật được cấu tạo từ những tế bào thực vật có hình dạng và kích thước khác nhau, nhưng đều gồm các thành phần chính là: màng sinh chất bao bọc bên ngoài tế bào, vách tế bào thực vật, tế bào chất bao gồm các cơ quan bên trong như thể Golgi, ty thể, lục lạp, sắc lạp, vô sắc lạp (bột lạp, đạm lạp, du lạp) , nhân tế bào và không bào Kết thúc chu kỳ sống, các thể này đều tiêu biến chỉ còn lại vách tế bào thực vật [8]

Vách tế bào thực vật có cấu tạo hóa học chủ yếu là tổ hợp lignocellulose Lignocellulose gồm có ba thành phần chính là cellulose, hemicellulose và lignin Sự tổ hợp với các tỷ lệ khác nhau của ba thành phần này tạo nên vách tế bào thực vật khác nhau của các loại thực vật khác nhau và tạo nên sự phong phú, đa dạng của các loài thực vật ngày nay (hình 1.3) [17]

Hình 1.3 Cấu tạo vách tế bào thực vật

Cellulose

Cellulose là một polysaccarit đồng thể mạch thẳng, đại phân tử của nó được cấu tạo bởi các gốc β-D-glucose, liên kết với nhau bằng các liên kết glucozit 1-4 Cellulose là polyme mạch thẳng, chuỗi đại phân tử của nó có cấu tạo điều hòa và tất cả các nguyên tử cacbon không đối xứng nhau theo một cấu hình chặt chẽ nhất định Đơn vị lập thể lặp lại trong chuỗi cellulose là gốc cellobiose (D-glucopyranosyl-β-1,4-D-glucopyranose) (hình 1.4) [49]

Cellulose là polyme phổ biến nhất trong tự nhiên chiếm khoảng 90% trong sợi bông

tự nhiên, 40–50% khối lượng sinh khối gỗ, 40−50% trong bã mía và khoảng 35−40% trong rơm lúa mỳ và lúa gạo [26]

9

Hình 1.4 Cấu tạo phân tử cellulose Công thức (thực nghiệm) chung của cellulose có thể viết dưới dạng (C6H10O5)n hoặc [C6H7O2(OH)3]n Bậc trùng hợp n của cellulose trong gỗ vào khoảng 5000 đến 10000, đối với cây thân thảo thì mức độ trùng hợp thấp hơn Ở trạng thái tự nhiên cellulose liên kết với nhau thành chuỗi vi sợi dài, nhiều vi sợi liên kết với nhau tạo thành sợi, nhiều sợi liên kết với nhau tạo thành bó sợi Bó sợi cellulose có cấu trúc bao gồm vùng kết tinh xen kẽ với vùng vô định hình một cách đều đặn Vùng kết tinh là vùng có trật tự cấu trúc cao cùng với mạng lưới liên kết hydro bao xung quanh ngăn cản sự xâm nhập của các tác nhân khác nhau Ngoài ra, tương tác giữa các sợi cellulose còn được giữ bởi lực Van der Waals ở khoảng cách lớn hơn so với liên kết hydro [26,90] Sự thay đổi cấu trúc và độ kết tinh của các loại cellulose dước tác dụng của các tác nhân hóa học khác nhau hay tác nhân nhiệt độ

là khác nhau Đây cũng là một trong những trở ngại đối với việc kiểm soát tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme

Ở vùng cellulose tinh thể, enzyme cellulase chỉ có thể được hấp phụ lên bề mặt xơ sợi và tách dần chúng ra Ngược lại, vùng vô định hình có trật tự cấu trúc thấp hơn, khoảng cách giữa các vi sợi cũng lớn, các liên kết hydro cũng yếu hơn nên enzyme dễ dàng thấm sâu và cắt đứt chuỗi cellulose ở những vị trí bất kỳ, làm mạch cellulose bị cắt ngắn nhanh chóng, tạo ra các đầu khử mới Tuy vậy, quá trình thủy phân cellulose trong sinh khối chỉ đạt được kết quả tốt khi đã loại bỏ phần lớn các thành phần như lignin, các chất trích ly, tro, pectin ra khỏi vách tế bào

Cellulose là một vật liệu có tính hút ẩm, nó có thể hấp thụ 8-14% nước trong điều kiện bình thường (20°C, 60% độ ẩm tương đối) [26] Tuy nhiên, cellulose không bị hòa tan trong nước, khi tương tác với nước cellulose hấp thụ một phần và bị trương nở Cellulose cũng không hòa tan trong dung dịch axit loãng ở nhiệt độ thấp Khả năng hòa tan của cellulose liên quan chặt chẽ đến mức độ phân hủy của sinh khối sau quá trình TXL Ở nhiệt

độ cao, cellulose dễ bị hòa tan, nếu như cung cấp đủ năng lượng để phá vỡ các liên kết hydro tham gia vào cấu trúc tinh thể Cellulose cũng hòa tan trong axit đặc, nhưng khi đó cấu trúc của nó bị phân hủy nghiêm trọng do thủy phân thiếu nước gây ra Trong các phương pháp TXL bằng kiềm, sự phân giải của cellulose diễn ra bắt đầu ở các phân tử có khối lượng thấp của chuỗi polyme (DP <200) [26] Dung môi của cellulose thường là các

hệ dung môi phức đồng hoặc cadmi, như hydroxide (cuen) cupriethylenediamine hoặc Cadoxen cadmium Ngoài ra, các dung môi như dung dịch muối, chẳng hạn như clorua

Xylan chiếm phần lớn khối lượng hemicellulose và có cấu trúc đa dạng Khối lượng phân tử tùy thuộc theo đặc điểm của các loài thực vật và vị trí nó ở các mô tế bào thực vật Tất cả các xylan đều có mạch chính do các xylose (C5H10O5)nối với nhau bởi liên kết β-1,4-glycoside [49] Trong quá trình xử lý sinh khối thì giữ lại được phần lớn xylan trong sinh khối cho thủy phân sẽ góp phần nâng cao hiệu suất đường cuối của quá trình thủy phân

Lignin

Lignin là hợp chất cao phân tử có cấu trúc mạng không gian và không có cấu tạo hóa học nhất định Cùng với cellulose, lignin là một trong những hợp chất polyme có nguồn gốc sinh học phổ biến nhất trong tự nhiên, hàm lượng lignin chiếm khoảng 20 ÷30% trong vách tế bào thực vật [49]

Lignin có cấu tạo rất phức tạp Các đơn vị cơ sở tạo nên “bộ khung” của lignin là các đơn vị phenylpropan (hình 1.5) [26] Các mắt xích này liên kết với nhau tạo thành cấu trúc không gian 3 chiều Lignin của các loài thân thảo chứa nhiều đơn vị hydroxyphenylpropan (III) hơn so với gỗ [31]

Lignin có liên kết hóa trị với hemicellulose, nhưng không có liên kết trực tiếp với cellulose [31,44] Lignin có đặc tính là polyphenol nên có tính kỵ nước và sát khuẩn, là thành phần gây cản trở quá trình thủy phân bằng enzyme nên cần phải loại bỏ Tách loại lignin bằng các tác nhân hóa học khác nhau thường dẫn đến phân hủy một phần carbohydrate Chính vì vậy, công nghệ TXL hiệu quả sinh khối là công nghệ tách loại lignin một cách có chọn lọc mà không làm ảnh hưởng nhiều đến carbohydrate

