Sản phẩm thu đƣợc của quá trình thuỷ phân sinh khối thực vật là hỗn hợp các loại đƣờng khác nhau (chủ yếu là glucose và xylose trong đó xylose chiếm 20−30% lƣợng đƣờng thu đƣợc)
25 trong điều kiện yếm khí bởi vi sinh vật theo phƣơng trình tổng quát sau:
Quá trình lên men etanol từ dịch thủy phân sinh khối không khác biệt nhiều so với quá trình lên men etanol từ đƣờng hay tinh bột. Quá trình lên men etanol từ dịch đƣờng thủy phân sinh khối gồm có thể theo 3 kiểu kỹ thuật:
1. Thủy phân và lên men riêng biệt (Separate hydrolysis and fermentation); 2. Chuyển hóa trực tiếp bằng vi sinh vật (Direct microbial conversion);
3. Đƣờng hóa và lên men đồng thời (Simultaneous saccharification and fermentation).
Quá trình lên men thành etanol trong luận văn đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp đƣờng hóa và lên men riêng biệt. Đây là quá trình lên men truyền thống. Đầu tiên vật liệu lignocellulose (sau khi đã qua TXL) đƣợc thủy phân bằng enzyme để thu đƣờng. Sau đó đƣờng tạo thành đƣợc lên men etanol bằng cách sử dụng nấm men trong Bộ sƣu tập giống của Phòng Công nghệ Vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Ƣu điểm của quá trình này là mỗi một giai đoạn sẽ đƣợc tiến hành ở những điều kiện tối ƣu riêng của nó [75].
Cơ chế sinh học của lên men etanol
Lên men etanol gồm các quá trình sinh hóa và sinh học rất phức tạp, xảy ra dƣới tác dụng của nhiều enzyme. Đƣờng và các chất dinh dƣỡng thấm qua màng tế bào nấm men và đƣợc chuyển hóa thành etanol và khí CO2 ở ti thể, các chất này sau đó thấm qua màng tế bào, khuếch tán ra ngoài môi trƣờng. Quá trình lên men etanol là quá trình lên men bắt đầu với con đƣờng đƣờng phân (EMP) [5]. Đây là con đƣờng phổ biến nhất dùng để phân giải glucose thành pyruvate là chất chuyển hóa trung gian quan trọng đối với hầu hết sinh vật sống (hình 1.8) [5]. Con đƣờng đƣờng phân có thể chia thành hai phần: trong chặng mở đầu glucose đƣợc phosphoryl hóa hai lần, cuối cùng đƣợc chuyển thành fructo−1,6−biphosphate. Chặng tiếp theo bắt đầu khi enzyme fructo−1,6−bisphosphate aldolase xúc tác phân giải fructo−1,6−biphosphate thành hai nửa, mỗi nửa đều chứa nhóm phosphate và cuối cùng chuyển hóa thành pyruvate.
Lên men đƣờng xylose tạo thành etanol đƣợc báo cáo lần đầu tiên vào năm 1959. Đến năm 1976, phát hiện ra chủng nấm men có khả năng đồng hóa xylose nhƣng không có khả năng lên men xylose. Năm 1960, lần đầu tiên phát hiện ra sự chuyển hóa xylose thành xylulose và đến những năm 1980, mới phát hiện nấm men có khả năng lên men xylose thành etanol.
26 Hình 1.8. Sơ đồ phân giải glucose thành Pyruvate
1.2.4.1. Vi sinh vật lên men glucose
Trong tự nhiên có rất nhiều vi sinh vật có thể chuyển hóa đƣờng 5 và đƣờng 6 carbon thành cồn. Các vi sinh vật phổ biến nhất là nấm men Saccharomyces cerevisiae,
Zymmomonas mobilis, Escherichia coli, Pichia stipitis... Trong đó chủng vi sinh vật có thể sử dụng trong sản xuất cồn công nghiệp cần phải đáp ứng một số tiêu chí nhất định nhƣ: có thể sử dụng dải cơ chất rộng, có khả năng phát triển và lên men với hiệu suất cao, lƣợng sản phẩm phụ tạo thành ít, có khả năng chịu đƣợc nồng độ etanol cao, pH thấp, nhiệt độ cao và có khả năng sinh trƣởng và phát triển tốt trên môi trƣờng rẻ tiền [13].
