Thủy phân sinh khối lignocellulose (quá trình phân hủy, thối, mục) trong tự nhiên xảy ra do tác động của vi sinh vật nhƣ là một phần của chu trình carbon [130,78]. Để thủy phân hoàn toàn lignocellulose cần phải có sự tác động hiệp đồng của một phức hệ enzyme phân giải cả các mạch cellulose lẫn các thành phần lignin, hemicellulose bao bọc và liên kết các mạch cellulose lại với nhau.
Các cellulase, xylanase đã đƣợc thƣơng mại hóa khá nhiều và đƣợc tối ƣu hóa cho các quá trình sử dụng chủ yếu cho mục tiêu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi hoặc phân hủy rác thải. Tuy vậy, thủy phân nguyên liệu lignocellulose là một ứng dụng mới cần có sự nghiên cứu đầy đủ. Trong vòng 20 năm trở lại đây, nghiên cứu về hệ enzyme thủy phân lignocellulose thu hút sự quan tâm của đông đảo các nhà khoa học trên thế giới. Các vấn đề đƣợc tập trung nghiên cứu bao gồm: khả năng tổng hợp enzyme, đặc tính của enzyme, khả năng và cơ chế hoạt động của hệ thống đa enzyme. Các enzyme đƣợc kỳ vọng có hiệu quả thủy phân cao hơn, hoạt động ổn định hơn, chịu nhiệt, chịu axit và ít nhạy cảm hơn với sản phẩm thủy phân, chất ức chế, và đặc biệt là khả năng sử dụng phối hợp các enzyme này
19 trong phân giải lignocellulose [120,162]. Có thể giảm chi phí sản xuất enzyme bằng cách chọn chủng vi sinh vật có năng lực tổng hợp enzyme tốt với tính đặc hiệu enzyme cao, có khả năng chịu nhiệt (có khả năng làm giảm lƣợng enzyme cần sử dụng, giúp giảm giá thành thủy phân) và không bị ức chế bởi các sản phẩm thủy phân của chúng. Các chủng tiềm năng nhƣ vậy có thể có đƣợc bằng cách lựa chọn tạo chủng tái tổ hợp các vi sinh vật mới hay cải biến chúng bằng các kỹ thuật đột biến hay các kỹ thuật di truyền.
1.2.3.1. Hệ enzyme cellulase
Trong tự nhiên, hỗn hợp các enzyme thủy phân và oxy hóa do các nấm mốc và vi khuẩn tạo ra có khả năng phân giải tập hợp các thành phần cấu trúc thành tế bào thực vật lignocellulose [102,56]. Hàng loạt vi sinh vật sinh enzyme đã đƣợc phân lập, trong số đó, các chủng đƣợc xem là tổng hợp các enzyme phân giải lignocellulose hiệu quả nhất thuộc về Trichoderma reesei và các dạng đột biến của nó [89,47,64].
Cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp.
Cellulose bị thủy phân bởi một phức hệ cellulase, chủ yếu gồm 3 loại enzyme: 1) Endoglucanase, thƣờng đƣợc gọi là carboxymethylcellulose (CM)-cellulases, thủy phân liên kết β-1,4 glucoside của cellulose tinh thể một cách ngẫu nhiên, tạo ra các đầu không khử, giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose, mở mạch cho enzyme cellobiohydrolases; 2) Exoglucanase, thƣờng gọi là cellobiohydrolases, cắt chuỗi cellulose từ đầu không khử giải phóng ra chủ yếu các cellobiose.; 3) β-1,4 glucosidase thủy phân cellobiose và các cello-oligosacchacaride thành glucose và bị kìm hãm mạnh bởi chính sản phẩm thủy phân của nó là glucose (hình 1.6) [38].