Guaiacylpropan (I) Syrygylpropan (II) Hydroxyphenylpropan (III)

Hình 1.5 Các đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin

11

1.2.2.2 Công nghệ tiền xử lý sinh khối lignocellulose

Đặc tính đa dạng của các nguyên liệu sinh khối là trở ngại để đưa ra quy trình TXL chung Chính vì vậy, đối với mỗi loại sinh khối người ta đưa ra cách xử lý đặc thù, hiệu quả cho sinh khối đó Công nghệ TXL hiệu quả thường kết hợp hai hay nhiều công đoạn

xử lý khác nhau nhằm thu hồi toàn bộ sinh khối Các tác nhân TXL được biết đến rộng rãi như:

a Tiền xử lý bằng phương pháp vật lý

− Nghiền nhỏ bằng phương pháp cơ học:

Mục đích của TXL cơ học là làm giảm kích thước và mức độ kết tinh của lignocellulose, nhằm tăng diện tích bề mặt và giảm mức độ trùng hợp Việc nghiền nhỏ này có thể được thực hiện bằng sự kết hợp cắt nhỏ, nghiền hoặc xay phụ thuộc vào kích thước cần đạt được của sinh khối (10–30 mm sau khi cắt và 0,2–2 mm sau khi nghiền hoặc xay) [141] Các quy trình xay nghiền khác nhau (nghiền bi, nghiền hai trục và nghiền rung bằng năng lượng vibrio) có thể được sử dụng để cải thiện quá trình thủy phân bằng enzyme nhờ tăng diện tích bề mặt tiếp xúc [137] Tiêu tốn năng lượng của phương pháp TXL này rất cao phụ thuộc vào kích thước hạt cuối cùng và các đặc điểm của sinh khối ban đầu Cùng với sự gia tăng liên tục giá năng lượng thì phương pháp TXL này không có hiệu quả kinh tế [138]

và kích thước của xơ sợi, kết quả là tăng khả năng xâm nhập vào carbohydrate của enzyme [139] Nhược điểm của phương pháp này là tiêu tốn năng lượng và chỉ tách loại được một lượng nhỏ lignin, hemicellulose

b Tiền xử lý bằng phương pháp hóa học

− Các phương pháp TXL sinh khối bằng kiềm

Tác động của một số bazơ lên sinh khối lignocellulose là cơ sở của các phương pháp TXL bằng kiềm Đây là phương pháp TXL hiệu quả phụ thuộc vào hàm lượng lignin của sinh khối Các phương pháp TXL bằng kiềm làm tăng khả năng thủy phân của cellulose và tách loại lignin tốt hơn, ít hòa tan cellulose và hemicellulose hơn so với các quy trình axit hay thủy nhiệt [68] TXL bằng kiềm có thể được tiến hành ở nhiệt độ phòng, trong thời gian từ nhiều giây đến nhiều ngày Được mô tả là ít phân hủy đường hơn so với TXL bằng axit, TXL sinh khối bằng kiềm đạt được hiệu quả cao hơn khi xử lý các phế phẩm nông nghiệp so với các nguyên liệu gỗ [68] Tuy nhiên, cần phải cân nhắc đến khả năng mất mát các loại đường có khả năng lên men và sự tạo thành các hợp chất ức chế để tối ưu hóa các điều kiện TXL Natri, kali, canxi và amoni hydroxit là các tác nhân TXL thường được sử dụng NaOH làm trương nở, gia tăng diện tích bề mặt của cellulose và giảm mức độ trùng

12

hợp và mức độ kết tinh, phá vỡ cấu trúc và hòa tan lignin [137] NaOH đã được công bố làm gia tăng khả năng phân giải của gỗ cứng từ 14% lên 55% bằng cách giảm hàm lượng lignin từ 24-55% xuống còn 20% [66] Tương tự như NaOH, TXL bằng Ca(OH)2, cũng đã được nghiên cứu rộng rãi TXL bằng vôi loại bỏ các chất vô định hình như lignin, các nhóm acetyl từ hemicellulose, tăng cường khả năng phân giải của cellulose [6] TXL bằng vôi cũng được khẳng định hiệu quả đối với thân cây ngô hay gỗ bạch dương ở nhiệt độ từ 85–150°C và trong khoảng 3–13h [28] TXL bằng Ca(OH)2 có chi phí thấp và yêu cầu về

an toàn ít hơn so với TXL bằng NaOH hay KOH và có thể thu hồi dễ dàng từ dịch thủy phân bằng phản ứng với CO2 [161]

Ngoài ra, TXL sinh khối bằng kiềm kết hợp với tác nhân oxi hóa như H2O2, oxi, ozon… cũng làm tăng hiệu quả thủy phân sinh khối nhờ thúc đẩy quá trình tách loại lignin một cách có chọn lọc TXL rơm lúa mạch bằng peroxit−kiềm kết hợp với quá trình đường hóa và lên men đồng thời (SSF) đã thu được 0,33 g etanol/ g rơm lúa mạch [142] Ngoài

ra, cũng không phát hiện furfural hay HMF trong dịch thủy phân TXL bằng kiềm bổ sung xúc tác được xem là phương pháp đạt được hiệu quả cao trong nghiên cứu chuyển hóa sinh khối thành nhiên liệu [99]

Công nghệ TXL sinh khối bằng kiềm có mục đích chủ yếu là tách loại lignin, một thành phần rất nhạy cảm với các tác nhân hóa học và sự thay đổi của nó kéo theo sự thay đổi của rất nhiều những thành phần còn lại trong sinh khối như: cellulose, hemicellulose…và ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân phần bã sinh khối còn lại bằng enzyme

Tương tác của lignin với tác nhân kiềm (xút và sunfat)

Dưới tác dụng của kiềm trong điều kiện thích hợp xảy ra các phản ứng tạo lignin−kiềm, thủy phân, chia nhỏ lignin và hòa tan các phần tử lignin nhỏ, các dẫn xuất của lignin vào dịch nấu [26]

Các phản ứng của lignin với tác nhân xút: phân hủy liên kết ete ở nhóm metoxy, phản ứng của liên kết ete ở Cα {phản ứng ở cấu trúc mạch thẳng (phản ứng a) hoặc cấu trúc mạch vòng (phản ứng b)}, phản ứng của liên kết ete ở Cβ (phản ứng phân hủy liên kết ete β−aryl ở cấu trúc phenol thế, phản ứng phân hủy liên kết ete β−aryl ở cấu trúc phenol tự do) và các phản ứng ngưng tụ lignin

Phản ứng của cấu trúc ete tại vị trí Cα:

OOCH 3

-OR C

C OR'' R' H H

H

OOCH 3

-C OH H

C OR'' R' H

OOCH 3

-C H

C OR' H

(a)

(b)

13

Khi hidro linh động của nhóm OH phenol bị thế (cấu trúc phenol bị ete hóa) thì liên kết ete của Cα bền trong môi trường kiềm, liên kết này chỉ bị phân hủy khi còn nhóm OH phenol tự do (không bị ete hóa)