27 a. Nấm men:
Trong công nghiệp, nấm men Saccharomyces cerevisiae đƣợc sử dụng phổ biến nhất, vì nó có nhiều đặc điểm đáp ứng đƣợc các tiêu chí trên. Ngày nay, bằng phƣơng pháp gene, ngƣời ta đã tạo ra rất nhiều chủng có khả năng lên men đồng thời nhiều loại đƣờng khác nhau nhƣ S. cerevisiae tái tổ hợp nhằm tạo ra chủng lên men pentose và hexose để tối ƣu hóa hiệu quả lên men. Nấm men S. cerevisiae là dạng nấm men đơn bào mang nhiều đặc điểm phong phú về sinh trƣởng và phát triển, tế bào dạng hình cầu, bầu dục, elip, hoặc hơi dài, với kích thƣớc 3-7 x 4-12 cm, khuẩn lạc nhẵn bóng, tròn, màu kem. Nấm men S. cerevisiae có đặc điểm sinh trƣởng kị khí không bắt buộc, chúng vừa có khả năng hô hấp và lên men etanol.
Nhiệt độ có ảnh hƣởng trực tiếp tới sự sinh sản, phát triển nấm men, tốc độ lên men và chất lƣợng etanol. Nấm men có thể chịu đƣợc nhiệt độ từ 4–45oC, nhƣng nhiệt độ phù hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm men là 24–30oC. Ngoài ra, nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao đều làm cho quá trình lên men bị dừng lại trong khi hàm lƣợng đƣờng trong dung dịch lên men còn cao, làm ảnh hƣởng không tốt tới chất lƣợng etanol. Nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men rƣợu truyền thống từ gạo là 24–28oC và việc duy trì nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình lên men là rất cần thiết [13].
Nấm men có thể sinh sản và phát triển trong môi trƣờng có pH từ 2,5 – 7,5, nhƣng pH phù hợp nhất với sinh sản và phát triển của nấm men là 4,0 – 6,0. Vì vậy, để hạn chế quá trình lây nhiễm và phát triển của nhiều loại vi khuẩn, phù hợp với sinh trƣởng của nấm men và pH tự nhiên của dịch lên men, trong nhân giống và sản xuất, pH luôn đƣợc duy trì ở mức 5,0 – 6,0.
Nấm men S. cerevisiae có thể lên men nhiều đƣờng đơn nhƣ glucose, galactose, đƣờng đôi nhƣ sucrose hoặc đƣờng ba nhƣ raffinose. Nấm men đạt tốc độ sinh trƣởng nhanh nhất khi hàm lƣợng đƣờng trong dịch lên men là 1– 2%. Hàm lƣợng đƣờng phù hợp cho quá trình lên men rƣợu là 16 – 20%, hàm lƣợng đƣờng 28% sẽ ức chế quá trình lên men. Tỷ lệ các loại đƣờng trong dịch lên men cũng ảnh hƣởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men [75]. Ngoài ra nấm men này có khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao, ở 38 % đƣờng tế bào nấm men không bị phá vỡ.
Nồng độ oxy hòa tan là điều kiện quan trọng cho giai đoạn sinh sản và phát triển của nấm men, quyết định đến hiệu suất và chất lƣợng etanol. Hàm lƣợng oxy hòa tan phù hợp cho sinh sản và phát triển của nấm men thƣờng là: 0,65 – 0,70 mg/l. Khi môi trƣờng có đầy đủ oxy nấm men sẽ sử dụng đƣờng làm nguồn năng lƣợng tăng sinh khối. Ngƣợc lại khi môi trƣờng thiếu oxy, nấm men lên men và chuyển hóa đƣờng thành etanol. Vì vậy, khi lên men etanol để có đƣợc hiệu suất lên men cao nhất, đồng thời hạn chế quá trình tạo aldehyde, rƣợu bậc cao, axeton... có trong rƣợu thành phẩm, cần phải hạn chế tối đa sự có mặt của oxy có trong dịch lên men [75].
Mỗi chủng nấm men có khả năng chịu đƣợc nồng độ etanol khác nhau, một số chủng chỉ chịu đƣợc nồng độ thấp nhƣ: Hansenula, Alanama... nhƣng nấm men S.cerevisiae lại có khả năng chịu cồn tới 18 - 20%. Trong quá trình lên men cồn, nồng độ etanol tăng dần sẽ ức chế không chỉ các hoạt động của nấm men, mà còn kìm hãm hoạt động của nhiều loại
28 enzyme chuyển hóa đƣờng thành rƣợu [117]. Các chủng này thƣờng lên men etanol với độ cồn đạt đƣợc từ 10 – 15% ở pH 3,5 - 4,0 trong dải nhiệt độ từ 32 - 38ºC.