Hình 1.6. Thủy phân cellulose bằng cellulase
Các enzyme cellulase từ vi khuẩn đƣợc xem là bền nhiệt và có thể hoạt động trong môi trƣờng pH kiềm hơn so với nấm mốc [80, 38]. Các vi khuẩn có khả năng tạo cellulase
20 bao gồm các vi khuẩn hiếu, yếm khí, vi khuẩn dạ cỏ nhƣ Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus, Bacteriodes, Erwinia, Acetovibrio, Microbispora, và Streptomyces [30]. Cellulase từ Cellulomonas fumi và
Thermomonospora fusca đƣợc nghiên cứu khá kỹ. Mặc dù các vi khuẩn nhƣ Clostridium thermocellum và Bacteroides cellulosolvens có thể tạo đƣợc các enzyme có độ đặc hiệu cao, nhƣng lƣợng enzyme tạo ra không đủ lớn. Do các vi khuẩn yếm khí có tốc độ phát triển thấp và yêu cầu điều kiện nuôi cấy phức tạp, hầu hết các enzyme thƣơng mại đi từ nấm mốc [45].
Các nấm mốc sản xuất cellulase bao gồm và các loài thuộc Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum, Penicillium, Sclerotium và Phanerochaetae [48,45]. Trong số các nấm mốc kể trên, Trichoderma là nấm mốc đƣợc nghiên cứu nhiều nhất do đặc tính hấp dẫn của hệ enzyme cellulase và các enzyme hỗ trợ sự phân giải nguyên liệu lignocellulose. T. reesei có khả năng tổng hợp một hệ enzyme cellulase bao gồm 9 enzyme của 3 nhóm: 2−exoglucanases, 5−endoglucanases và 2−β−glucosidases. Tuy vậy β−glucosidase của Trichoderma thƣờng bị thiếu hụt hoặc hoạt động không hiệu quả.
Cellulase thƣơng mại thông dụng nhất hiện nay là của Novozymes và Genecor. Chúng đƣợc dùng ở tỉ lệ 10 FPU/g cellulose [111] để đạt đƣợc hiệu quả thủy phân cao trong 48–72h [53]. Endoglucanase của Erwinia chrysanthemi P86021 đƣợc biểu hiện trong
Escherichia coli KO11 [152] thu đƣợc 3200 IU endoglucanase/lít dịch lên men. Endoglucanase bền nhiệt của Acidothermus cellulolyticus cũng đƣợc biểu hiện trong
Arabidopsis thaliana [163], khoai tây [39] và trong lá thuốc lá [59]. Các nghiên cứu cho rằng 100 g/l mùn lignocellulose cần nồng độ enzyme 10-20 FPU/g cơ chất để thủy phân với hiệu quả thủy phân đạt 90% trong vòng 70-110h [103].
Trong thủy phân cellulose, tốc độ chung của quá trình thủy phân cellulose phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của β-glucosidase. Thí nghiệm khi cho T. reesei QM9414 thủy phân cellulose tinh khiết ở các nồng độ cellobiose ban đầu khác nhau, đã nhận thấy nếu tăng nồng độ cellobiose lên sẽ làm giảm đáng kể tốc độ thủy phân. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh cellulase, đặc biệt T. reesei, T. viride, thƣờng bị thiếu hụt β- glucosidase, điều này dẫn đến sự tích tụ cellobiose trong dịch thủy phân và làm giảm đáng kể tốc độ của quá trình đƣờng hóa. Do cellobiose là chất ức chế hoạt động của cellulase nên bổ sung β-1,4 glucosidase vào dung dịch enzyme của T. reesei cho hiệu quả thủy phân tốt hơn. Thí nghiệm bổ sung 10 lần lƣợng β-1,4 glucosidase ngoại bào của A. niger vào phức hệ cellulase của T. reesei làm tăng 20% tốc độ chuyển hóa cellulose thành glucose trong thời gian 24 giờ [102]. Cũng tƣơng tự, trong thí nghiệm khi phức hệ cellulase của
Penicillium decumben JU-A10 đƣợc bổ sung β-1,4 glucosidase của A. niger L22 hiệu suất thu hồi etanol tăng lên 42% so với khi sử dụng một mình phức hệ cellulase của P. decumben JU-A10 cho quá trình đƣờng hóa và lên men đồng thời dịch nƣớc thải của quá trình xử lí bột giấy [155].