Phản ứng với cấu trúc mạch vòng phenyl coumaran:

R' C H

O OCH 3

H H

-P, t o 2 OH OCH3+ CH2O

OH

CH2 OCH3

OH OCH3

Phản ứng của cấu trúc ete tại vị trí Cβ: Liên kết ete tại vị trí Cβ chiếm tỷ lệ lớn trong các liên kết của phân tử lignin và là liên kết khá bền trong môi trường kiềm, chỉ bị phân

14

hủy ở nhiệt độ tương đối cao Phá hủy liên kết ete tại vị trí Cβ là phản ứng mong muốn trong quá trình tách loại lignin cho thủy phân sinh khối Có hai trường hợp xảy ra khi phân hủy liên kết ete tại vị trí Cβ là khi còn hidro linh động của nhóm OH phenol tự do và khi H của OH phenol đã bị thế

Phản ứng phân hủy liên kết ete β−aryl ở cấu trúc phenol thế: Khác với trường hợp cấu trúc ete ở vị trí Cα, liên kết ete ở vị trí Cβ là liên kết kém bền nên vẫn bị phân hủy ngay

cả khi OH phenol đã bị thế, phản ứng xảy ra mạnh khi tại vị trí Cα và Cγ vẫn còn nhóm OH linh động

Ar H

O OCH3

CH O C

R' Ar

- Ar

O OCH3

CH OCH R'

O OCH3

-HC +

C OH H

CH2

OOCH3

Phản ứng phân hủy liên kết ete β−aryl ở cấu trúc phenol tự do: Khi R‟là nhóm

CH2OH, phản ứng chủ yếu xảy ra theo hướng tách loại metylol ở vị trí Cγ (không tạo thành epoxy trung gian) (phản ứng c)

CH2

OOCH3

-CHO

(c)

Tương tác của lignin với tác nhân sunfat: khác với tác nhân xút (OH−) lignin trong trường hợp này vừa phản ứng với OH− vừa phản ứng với SH− Vì vậy, ngoài những phản ứng như trong trường hợp nấu xút, lignin còn tham gia phản ứng với ion SH− có đặc tính nucleophil mạnh hơn OH− rất nhiều Sự có mặt đồng thời của cả hai ion OH− và SH− sẽ

và metyl mercaptan (a) Sản phẩm có thể tiếp tục bị biến đổi thành dạng (b)

CH

OOCH3

xơ sợi)

Tùy vào điều kiện nấu mà sản phẩm vẫn tiếp tục có khả năng ngưng tụ như phản ứng dưới đây :

S CH CH S R''

OCH3OHPhản ứng cắt vòng epoxy: hợp chất dạng vòng epoxy khó hòa tan trong nước, nhưng khi tác dụng với với ion SH− tạo thành sản phẩm mở vòng, dễ hòa tan trong nước

C

OCH3

O

-C R'

O H H

H H

Xu hướng ngược với phản ứng phân hủy, hòa tan lignin là phản ứng ngưng tụ lignin trong điều kiện nấu Phản ứng này xảy ra mạnh vào cuối quá trình nấu, khi đó quá trình tách loại lượng lignin rất khó khăn (khó bị hòa tan) trong khi phản ứng các phản ứng bào mòn polysaccharide xảy ra mãnh liêt Chính vị cần kết thúc quá trình nấu đúng lúc để có thể bảo toàn được polysaccharide

− TXL sinh khối bằng axit

Mục đích của các phương pháp TXL axit là hòa tan phần hemicellulose của sinh khối, tăng khả năng tiếp xúc với enzyme cho phần cellulose TXL sinh khối bằng axit có thể sử dụng axit đặc hay loãng nhưng việc sử dụng axit đặc ít phổ biến hơn do sự tạo thành các chất ức chế và đòi hỏi thiết bị chuyên dụng cho điều kiện xử lý khắc nghiệt Hơn nữa, vấn đề thu hồi axit và bảo vệ môi trường là những bất cập lớn trong phương pháp TXL sinh khối bằng axit đặc Chi phí vận hành và bảo dưỡng cao làm giảm sự quan tâm đến việc áp dụng phương pháp TXL bằng axit đặc ở quy mô thương mại

Phương pháp TXL bằng axit loãng là phương pháp phổ biến hơn cho các ứng dụng công nghiệp và đã được nghiên cứu để TXL nhiều loại sinh khối lignocellulose Nhiều loại thiết bị phản ứng khác nhau như thiết bị phản ứng chiết ngâm, dòng chảy theo vòi, mẻ và đối lưu đã được áp dụng để TXL các nguyên liệu lignocellulose [99] Nó có thể được tiến hành ở nhiệt độ cao (200−220°C) trong khoảng thời gian ngắn; hay ở nhiệt độ thấp hơn (120°C) trong khoảng thời gian dài hơn (30–90 phút) TXL sinh khối bằng axit loãng chủ yếu hòa tan hemicellulose như: xylan, arabinan… và chuyển đổi cellulose thành các đường

có khả năng lên men Tuy nhiên, tùy vào nhiệt độ của quy trình mà một số hợp chất tạo thành do phân hủy đường như furfural, HMF và các hợp chất vòng thơm do phân hủy từ lignin đã được phát hiện và chúng có ảnh hưởng lớn đến chuyển hóa của vi sinh vật trong quá trình lên men [46] Tuy nhiên, phương pháp TXL bằng axit loãng tạo thành ít các chất

ức chế hơn so với phương pháp TXL bằng axit đặc

Đã có nhiều báo cáo về sản phẩm thủy phân khi TXL các nguyên liệu lignocellulose bằng axit H2SO4 loãng, một loại axit được nghiên cứu nhiều nhất, ngoài ra còn có các loại

17

axit như: HCl, H3PO4, HNO3 cũng được thử nghiệm [88] Sản phẩm của quá trình đường hóa thu được cao tới 74% khi rơm cây lúa mạch được xử lý bằng H2SO4 0,75% về thể tích

ở nhiệt độ 121°C trong thời gian 1h [46] Sinh khối của cây oliu được TXL bằng H2SO4

1,4% ở 210°C thu được sản phẩm thủy phân 76,5% [117]

Các axit hữu cơ như fumaric hay maleic cũng được sử dụng như là phương án thay thế để tăng cường thủy phân cellulose cho sản xuất etanol Tuy nhiên hiệu quả của chúng còn phụ thuộc vào khả năng thu hồi axit và các chất ức chế lên men từ quá trình phân hủy đường

Tương tác của lignin với tác nhân axit

Quá trình tương tác của lignin với axit xảy ra chủ yếu là 03 quá trình hóa học: axit hóa lignin tạo thành lignoaxit, thủy phân lignin hay cắt mạng lưới không gian của lignin, phân tách lignin thành những phần tử nhỏ chứa vài đơn vị cơ bản của lignin (bao gồm các phản ứng ở mạch alkyl Cα, Cβ, Cγ, phản ứng ngắt liên kết ete, có thể là ete mạch thằng hoặc ete mạch vòng cumaran, pinoresinol) và cuối cùng là quá trình hòa tan lignin vào dịch nấu Tốc độ của cả ba quá trình trên phụ thuốc vào độ mạnh hay yếu của axit, pH của dịch nấu, nhiệt độ, áp suất của quá trình xử lý [26,87, 164]