Có khả năng lên men cao và là đối tƣợng đƣợc tìm hiểu kỹ nhất, nấm men S. cerevisiae có tiềm năng nhất cho công đoạn lên men glucose thành etanol trong sản xuất etanol nhiên liệu từ sinh khối.
b. Vi khuẩn
Loại vi khuẩn Zymomonas mobilis có khả năng lên men sinh etanol và chịu đƣợc độ nồng độ etanol tới 120 g/l. Vi khuẩn Zymomonas là loại vi sinh vật duy nhất sử dụng glucose trong điều kiện yếm khí theo con đƣờng Entner-Doudoroff (ED) trong khi đa số vi sinh vật khác sử dụng con đƣờng Embden-Meyerhof (EM). Con đƣờng ED tạo ra lƣợng ATP chỉ bằng một nửa so với EM trên cùng một lƣợng glucose, và do vậy Zymomonas tạo ra ít sinh khối hơn và lƣợng glucose chuyển trực tiếp thành etanol cũng cao hơn. Hiệu suất sinh etanol của Zymomonas khoảng 5 – 10% cao hơn so với S. cerevisiae trên cùng một lƣợng glucose lên men. Vi khuẩn Z. mobilis là loại vi sinh vật không gây độc hại cho con ngƣời và không đòi hỏi những điều kiện nuôi cấy ngặt nghèo nhƣ nhiều vi khuẩn khác. Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất thì S. cerevisiae vẫn là vi sinh vật đƣợc lựa chọn [158,51].
1.2.4.2. Vi sinh vật lên men xylose
Một trong những khó khăn khi lên men dịch thủy phân sinh khối thực vật là rất ít vi sinh vật có khả năng lên men xylose (chiếm 20 – 30% lƣợng đƣờng tạo ra). Cả nấm men S. cerevisiae, Pichia stipitis và vi khuẩn Z. mobilis đều không có khả năng này. Trong số hơn một nghìn loài nấm men đƣợc biết chỉ có 4 loài có khả năng lên men xylose ở các mức độ khác nhau. Hiện nay nấm men Pachysolen tannophilus đang đƣợc sử dụng trong lên men dịch thủy phân hemicellulose (sản phẩm chủ yếu là xylose) để tạo etanol. Tuy nhiên nấm men P. tannophilus không tích lũy đƣợc quá 2 % etanol trong canh trƣờng và điều này là hạn chế rất lớn trong sản xuất. Chính vì những lý do đó hiện nay có nhiều nhóm nghiên cứu đang tập trung vào cải thiện đặc tính chủng giống theo hƣớng chuyển các gene cần thiết cho khả năng lên men xylose vào S. cerevisiae.
1.2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men etanol
a. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon
Cacbon là thành phần cơ bản xây dựng nên tế bào nấm men. Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy, các hợp chất chứa cacbon chiếm vị trí quan trọng hàng đầu cho sự sống của nấm men, chúng đáp ứng đƣợc ba nhu cầu chính sau đây: i) Sản sinh năng lƣợng; ii) Tạo thành các tiền chất; iii) Thực hiện các quá trình oxy hóa khử để biến những tiền chất thành những sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trƣờng [51]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ
Trong quá trình sống, nấm men cũng nhƣ tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ để xây dựng tế bào. Hầu hết các thành phần của tế bào đều chứa nitơ (protein, nucleotide,
29 enzyme…). Các thành phần này đƣợc tạo thành nhờ quá trình trao đổi cacbon và nitơ. Do đó môi trƣờng nuôi cấy nấm men cần phải cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hóa. Việc lựa chọn nguồn nitơ sử dụng cũng hết sức quan trọng, nấm men đồng hóa các muối amoni, urê và nguồn nitơ hữu cơ đều tƣơng tự nhau và gắn với việc tách NH3 rồi hấp thụ vào tế bào [4].
c. Ảnh hƣởng của nguồn phosphate
Phosphat đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của tế bào nấm men. Phosphate chiếm 1/2 tổng lƣợng chất tro và tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân, hạt nhiễm sắc thể, các enzyme… Các hợp chất hữu cơ quan trọng trong tế bào là hexo-mono phosphate, axit glycerin phosphate, dihydroxylaceto phosphate, các nucleic, co-enzyme, riboflavin, phospho-lipid. Vì vậy, trong môi trƣờng nuôi cấy phải đủ lƣợng phosphate để nấm men phát triển bình thƣờng. Sự thay đổi các hợp chất phosphate của môi trƣờng sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp một số thành phần của tế bào có chứa phosphate tế bào chất và nhân. Ngoài ra, phosphate trong môi trƣờng còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzyme đồng hóa các hợp chất cacbon.