Do tầm quan trọng của enzyme β-glucosidase trong quá trình đƣờng hóa và ứng dụng của nó trong các ngành công nghiệp, việc nghiên cứu tạo ra các chế phẩm mang enzyme tái tổ hợp đã đƣợc quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm nay. Trình tự gen mã hóa cho enzyme β−glucosidase đã đƣợc xác định trong nhiều loài sinh vật khác nhau ví dụ Candida
21
pelliculosa, Kluyveromyces fragilis, Saccharomycopsis fibuligera, T. reesei, A. aculeatus, Volvariella volvacea. Các gen mã hóa các enzyme β-glucosidase với kích thƣớc khác nhau đã đƣợc tách dòng từ vi khuẩn (Acetobacter xylinum ATCC 23769, 2200 bp), nấm men (Saccharomycosis fibuligera, 3215 bp) và nấm mốc (Aspergillus niger; 2583 bp),… đƣợc biểu hiện thành công trên các thể chủ khác nhau nhƣ S. cerevisiae, Pichia pastoris và E. coli [41,29,74,126,125].
Hoạt tính của enzyme β−glucosidase tái tổ hợp đƣợc xác định có thể tƣơng đƣơng hoặc cao hơn rất nhiều so với enzyme tự nhiên (gấp 37 lần) [67]. Hoạt tính của enzyme tái tổ hợp cũng khác nhau tuỳ thuộc vào từng chủng biểu hiện. Enzyme β−glucosidase khi đƣợc biểu hiện trong Saccharomyces cerevisiae chỉ có hoạt tính 1,9 U/mg protein, tuy nhiên khi đƣợc biểu hiện trong chủng Pichia pastoris lại cho hoạt tính rất cao 124 U/mg protein [41]. Mức độ biểu hiện của enzyme β−glucosidase tái tổ hợp cũng khác nhau tuỳ thuộc từng chủng, chủng vật chủ và hệ vector biểu hiện. Mức độ biểu hiện của enzyme β−glucosidase trong hệ vector pPICZA và vật chủ Pichia pastoris KM71H chỉ là 3,9 U/ml canh trƣờng, trong khi đó với hệ vector pPIC9K và vật chủ Pichia pastoris KM71 là 28,5 U/ml canh trƣờng nuôi, với hệ vector pHIL-S1 và vật chủ Pichia pastoris GS115 là 62 U/ml canh trƣờng nuôi. Trong một số nghiên cứu, enzyme β−glucosidase tái tổ hợp cũng đã đƣợc tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký và nghiên cứu một số đặc tính nhƣ độ bền nhiệt, nhiệt độ và pH tối ƣu [74]. Kết quả ngiên cứu cho thấy, enzyme tái tổ hợp có khả năng bền nhiệt và có dải pH hoạt động tƣơng đối rộng. Trong những năm gần đây, enzyme β−glucosidase tái tổ hợp đã bắt đầu đƣợc ứng dụng trong nhiều ngành công nghiêp. Enzyme β−glucosidase tái tổ hợp từ nấm mốc Aspergillus niger đã đƣợc ứng dụng trong sản xuất cồn và tăng hƣơng cho dịch quả [126]. Ngoài ra, gen mã hóa cho enzyme này từ chủng nấm men Saccharomycopsis fibuligera cũng đã đƣợc đƣa vào chủng nấm men công nghiệp không có khả năng sinh tổng hợp β−glucosidase Saccharomyces cerevisiae NAN- 27, hoặc chủng Zymobacter palmae tái tổ hợp mang gen mã hóa β−glucosidase đƣợc ứng dụng trong sản xuất cồn [157,125].
Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính enzyme cellulase, khả năng hấp thụ của enzyme vào cơ chất và tốc độ phản ứng. Thông thƣờng enzyme cellulase hoạt động ở dải nhiệt độ từ 30 – 70 ºC và nhiệt độ tối ƣu của nó là 50 – 60ºC. Trong tự nhiên, hoạt tính của cellulase khá bền, có thể chịu nhiệt độ lên tới 100ºC trong vài phút. Đối với pH, tuỳ thuộc vào enzyme tách chiết từ vi sinh vật nào mà pH hoạt động ở những giá trị khác nhau. Đối với hầu hết các enzyme từ nấm sợi, vi khuẩn đƣờng ruột, pH có giá trị trong vùng axit, còn với enzyme tách từ loài Humicola lại hoạt động tốt ở pH 7 – 9. Ngoài ra, hoạt động của enzyme cellulase có thể bị thay đổi dƣới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau. Các tác nhân và cơ chế ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme cellulase rất đa dạng và phong phú, có tác nhân là chất kìm hãm của enzyme này nhƣng lại là chất hoạt hoá của enzyme khác. Cùng một enzyme nhƣng từ các nguồn khác nhau thì cũng chịu sự điều hoà hoạt động bởi các yếu tố khác nhau, ví dụ nhƣ các ion kim loại khác nhau, các hóa chất nhƣ etanol, butanol, EDTA, aceton...