Ngoài sự phụ thuộc vào các điều kiện xử lý bên ngoài (như nhiệt độ, loại axit, pH, áp suất, thời gian xử lý ) quá trình tách loại lingin bằng axit còn phụ thuộc vào bản chất lignin (lignin của loại sinh khối nào) trong đó cấu trúc, mạng lưới không gian của lignin đóng vai trò quan trọng Đó là hiệu ứng che chắn không gian của các nhóm chức và dịch chuyển điện tử linh đông Người ta phân loại khả năng phản ứng của lignin trong môi trường axit thành 03 nhóm như sau:

18

sản xuất etanol cho quá trình đường hóa và lên men đồng thời (SSF) từ các mảnh gỗ sồi [135] Kết quả từ các nghiên cứu khác gần đây đã cho thấy rằng TXL rơm lúa mì bằng nấm mục trong 10 ngày có thể tách loại lượng lớn lignin và ít phân giải cellulose (dòng nấm phân lập RCK-1); khi kết hợp với thủy phân bằng axit, đã làm giảm lượng axit cho quá trình thủy phân, tăng giải phóng các đường có khả năng lên men và giảm nồng độ của các chất ức chế Sản lượng và hiệu suất etanol thu được khi lên men bằng Pichia stipitis tương ứng là 0,48 g/g và 0,54 g/L [136] Một khảo sát về TXL sinh học đối với bã mía bằng cách

sử dụng tám loài vi khuẩn và vi nấm khác nhau đã được tiến hành dựa trên cơ sở đánh giá

sự thay đổi các thành phần trong bã mía, sự tổng hợp enzyme cellulase, protein, tổng lượng đường thu được, cũng như các thông số khác nhau trong quá trình TXL [140] Và TXL bằng vi khuẩn trên bã mía đã làm tăng khả chuyển hóa thành đường cho quá trình thủy phân bằng enzyme

Nói chung, quá trình TXL bằng tác nhân sinh học có những ưu điểm như chi phí đầu

tư thấp, tiêu hao năng lượng ít, không đòi hỏi các hóa chất, các điều kiện môi trường xử lý khắc nghiệt Tuy nhiên, trở ngại chính để phát triển các phương pháp TXL sinh học là tốc

độ thủy phân thấp đối với hầu hết các nguyên liệu sinh khối so với các công nghệ TXL hóa học [141]

Phương pháp TXL khác nhau đối với nguyên liệu lignocellulose đã được mô tả và nghiên cứu rộng rãi để cải thiện quy trình sản xuất etanol sinh học Tất cả những phương pháp này đều hướng đến việc làm cho khả năng tiếp cận enzyme của vật liệu lignocellulose được cải thiện, trong đó có tính đến ảnh hưởng của hemicellulose và lignin Mỗi một phương pháp đều tồn tại cả ưu điểm, nhược điểm và thích hợp với từng loại nguyên liệu

Do đó, tùy theo đặc điểm của từng loại nguyên liệu mà lựa chọn các phương pháp TXL thích hợp Có 3 yếu tố quan trọng, được coi là quyết định khi xem xét công nghệ TXL hiệu quả là: năng suất đường thu được, kích thước của nguyên liệu và tiêu hao năng lượng cho TXL

1.2.3 Thủy phân sinh khối bằng enzyme cho sản xuất etanol sinh học

Thủy phân sinh khối lignocellulose (quá trình phân hủy, thối, mục) trong tự nhiên xảy ra do tác động của vi sinh vật như là một phần của chu trình carbon [130,78] Để thủy phân hoàn toàn lignocellulose cần phải có sự tác động hiệp đồng của một phức hệ enzyme phân giải cả các mạch cellulose lẫn các thành phần lignin, hemicellulose bao bọc và liên kết các mạch cellulose lại với nhau

Các cellulase, xylanase đã được thương mại hóa khá nhiều và được tối ưu hóa cho các quá trình sử dụng chủ yếu cho mục tiêu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi hoặc phân hủy rác thải Tuy vậy, thủy phân nguyên liệu lignocellulose là một ứng dụng mới cần có sự nghiên cứu đầy đủ Trong vòng 20 năm trở lại đây, nghiên cứu về hệ enzyme thủy phân lignocellulose thu hút sự quan tâm của đông đảo các nhà khoa học trên thế giới Các vấn đề được tập trung nghiên cứu bao gồm: khả năng tổng hợp enzyme, đặc tính của enzyme, khả năng và cơ chế hoạt động của hệ thống đa enzyme Các enzyme được kỳ vọng có hiệu quả thủy phân cao hơn, hoạt động ổn định hơn, chịu nhiệt, chịu axit và ít nhạy cảm hơn với sản phẩm thủy phân, chất ức chế, và đặc biệt là khả năng sử dụng phối hợp các enzyme này

19

trong phân giải lignocellulose [120,162] Có thể giảm chi phí sản xuất enzyme bằng cách chọn chủng vi sinh vật có năng lực tổng hợp enzyme tốt với tính đặc hiệu enzyme cao, có khả năng chịu nhiệt (có khả năng làm giảm lượng enzyme cần sử dụng, giúp giảm giá thành thủy phân) và không bị ức chế bởi các sản phẩm thủy phân của chúng Các chủng tiềm năng như vậy có thể có được bằng cách lựa chọn tạo chủng tái tổ hợp các vi sinh vật mới hay cải biến chúng bằng các kỹ thuật đột biến hay các kỹ thuật di truyền

1.2.3.1 Hệ enzyme cellulase

Trong tự nhiên, hỗn hợp các enzyme thủy phân và oxy hóa do các nấm mốc và vi khuẩn tạo ra có khả năng phân giải tập hợp các thành phần cấu trúc thành tế bào thực vật lignocellulose [102,56] Hàng loạt vi sinh vật sinh enzyme đã được phân lập, trong số đó, các chủng được xem là tổng hợp các enzyme phân giải lignocellulose hiệu quả nhất thuộc

về Trichoderma reesei và các dạng đột biến của nó [89,47,64]

Cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp

Cellulose bị thủy phân bởi một phức hệ cellulase, chủ yếu gồm 3 loại enzyme: 1) Endoglucanase, thường được gọi là carboxymethylcellulose (CM)-cellulases, thủy phân liên kết β-1,4 glucoside của cellulose tinh thể một cách ngẫu nhiên, tạo ra các đầu không khử, giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose, mở mạch cho enzyme cellobiohydrolases; 2) Exoglucanase, thường gọi là cellobiohydrolases, cắt chuỗi cellulose

từ đầu không khử giải phóng ra chủ yếu các cellobiose.; 3) β-1,4 glucosidase thủy phân cellobiose và các cello-oligosacchacaride thành glucose và bị kìm hãm mạnh bởi chính sản phẩm thủy phân của nó là glucose (hình 1.6) [38]

Hình 1.6 Thủy phân cellulose bằng cellulase Các enzyme cellulase từ vi khuẩn được xem là bền nhiệt và có thể hoạt động trong môi trường pH kiềm hơn so với nấm mốc [80, 38] Các vi khuẩn có khả năng tạo cellulase