Nguồn phosphate sử dụng trong nuôi cấy nấm men thƣờng là các hợp chất phosphate hữu cơ (bã rƣợu, cao ngô…) và vô cơ (các muối phosphate, mono hoặc di- kali phosphate, amon phosphate, super phosphate…). Nấm men có nhu cầu lớn về phosphate để phát triển và tạo ra mật độ tế bào cần thiết nhằm đẩy nhanh quá trình khởi động lên men cũng nhƣ rút ngắn thời gian lên men. Sau giai đoạn đầu thì sự có mặt của oxy lại là tác nhân kìm hãm lên men rƣợu gây giảm hiệu suất của quá trình.
Đối với quá trình nhân giống (lên men thu sinh khối) sự khuấy trộn hay sục khí rất có lợi bởi ngoài việc cung cấp oxy cho nấm men nó còn có tác dụng đẩy nhanh các chất độc hại (sản phẩm trao đổi chất) ra khỏi môi trƣờng. Mặt khác sự đảo trộn còn có tác dụng giúp tăng cƣờng diện tích tiếp xúc giữa tế bào và môi trƣờng dịch thể đồng thời ngăn cản sự kết lắng của tế bào. Để thực hiện đƣợc điều này, trong các thiết bị lên men ngƣời ta lắp đặt hệ thống các cánh khấy và hệ thống sục khí. Không khí trƣớc khi bơm vào nồi lên men phải xử lý để đảm bảo sạch về cơ học (không bụi) và vô trùng bằng cách cho đi qua hệ thống lọc (màng lọc).
d. Ảnh hƣởng của lƣợng giống tiếp
Trong sản xuất etanol, lƣợng men giống thƣờng chiếm 10% tổng thể tích dịch lên men. Lƣợng men giống tăng lên thì quá trình lên men cũng tăng nhƣng đến một giới hạn nào đó thì sự tăng lƣợng men giống không làm tăng quá trình lên men nữa mà khi đó sẽ xảy ra sự cạnh tranh của nấm men về môi trƣờng dinh dƣỡng. Kết quả là hiệu suất lên men giảm xuống.
e. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố tác động rất lớn đến sinh trƣởng và phát triển của nấm men. Với vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng đều có khoảng nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của mình. Đối với nấm men S. cerevisiae nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của chúng là 28– 30°C. Khi nhiệt độ thấp tốc độ phát triển của nấm men giảm và nấm men
30 hoàn toàn bị ức chế ở 2 – 5°C. Khi nhiệt độ quá cao, sự phát triển của nấm men cũng bị ức chế. Nhiệt độ lớn hơn 40°C, thì enzyme của nấm men bị giảm hoạt tính đi 50% và sự phát triển của nấm men ngừng lại và tế bào bắt đầu chết. Chỉ một số rất ít chủng nấm men có khả năng lên men ở nhiệt độ lớn hơn 40°C, nấm men chết hoàn toàn khi nhiệt độ lên tới 60°C.
f. Ảnh hƣởng của pH
pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đối với hoạt động sống của tế bào nấm men, tác động trực tiếp tới quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. pH làm điện tích màng tế bào chất thay đổi, dẫn đến sự thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, ảnh hƣởng đến quá trình hấp thụ các loại chất dinh dƣỡng. pH có thể làm thay đổi hoàn toàn chiều hƣớng của các phản ứng hóa học trong tế bào. Ngoài ra, pH còn ảnh hƣởng đến sự phân ly của các cấu tử thức ăn có trong môi trƣờng. Trong điều kiện lên men etanol, pH tối ƣu để lên men etanol là 4,5 - 5,2. Nếu tăng pH thì dịch lên men dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin sẽ tạo nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men. Vì vậy, việc chủ động điều chỉnh pH môi trƣờng luôn ở giá trị thích hợp trong suốt quá trình lên men là rất cần thiết.