22 Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase thƣờng dùng để tăng chất lƣợng thực phẩm và thức ăn gia súc, tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật. Ngoài ra, trong sản xuất agar-agar, tác động của cellulase sẽ làm tăng chất lƣợng agar-agar hơn so với phƣơng pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt là việc sử dụng cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân làm thức ăn gia súc [150]. Trong công nghiệp dệt cellulase có tác dụng chống quăn vải, làm mềm vải, làm sáng màu, chống bám trở lại và làm sạch. Đối với việc sản xuất giấy từ nguồn giấy phế liệu hiện đang rất phổ biến, việc sử dụng cellulase đang là hƣớng đi đúng đắn để hạn chế việc sử dụng hóa chất tẩy trắng, nhằm giảm chi phí sản xuất và bảo vệ môi trƣờng khỏi bị hủy hoại. Tuy nhiên, cellulase cũng là enzyme đƣợc nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn rất nhiều so với amylase và protease.
1.2.3.2. Hệ enzyme thủy phân hemicellulose (hemicellulase)
Song song với thủy phân cellulose, quá trình thủy phân hemicellulose còn lại trong phần carbohydrate dẫn đến phá hủy cấu trúc tổ hợp lignocellulose, hỗ trợ quá trình thủy phân cellulose và thúc đẩy quá trình đƣờng hóa hoàn toàn sinh khối. Hemicellulase bao gồm các enzyme rất khác nhau, thủy phân các cơ chất hemicellulose tƣơng ứng. Enzyme β- mannanases thủy phân mannan tạo các β-1,4-manno-oligomer mạch ngắn, và tƣơng tự các oligo này đƣợc thủy phân thành mannose nhờ β-mannosidase, α-L−arabinofuranosidase và α-L-arabinanase thủy phân arabinofuranoside cho tới arabinose. Nhiều enzyme thuộc hemicellulase có tính đặc hiệu cơ chất rộng, có khả năng thủy phân dẫn xuất xylans, xylooligomers và arabinans tại các liên kết glycozide ở vị trí O-5, O-2 và/hoặc O-3 [118]. Các hemicellulo-esterase nhƣ acetyl esterase thủy phân dẫn xuất acetyl hóa của xylose moieties, feruloyl esterase thủy phân liên kết este giữa arabinose ferulic acid gắn kết lignin với hemicellulose, giúp giải phóng hemicellulose và tăng khả năng thủy phân các hợp chất hemicellulose này [118]. Xylan là hợp chất phổ biến nhất trong số các hemicellulose, vì thế xylanase là một trong các enzyme có ý nghĩa quan trọng trong thủy phân các hemicellulose. Những enzyme tham gia phân hủy xylan gồm: endo-1-4 β-xylanase (EC 3.2.1.8) thủy phân liên kết β-1,4 glucosid trong mạch xylan tạo nên các mạch xylooligomer ngắn; β-xylosidase (EC 3.2.1.37) thủy phân các mạch xylooligomer thành xylose và arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) (hình 1.7) [79].