20

bao gồm các vi khuẩn hiếu, yếm khí, vi khuẩn dạ cỏ như Clostridium, Cellulomonas,

Thermomonospora fusca được nghiên cứu khá kỹ Mặc dù các vi khuẩn như Clostridium thermocellum và Bacteroides cellulosolvens có thể tạo được các enzyme có độ đặc hiệu

cao, nhưng lượng enzyme tạo ra không đủ lớn Do các vi khuẩn yếm khí có tốc độ phát triển thấp và yêu cầu điều kiện nuôi cấy phức tạp, hầu hết các enzyme thương mại đi từ nấm mốc [45]

Các nấm mốc sản xuất cellulase bao gồm và các loài thuộc Trichoderma,

Aspergillus, Schizophyllum, Penicillium, Sclerotium và Phanerochaetae [48,45] Trong số

các nấm mốc kể trên, Trichoderma là nấm mốc được nghiên cứu nhiều nhất do đặc tính

hấp dẫn của hệ enzyme cellulase và các enzyme hỗ trợ sự phân giải nguyên liệu

lignocellulose T reesei có khả năng tổng hợp một hệ enzyme cellulase bao gồm 9 enzyme

của 3 nhóm: 2−exoglucanases, 5−endoglucanases và 2−β−glucosidases Tuy vậy

β−glucosidase của Trichoderma thường bị thiếu hụt hoặc hoạt động không hiệu quả

Cellulase thương mại thông dụng nhất hiện nay là của Novozymes và Genecor Chúng được dùng ở tỉ lệ 10 FPU/g cellulose [111] để đạt được hiệu quả thủy phân cao

trong 48–72h [53] Endoglucanase của Erwinia chrysanthemi P86021 được biểu hiện trong

Escherichia coli KO11 [152] thu được 3200 IU endoglucanase/lít dịch lên men

Endoglucanase bền nhiệt của Acidothermus cellulolyticus cũng được biểu hiện trong

Arabidopsis thaliana [163], khoai tây [39] và trong lá thuốc lá [59] Các nghiên cứu cho

rằng 100 g/l mùn lignocellulose cần nồng độ enzyme 10-20 FPU/g cơ chất để thủy phân với hiệu quả thủy phân đạt 90% trong vòng 70-110h [103]

Trong thủy phân cellulose, tốc độ chung của quá trình thủy phân cellulose phụ thuộc

nhiều vào hoạt tính của β-glucosidase Thí nghiệm khi cho T reesei QM9414 thủy phân

cellulose tinh khiết ở các nồng độ cellobiose ban đầu khác nhau, đã nhận thấy nếu tăng nồng độ cellobiose lên sẽ làm giảm đáng kể tốc độ thủy phân Các vi sinh vật có khả năng

sinh tổng hợp mạnh cellulase, đặc biệt T reesei, T viride, thường bị thiếu hụt

β-glucosidase, điều này dẫn đến sự tích tụ cellobiose trong dịch thủy phân và làm giảm đáng

kể tốc độ của quá trình đường hóa Do cellobiose là chất ức chế hoạt động của cellulase

nên bổ sung β-1,4 glucosidase vào dung dịch enzyme của T reesei cho hiệu quả thủy phân tốt hơn Thí nghiệm bổ sung 10 lần lượng β-1,4 glucosidase ngoại bào của A niger vào phức hệ cellulase của T reesei làm tăng 20% tốc độ chuyển hóa cellulose thành glucose

trong thời gian 24 giờ [102] Cũng tương tự, trong thí nghiệm khi phức hệ cellulase của

Penicillium decumben JU-A10 được bổ sung β-1,4 glucosidase của A niger L22 hiệu suất

thu hồi etanol tăng lên 42% so với khi sử dụng một mình phức hệ cellulase của P

decumben JU-A10 cho quá trình đường hóa và lên men đồng thời dịch nước thải của quá

trình xử lí bột giấy [155]

Do tầm quan trọng của enzyme β-glucosidase trong quá trình đường hóa và ứng dụng của nó trong các ngành công nghiệp, việc nghiên cứu tạo ra các chế phẩm mang enzyme tái

tổ hợp đã được quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm nay Trình tự gen mã hóa cho enzyme

β−glucosidase đã được xác định trong nhiều loài sinh vật khác nhau ví dụ Candida

coli [41,29,74,126,125]

Hoạt tính của enzyme β−glucosidase tái tổ hợp được xác định có thể tương đương hoặc cao hơn rất nhiều so với enzyme tự nhiên (gấp 37 lần) [67] Hoạt tính của enzyme tái

tổ hợp cũng khác nhau tuỳ thuộc vào từng chủng biểu hiện Enzyme β−glucosidase khi

được biểu hiện trong Saccharomyces cerevisiae chỉ có hoạt tính 1,9 U/mg protein, tuy nhiên khi được biểu hiện trong chủng Pichia pastoris lại cho hoạt tính rất cao 124 U/mg

protein [41] Mức độ biểu hiện của enzyme β−glucosidase tái tổ hợp cũng khác nhau tuỳ thuộc từng chủng, chủng vật chủ và hệ vector biểu hiện Mức độ biểu hiện của enzyme

β−glucosidase trong hệ vector pPICZA và vật chủ Pichia pastoris KM71H chỉ là 3,9 U/ml canh trường, trong khi đó với hệ vector pPIC9K và vật chủ Pichia pastoris KM71 là 28,5 U/ml canh trường nuôi, với hệ vector pHIL-S1 và vật chủ Pichia pastoris GS115 là 62

U/ml canh trường nuôi Trong một số nghiên cứu, enzyme β−glucosidase tái tổ hợp cũng

đã được tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký và nghiên cứu một số đặc tính như độ bền nhiệt, nhiệt độ và pH tối ưu [74] Kết quả ngiên cứu cho thấy, enzyme tái tổ hợp có khả năng bền nhiệt và có dải pH hoạt động tương đối rộng Trong những năm gần đây, enzyme β−glucosidase tái tổ hợp đã bắt đầu được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiêp

Enzyme β−glucosidase tái tổ hợp từ nấm mốc Aspergillus niger đã được ứng dụng trong

sản xuất cồn và tăng hương cho dịch quả [126] Ngoài ra, gen mã hóa cho enzyme này từ

chủng nấm men Saccharomycopsis fibuligera cũng đã được đưa vào chủng nấm men công nghiệp không có khả năng sinh tổng hợp β−glucosidase Saccharomyces cerevisiae NAN-

27, hoặc chủng Zymobacter palmae tái tổ hợp mang gen mã hóa β−glucosidase được ứng

dụng trong sản xuất cồn [157,125]

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cellulase, khả năng hấp thụ của enzyme vào cơ chất và tốc độ phản ứng Thông thường enzyme cellulase hoạt động ở dải nhiệt độ từ 30 – 70 ºC và nhiệt độ tối ưu của nó là 50 –60ºC Trong tự nhiên, hoạt tính của cellulase khá bền, có thể chịu nhiệt độ lên tới 100ºC trong vài phút Đối với pH, tuỳ thuộc vào enzyme tách chiết từ vi sinh vật nào mà pH hoạt động ở những giá trị khác nhau Đối với hầu hết các enzyme từ nấm sợi, vi khuẩn đường

ruột, pH có giá trị trong vùng axit, còn với enzyme tách từ loài Humicola lại hoạt động tốt

ở pH 7 – 9 Ngoài ra, hoạt động của enzyme cellulase có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau Các tác nhân và cơ chế ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme cellulase rất đa dạng và phong phú, có tác nhân là chất kìm hãm của enzyme này nhưng lại là chất hoạt hoá của enzyme khác Cùng một enzyme nhưng từ các nguồn khác nhau thì cũng chịu sự điều hoà hoạt động bởi các yếu tố khác nhau, ví dụ như các ion kim loại khác nhau, các hóa chất như etanol, butanol, EDTA, aceton

Ứng dụng khác của enzyme cellulase

22

Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase thường dùng để tăng chất lượng thực phẩm

và thức ăn gia súc, tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật Ngoài ra, trong sản xuất agar-agar, tác động của cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào Đặc biệt là việc sử dụng cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân làm thức ăn gia súc [150] Trong công nghiệp dệt cellulase có tác dụng chống quăn vải, làm mềm vải, làm sáng màu, chống bám trở lại và làm sạch Đối với việc sản xuất giấy từ nguồn giấy phế liệu hiện đang rất phổ biến, việc sử dụng cellulase đang là hướng đi đúng đắn để hạn chế việc sử dụng hóa chất tẩy trắng, nhằm giảm chi phí sản xuất và bảo vệ môi trường khỏi bị hủy hoại Tuy nhiên, cellulase cũng là enzyme được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn rất nhiều so với amylase và protease

1.2.3.2 Hệ enzyme thủy phân hemicellulose (hemicellulase)

Song song với thủy phân cellulose, quá trình thủy phân hemicellulose còn lại trong phần carbohydrate dẫn đến phá hủy cấu trúc tổ hợp lignocellulose, hỗ trợ quá trình thủy phân cellulose và thúc đẩy quá trình đường hóa hoàn toàn sinh khối Hemicellulase bao gồm các enzyme rất khác nhau, thủy phân các cơ chất hemicellulose tương ứng Enzyme β-mannanases thủy phân mannan tạo các β-1,4-manno-oligomer mạch ngắn, và tương tự các oligo này được thủy phân thành mannose nhờ β-mannosidase, α-L−arabinofuranosidase và α-L-arabinanase thủy phân arabinofuranoside cho tới arabinose Nhiều enzyme thuộc hemicellulase có tính đặc hiệu cơ chất rộng, có khả năng thủy phân dẫn xuất xylans, xylooligomers và arabinans tại các liên kết glycozide ở vị trí O-5, O-2 và/hoặc O-3 [118] Các hemicellulo-esterase như acetyl esterase thủy phân dẫn xuất acetyl hóa của xylose moieties, feruloyl esterase thủy phân liên kết este giữa arabinose ferulic acid gắn kết lignin với hemicellulose, giúp giải phóng hemicellulose và tăng khả năng thủy phân các hợp chất hemicellulose này [118] Xylan là hợp chất phổ biến nhất trong số các hemicellulose, vì thế xylanase là một trong các enzyme có ý nghĩa quan trọng trong thủy phân các hemicellulose Những enzyme tham gia phân hủy xylan gồm: endo-1-4 β-xylanase (EC 3.2.1.8) thủy phân liên kết β-1,4 glucosid trong mạch xylan tạo nên các mạch xylooligomer ngắn; β-xylosidase (EC 3.2.1.37) thủy phân các mạch xylooligomer thành xylose và arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) (hình 1.7) [79]

Hình 1.7 Cơ chế thủy phân xylan bằng xylanase

23

Trong vòng hai thập niên qua có rất nhiều nghiên cứu về xylanase từ vi khuẩn và nấm mốc Các nghiên cứu đi từ phân lập các chủng tạo xylanase có hoạt lực cao, tách tinh sạch enzyme xylanase, đến tạo ra các chủng xylanase tái tổ hợp Xylanase chủ yếu được

tìm thấy ở vi khuẩn gồm có các loài B subtilis, Paenibacillus, B pumilis, Aeromonas

caviae, từ nấm men như Candida tropicalis, từ nấm mốc như T reesei, T koningii, A.niger, A.usamii, A oryzae, P purpurogenum… Trong những năm gần đây nhiều nghiên

cứu tập trung tạo ra xylanase tái tổ hợp sử dụng các sinh vật chủ khác nhau như E coli, B

subtilis, A kawachii, Pichia pastoris, nhờ đó hoạt lực của enzyme đã được nâng cao lên

nhiều lần so với chủng gốc ban đầu [108] Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng biểu hiện

gen xylanase của B circulans nhờ B subtilis có nhiều ưu điểm hơn biểu hiện trên E coli: hoạt lực của enzyme tái tổ hợp ở B subtilis (1120 U) cao hơn 14 lần so với ở E coli (79U)

[115] Nguyên nhân của sự tăng lên này là do có vật chủ tương đồng do đó nó tăng quá trình phiên mã, dịch mã cũng như ổn định của gen biểu hiện

Quá trình thủy phân sinh khối bằng enzyme thường được tiến hành với hỗn hợp các enzyme khác nhau nhằm tăng tốc cho phản ứng thủy phân đồng thời tổ hợp gồm ba thành phần là cellulose, hemicellulose, lignin để nâng cao hiệu quả thủy phân cuối cùng Sau quá trình TXL sinh khối bằng các tác nhân khác nhau nhằm tách loại lignin thì hỗn hợp enzyme sử dụng cho thủy phân phần carbohyrate còn lại thường là hỗn hợp enzyme cellulase và xylanase (thủy phân xylan)

Giảm tiêu hao năng lượng, khắc phục ảnh hưởng đến môi trường, vận hành quá trình đơn giản, và không độc hại là các ưu điểm lớn của thủy phân sinh khối bằng enzyme so với quá trình thủy phân bằng axit Tuy nhiên, các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đều cho thấy công nghệ thủy phân bằng enzyme chuyển hóa sinh khối thành đường phụ thuộc rất nhiều vào quá trình TXL nguyên liệu ban đầu như kích thước nguyên liệu, mức độ lẫn các tạp chất như lignin, các chất trích ly, các chất vô cơ, cấu trúc của sinh khối sau TXL

1.2.3.3 Hệ enzyme thủy phân pectin

Pectin là thành phần đứng thứ ba về khối lượng trong nhóm polysaccharide cấu thành nên vách tế bào thực vật Tương tự pectin cũng có thể được chuyển hóa thành các dạng đường hòa tan, etanol hay biogas Một số enzyme có khả năng thủy phân pectin như: polymethylgalacturanosidase, exopolygalacturonase và exopolygalacturanosidase hydrolase

Nguồn enzyme được sử dụng phổ biến hiện nay là từ Trichoderma

reesei và Aspergillus niger Hiện nay, các thế hệ enzyme cũ được thay thế dần bằng các hệ

enzyme mới chịu nhiệt, chịu các điều kiện hóa học khắc nghiệt hơn Hơn nữa, các nghiên cứu về phức hợp cellulosome của các vi khuẩn kỵ khí đang dần mở ra một con đường mới nhằm tăng hiệu quả thủy phân của tổ hợp sinh khối lignocellulose của các loại nguyên liệu thực vật