23 Trong vòng hai thập niên qua có rất nhiều nghiên cứu về xylanase từ vi khuẩn và nấm mốc. Các nghiên cứu đi từ phân lập các chủng tạo xylanase có hoạt lực cao, tách tinh sạch enzyme xylanase, đến tạo ra các chủng xylanase tái tổ hợp. Xylanase chủ yếu đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn gồm có các loài B. subtilis, Paenibacillus, B. pumilis, Aeromonas caviae, từ nấm men nhƣ Candida tropicalis, từ nấm mốc nhƣ T. reesei, T. koningii,
A.niger, A.usamii, A. oryzae, P. purpurogenum… Trong những năm gần đây nhiều nghiên cứu tập trung tạo ra xylanase tái tổ hợp sử dụng các sinh vật chủ khác nhau nhƣ E. coli, B. subtilis, A. kawachii, Pichia pastoris, nhờ đó hoạt lực của enzyme đã đƣợc nâng cao lên nhiều lần so với chủng gốc ban đầu [108]. Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng biểu hiện gen xylanase của B. circulans nhờ B. subtilis có nhiều ƣu điểm hơn biểu hiện trên E. coli: hoạt lực của enzyme tái tổ hợp ở B. subtilis (1120 U) cao hơn 14 lần so với ở E. coli (79U) [115]. Nguyên nhân của sự tăng lên này là do có vật chủ tƣơng đồng do đó nó tăng quá trình phiên mã, dịch mã cũng nhƣ ổn định của gen biểu hiện.
Quá trình thủy phân sinh khối bằng enzyme thƣờng đƣợc tiến hành với hỗn hợp các enzyme khác nhau nhằm tăng tốc cho phản ứng thủy phân đồng thời tổ hợp gồm ba thành phần là cellulose, hemicellulose, lignin...để nâng cao hiệu quả thủy phân cuối cùng. Sau quá trình TXL sinh khối bằng các tác nhân khác nhau nhằm tách loại lignin thì hỗn hợp enzyme sử dụng cho thủy phân phần carbohyrate còn lại thƣờng là hỗn hợp enzyme cellulase và xylanase (thủy phân xylan).
Giảm tiêu hao năng lƣợng, khắc phục ảnh hƣởng đến môi trƣờng, vận hành quá trình đơn giản, và không độc hại là các ƣu điểm lớn của thủy phân sinh khối bằng enzyme so với quá trình thủy phân bằng axit. Tuy nhiên, các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đều cho thấy công nghệ thủy phân bằng enzyme chuyển hóa sinh khối thành đƣờng phụ thuộc rất nhiều vào quá trình TXL nguyên liệu ban đầu nhƣ kích thƣớc nguyên liệu, mức độ lẫn các tạp chất nhƣ lignin, các chất trích ly, các chất vô cơ, cấu trúc của sinh khối sau TXL...
1.2.3.3. Hệ enzyme thủy phân pectin
Pectin là thành phần đứng thứ ba về khối lƣợng trong nhóm polysaccharide cấu thành nên vách tế bào thực vật. Tƣơng tự pectin cũng có thể đƣợc chuyển hóa thành các dạng đƣờng hòa tan, etanol hay biogas. Một số enzyme có khả năng thủy phân pectin nhƣ: polymethylgalacturanosidase, exopolygalacturonase và exopolygalacturanosidase hydrolase. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguồn enzyme đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay là từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger. Hiện nay, các thế hệ enzyme cũ đƣợc thay thế dần bằng các hệ enzyme mới chịu nhiệt, chịu các điều kiện hóa học khắc nghiệt hơn. Hơn nữa, các nghiên cứu về phức hợp cellulosome của các vi khuẩn kỵ khí đang dần mở ra một con đƣờng mới nhằm tăng hiệu quả thủy phân của tổ hợp sinh khối lignocellulose của các loại nguyên liệu thực vật.
1.2.3.4. Hệ enzyme phân hủy lignin
Hai họ enzyme chính tham gia vào sự phân hủy lignin trong tự nhiên là peroxidase và laccase. Các enzyme peroxidase và laccase đƣợc tìm thấy trong thực vật, nấm, một số loài xạ khuẩn, vi khuẩn và côn trùng, phần lớn từ các địa điểm giàu các hợp chất lignocellulose nhƣ tầng gỗ mục trong rừng, compost lá cây rừng, phụ phẩm nông nghiệp,
24 nƣớc thải hoặc đất thuộc khu vực sản xuất công nghiệp, nhà máy chế biến thực phẩm, nhà máy giấy... Các enzyme tinh khiết đã đƣợc tách chiết và xác định các đặc điểm hóa sinh. Gene mã hóa các loại enzyme trên đã đƣợc phân lập và biểu hiện trong các hệ thống biểu hiện nhƣ vi khuẩn E. coli, nấm men S. cerevisiae, nấm sợi Aspergillus, Trichoderma v.v. [150].