1.2.3.4 Hệ enzyme phân hủy lignin

Hai họ enzyme chính tham gia vào sự phân hủy lignin trong tự nhiên là peroxidase

và laccase Các enzyme peroxidase và laccase được tìm thấy trong thực vật, nấm, một số loài xạ khuẩn, vi khuẩn và côn trùng, phần lớn từ các địa điểm giàu các hợp chất lignocellulose như tầng gỗ mục trong rừng, compost lá cây rừng, phụ phẩm nông nghiệp,

24

nước thải hoặc đất thuộc khu vực sản xuất công nghiệp, nhà máy chế biến thực phẩm, nhà máy giấy Các enzyme tinh khiết đã được tách chiết và xác định các đặc điểm hóa sinh Gene mã hóa các loại enzyme trên đã được phân lập và biểu hiện trong các hệ thống biểu

hiện như vi khuẩn E coli, nấm men S cerevisiae, nấm sợi Aspergillus, Trichoderma v.v

[150]

Về mặt cấu trúc, laccase (benzenediol: oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) là một polyphenol oxidase có chứa nhiều nguyên tử đồng trong trung tâm hoạt động Vốn là một glycoprotein, enzyme này xúc tác sự oxy hóa các ortho− và paradiphenol, aminophenol, polyphenol, polyamin, lignin và các aryl diamin cũng như một số các ion vô cơ Một đặc điểm nổi bật khác của laccase là sự oxy hóa các cơ chất chỉ kèm theo sự khử oxy thành nước, khác với các peroxidase, cần tới sự có mặt của các cofactor (như H2O2) Mặt khác, tuy thế oxy hóa khử của laccase là nhỏ hơn so với các hợp chất không chứa nhóm phenol,

do vậy nó không có khả năng oxy hóa trực tiếp các hợp chất này, nhưng bằng cách sử dụng các phân tử nhỏ có khả năng đóng vai trò như là chất vận chuyển electron trung gian, laccase có khả năng oxy hóa được nhiều cấu trúc không chứa nhóm phenol Chính nhờ các đặc tính nêu trên mà laccase có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực đời sống, kinh tế xã hội như trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy, ngành may mặc, xử lý môi trường và gần đây là trong sản xuất etanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp [13,150]

Về mặt phân bố, hoạt tính của laccase đã được tìm thấy ở nhiều loại thực vật bậc cao

và ở nấm mốc Ở vi khuẩn, hoạt tính tương tự như laccase cũng đã được tìm thấy trong một

số ít trường hợp Tuy nhiên, tất cả các protein tương tự laccase được tìm thấy ở vi khuẩn đều là nằm trong nội bào hay vùng ngoại vi tế bào chất (periplasm) khác với các laccase ở nấm mốc và thực vật bậc cao đều được tiết ra môi trường bên ngoài Ở nấm mốc, enzyme này đã được tinh sạch và đặc tính hóa từ hàng chục loài khác nhau Các gen mã hóa cho nhiều laccase cũng đã được tách dòng và xác định trình tự, giúp cho việc phân lập các gen

mã hóa các laccase mới trở nên dễ dàng hơn Do khả năng sống ký sinh trên gỗ mà các loại nấm mục thường là nguồn gen để phân lập các gen mã hóa laccase [50]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hiệu suất thu nhận laccase từ các chủng sinh tự nhiên enzyme này phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy, đặc biệt là việc sử dụng các chất cảm ứng Do giá thành của các chất cảm ứng rất cao nên việc sản xuất laccase bằng công nghệ ADN tái tổ hợp là con đường có triển vọng nhất để thu nhận được một chế phẩm enzyme có giá thành rẻ, có khả năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống xã hội Một số kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng lựa chọn vật chủ để biểu hiện laccase nói riêng cũng như các enzyme khác tham gia vào quá trình thủy phân cơ chất lignocellulose là hết sức quan trọng, quyết định hiệu quả công nghệ và kinh tế của chế phẩm enzyme [50]

1.2.4 Lên men etanol từ dịch thủy phân sinh khối bằng enzyme

Sản phẩm thu được của quá trình thuỷ phân sinh khối thực vật là hỗn hợp các loại đường khác nhau (chủ yếu là glucose và xylose trong đó xylose chiếm 20−30% lượng đường thu được)

Lên men là quá trình chuyển hóa đường glucose thành etanol và giải phóng khí CO2

1 Thủy phân và lên men riêng biệt (Separate hydrolysis and fermentation);

2 Chuyển hóa trực tiếp bằng vi sinh vật (Direct microbial conversion);

3 Đường hóa và lên men đồng thời (Simultaneous saccharification and fermentation)

Quá trình lên men thành etanol trong luận văn được thực hiện theo phương pháp đường hóa và lên men riêng biệt Đây là quá trình lên men truyền thống Đầu tiên vật liệu lignocellulose (sau khi đã qua TXL) được thủy phân bằng enzyme để thu đường Sau đó đường tạo thành được lên men etanol bằng cách sử dụng nấm men trong Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ưu điểm của quá trình này là mỗi một giai đoạn sẽ được tiến hành ở những điều kiện tối ưu riêng của nó [75]

Cơ chế sinh học của lên men etanol

Lên men etanol gồm các quá trình sinh hóa và sinh học rất phức tạp, xảy ra dưới tác dụng của nhiều enzyme Đường và các chất dinh dưỡng thấm qua màng tế bào nấm men và được chuyển hóa thành etanol và khí CO2 ở ti thể, các chất này sau đó thấm qua màng tế bào, khuếch tán ra ngoài môi trường Quá trình lên men etanol là quá trình lên men bắt đầu với con đường đường phân (EMP) [5] Đây là con đường phổ biến nhất dùng để phân giải glucose thành pyruvate là chất chuyển hóa trung gian quan trọng đối với hầu hết sinh vật sống (hình 1.8) [5] Con đường đường phân có thể chia thành hai phần: trong chặng mở đầu glucose được phosphoryl hóa hai lần, cuối cùng được chuyển thành fructo−1,6−biphosphate Chặng tiếp theo bắt đầu khi enzyme fructo−1,6−bisphosphate aldolase xúc tác phân giải fructo−1,6−biphosphate thành hai nửa, mỗi nửa đều chứa nhóm phosphate và cuối cùng chuyển hóa thành pyruvate

Lên men đường xylose tạo thành etanol được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1959 Đến năm 1976, phát hiện ra chủng nấm men có khả năng đồng hóa xylose nhưng không có khả năng lên men xylose Năm 1960, lần đầu tiên phát hiện ra sự chuyển hóa xylose thành xylulose và đến những năm 1980, mới phát hiện nấm men có khả năng lên men xylose thành etanol

26

Hình 1.8 Sơ đồ phân giải glucose thành Pyruvate

1.2.4.1 Vi sinh vật lên men glucose

Trong tự nhiên có rất nhiều vi sinh vật có thể chuyển hóa đường 5 và đường 6 carbon

thành cồn Các vi sinh vật phổ biến nhất là nấm men Saccharomyces cerevisiae,

Zymmomonas mobilis, Escherichia coli, Pichia stipitis Trong đó chủng vi sinh vật có thể

sử dụng trong sản xuất cồn công nghiệp cần phải đáp ứng một số tiêu chí nhất định như: có thể sử dụng dải cơ chất rộng, có khả năng phát triển và lên men với hiệu suất cao, lượng sản phẩm phụ tạo thành ít, có khả năng chịu được nồng độ etanol cao, pH thấp, nhiệt độ cao và có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường rẻ tiền [13]

27

a Nấm men:

Trong công nghiệp, nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng phổ biến nhất,

vì nó có nhiều đặc điểm đáp ứng được các tiêu chí trên Ngày nay, bằng phương pháp gene, người ta đã tạo ra rất nhiều chủng có khả năng lên men đồng thời nhiều loại đường

khác nhau như S cerevisiae tái tổ hợp nhằm tạo ra chủng lên men pentose và hexose để tối

ưu hóa hiệu quả lên men Nấm men S cerevisiae là dạng nấm men đơn bào mang nhiều

đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển, tế bào dạng hình cầu, bầu dục, elip, hoặc

hơi dài, với kích thước 3-7 x 4-12 cm, khuẩn lạc nhẵn bóng, tròn, màu kem Nấm men S

cerevisiae có đặc điểm sinh trưởng kị khí không bắt buộc, chúng vừa có khả năng hô hấp

và lên men etanol

Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh sản, phát triển nấm men, tốc độ lên men

và chất lượng etanol Nấm men có thể chịu được nhiệt độ từ 4–45oC, nhưng nhiệt độ phù hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm men là 24–30oC Ngoài ra, nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao đều làm cho quá trình lên men bị dừng lại trong khi hàm lượng đường trong dung dịch lên men còn cao, làm ảnh hưởng không tốt tới chất lượng etanol Nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men rượu truyền thống từ gạo là 24–28oC và việc duy trì nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình lên men là rất cần thiết [13]

Nấm men có thể sinh sản và phát triển trong môi trường có pH từ 2,5 – 7,5, nhưng

pH phù hợp nhất với sinh sản và phát triển của nấm men là 4,0 – 6,0 Vì vậy, để hạn chế quá trình lây nhiễm và phát triển của nhiều loại vi khuẩn, phù hợp với sinh trưởng của nấm men và pH tự nhiên của dịch lên men, trong nhân giống và sản xuất, pH luôn được duy trì

ở mức 5,0 – 6,0

Nấm men S cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn như glucose, galactose,

đường đôi như sucrose hoặc đường ba như raffinose Nấm men đạt tốc độ sinh trưởng nhanh nhất khi hàm lượng đường trong dịch lên men là 1– 2% Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men rượu là 16 – 20%, hàm lượng đường 28% sẽ ức chế quá trình lên men Tỷ lệ các loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men [75] Ngoài ra nấm men này có khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao, ở

38 % đường tế bào nấm men không bị phá vỡ

Nồng độ oxy hòa tan là điều kiện quan trọng cho giai đoạn sinh sản và phát triển của nấm men, quyết định đến hiệu suất và chất lượng etanol Hàm lượng oxy hòa tan phù hợp cho sinh sản và phát triển của nấm men thường là: 0,65 – 0,70 mg/l Khi môi trường có đầy

đủ oxy nấm men sẽ sử dụng đường làm nguồn năng lượng tăng sinh khối Ngược lại khi môi trường thiếu oxy, nấm men lên men và chuyển hóa đường thành etanol Vì vậy, khi lên men etanol để có được hiệu suất lên men cao nhất, đồng thời hạn chế quá trình tạo aldehyde, rượu bậc cao, axeton có trong rượu thành phẩm, cần phải hạn chế tối đa sự có mặt của oxy có trong dịch lên men [75]

Mỗi chủng nấm men có khả năng chịu được nồng độ etanol khác nhau, một số chủng

chỉ chịu được nồng độ thấp như: Hansenula, Alanama nhưng nấm men S cerevisiae lại

có khả năng chịu cồn tới 18 - 20% Trong quá trình lên men cồn, nồng độ etanol tăng dần

sẽ ức chế không chỉ các hoạt động của nấm men, mà còn kìm hãm hoạt động của nhiều loại

28

enzyme chuyển hóa đường thành rượu [117] Các chủng này thường lên men etanol với độ cồn đạt được từ 10 – 15% ở pH 3,5 - 4,0 trong dải nhiệt độ từ 32 - 38ºC

Có khả năng lên men cao và là đối tượng được tìm hiểu kỹ nhất, nấm men S

cerevisiae có tiềm năng nhất cho công đoạn lên men glucose thành etanol trong sản xuất

etanol nhiên liệu từ sinh khối

ATP chỉ bằng một nửa so với EM trên cùng một lượng glucose, và do vậy Zymomonas tạo

ra ít sinh khối hơn và lượng glucose chuyển trực tiếp thành etanol cũng cao hơn Hiệu suất

sinh etanol của Zymomonas khoảng 5 – 10% cao hơn so với S cerevisiae trên cùng một lượng glucose lên men Vi khuẩn Z mobilis là loại vi sinh vật không gây độc hại cho con

người và không đòi hỏi những điều kiện nuôi cấy ngặt nghèo như nhiều vi khuẩn khác

Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất thì S cerevisiae vẫn là vi sinh vật được lựa chọn

[158,51]

1.2.4.2 Vi sinh vật lên men xylose

Một trong những khó khăn khi lên men dịch thủy phân sinh khối thực vật là rất ít vi

sinh vật có khả năng lên men xylose (chiếm 20 – 30% lượng đường tạo ra) Cả nấm men S

cerevisiae, Pichia stipitis và vi khuẩn Z mobilis đều không có khả năng này Trong số hơn

một nghìn loài nấm men được biết chỉ có 4 loài có khả năng lên men xylose ở các mức độ

khác nhau Hiện nay nấm men Pachysolen tannophilus đang được sử dụng trong lên men

dịch thủy phân hemicellulose (sản phẩm chủ yếu là xylose) để tạo etanol Tuy nhiên nấm

men P tannophilus không tích lũy được quá 2 % etanol trong canh trường và điều này là

hạn chế rất lớn trong sản xuất Chính vì những lý do đó hiện nay có nhiều nhóm nghiên cứu đang tập trung vào cải thiện đặc tính chủng giống theo hướng chuyển các gene cần

thiết cho khả năng lên men xylose vào S cerevisiae

1.2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men etanol

a Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Cacbon là thành phần cơ bản xây dựng nên tế bào nấm men Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Vì vậy, các hợp chất chứa cacbon chiếm vị trí quan trọng hàng đầu cho sự sống của nấm men, chúng đáp ứng được ba nhu cầu chính sau đây: i) Sản sinh năng lượng; ii) Tạo thành các tiền chất; iii) Thực hiện các quá trình oxy hóa khử để biến những tiền chất thành những sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trường [51]

b Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Trong quá trình sống, nấm men cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ để xây dựng tế bào Hầu hết các thành phần của tế bào đều chứa nitơ (protein, nucleotide,