Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đoán ung thư vú

Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đoán ung thư vú.ung thư vú dần trở thành một trong hai loại ung thư phổ biến nhất và gây tử vong nhiều nhất ở phụ nữ, tương tự như ung thư tiền liệt tuyến ở nam giới.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đồ án tốt nghiệp này, kiến thức học tích lũy năm qua, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Lê Lý Thùy Trâm tận tình bảo hướng dẫn suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đặng Đức Long ThS Tạ Ngọc Ly đóng góp ý kiến, giúp đỡ tơi hồn thiện đồ án tốt nghiệp Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến thầy, giáo phụ trách phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ sinh học KS Võ Công Tuấn KS Phạm Thị Kim Thảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt thí nghiệm q trình làm đồ án tốt nghiệp Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cám ơn chân thành đến anh, chị Trường Cao đẳng Lương thực Thực phẩm, Trung tâm Y tế Dự phòng Bệnh viện Ung thư Đà Nẵng hỗ trợ tơi việc sử dụng máy móc, thiết bị liên quan đến đề tài tốt nghiệp Cuối tơi xin cảm ơn bạn nhóm sinh viên nghiên cứu ngành Công nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ chia kinh nghiệm hữu ích để tơi hồn thành tốt cơng việc Trong thời gian thực đề tài tốt nghiệp, kiến thức thân hạn hẹp nên khó tránh khỏi hạn chế thiếu sót Vì tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy cơ, bạn bè để đồ án tơi hồn chỉnh Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình, q báu thầy bạn bè Đà Nẵng, ngày 01 tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Đinh Thị Kim Ngọc SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC Lớp: 10SH – MSV: 107261101136 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM MỤC LỤC SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC Lớp: 10SH – MSV: 107261101136 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM DANH MỤC HÌNH VẼ ST T Hìn h 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 10 1.10 11 1.11 12 2.1 13 14 2.2 2.3 15 2.4 16 17 2.5 2.6 18 2.7 19 2.8 20 2.9 21 2.10 22 2.11 23 2.12 24 2.13 25 3.1 26 27 28 29 30 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Tên hình vẽ Trang Cấu tạo bầu vú có tế bào ung thư Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú Cấu trúc protein HER2 Cấu trúc kháng thể Các cách gắn kết phân tử sinh học với hạt nano Gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine-carboxylic Gắn kết nhờ tạo cặp sulfhydryl-amine Gắn kết nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa phần Fc kháng thể Gắn kết khơng hóa trị hạt nano silica gắn streptavidin với kháng thể biotin hóa Mơ hình thiết bị cảm ứng sinh học điện từ Cơ sở phương pháp cố định kháng thể lên MNPs thơng qua hoạt hóa bề mặt APTES – GA Quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs APTES – GA Quy trình gắn Streptavidin lên MNPs đo UV - VIS Quy trình đo phản ứng màu enzyme HRP chất TMB Kiểm tra diện kháng thể sau gắn lên MNPs Quy trình khảo sát diện kháng thể lên MNPs Quy trình xác định hoạt tính kháng thể sau cố định lên MNPs Hình minh họa phương pháp xác định hoạt tính kháng thể tự Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học kháng thể tự Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học kháng thể cố định Quy trình khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs Quy trình khảo sát khả bắt chước enzyme peroxydase MNPs Quy trình khảo sát hoạt tính kháng thể dựa khả bắt chước enzyme peroxydase MNPs Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giá trị OD280nm với nồng độ Streptavidin Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên So sánh hoạt tính kháng thể tự kháng thể cố định Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau gắn lên MNPs Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs 10 10 SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC Lớp: 10SH – MSV: 107261101136 11 11 12 14 15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 30 33 34 37 38 40 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM DANH MỤC BẢNG BIỂU ST T Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 10 3.9 3.10 Tên bảng Biến thiên giá trị OD280nm theo nồng độ Streptavidin Giá trị OD450nm mẫu đối chứng mẫu thử nghiệm Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể tự Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể cố định So sánh Delta OD450nm kháng thể tự cố định nồng độ pha loãng Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng nồng độ kháng thể SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC Lớp: 10SH – MSV: 107261101136 Trang 30 32 33 34 36 36 36 38 39 41 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÍ HIỆU APTES EDAC ELISA FDA GA HER2 HRP MES MNPs OD PBS SMCC TMB TÊN ĐẦY ĐỦ 3-Aminopropyltriethoxysilane 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ) Glutaraldehyde Human Epidermal growth Receptor Horseradish peroxydase 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid monohydrate Magnetic nanoparticles (Hạt nano sắt từ) Optical Density Đệm Phosphate pH = 7.4 Succinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC Lớp: 10SH – MSV: 107261101136 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM TĨM TẮT Cơng nghệ sinh học cơng nghệ nano đóng vai trị quan trọng nhiều lĩnh vực liên quan đến phát triển khoa học, xã hội sống, đặc biệt việc cố định phân tử sinh học acid nucleic, enzyme hay kháng thể, lên hạt nano sắt từ (MNPs) để phục vụ cho mục đích chẩn đoán y sinh Trong phạm vi đề tài tốt nghiệp này, khảo sát việc cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư vú Với mục tiêu này, bề mặt hạt nano sắt từ amin hóa 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) sau xử lý Glutaraldehyde (GA) trước gắn kết với kháng thể Kết cho thấy phương pháp đem lại hiệu suất gắn cao kháng thể cịn hoạt tính sinh học Từ khóa: hạt nano sắt từ; kháng nguyên HER2; kháng thể; ung thư vú ABSTRACT Biotechnology and Nanotechnology play important roles in many fields related to the development of science, society and life, especially, in the immobilization of a variety of molecules such as nucleic acid, enzymes or antibodies on ferric magnetic nanoparticles (MNPs) serving the biomedical diagnostic purposes In this study, we examine the immobilization of antibody anti – HER2 on ferric magnetic nanoparticles to diagnose breast cancer For this purpose, the surface of ferric magnetic nanoparticles is covered by (-NH2) group with 3aminopropyltriethoxysilane (APTES) before treating with glutaraldehyde (GA) to link to antibody The result illustrates although this method brings high performance of the antibody anti – HER2 immobilization on ferric magnetic nanoparticles, antibody has low level of bioactivity to capture HER2 antigen Key words: antibody; ferric magnetic nanoparticles; HER2 antigen; breast cancer SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC Lớp: 10SH – MSV: 107261101136 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM LỜI MỞ ĐẦU Từ năm đầu kỉ 21 đến nay, ung thư vú dần trở thành hai loại ung thư phổ biến gây tử vong nhiều phụ nữ, tương tự ung thư tiền liệt tuyến nam giới Trên giới nói chung, Việt Nam nói riêng, số thống kê năm số lượng người mắc bệnh ung thư vú tăng nhanh ngưỡng cao, đáng báo động HER2 loại thụ thể thuộc họ yếu tố phát triển biểu mơ, có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trị quan trọng q trình sinh trưởng biệt hoá tế bào Sự biểu mức HER2 biến đổi tế bào thành dạng ác tính làm tăng q trình hình thành khối u Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân mắc ung thư vú có khuếch đại gen HER2 biểu mức gen tế bào ung thư Chính điều làm cho HER2 trở thành thị quan trọng việc chẩn đoán ung thư vú Mặc dù ngày có nhiều phương pháp áp dụng để sớm phát điều trị bệnh quái ác số người chết năm giảm lượng nhỏ Nguyên nhân phần khối u phát chúng hình thành, tăng kích thước di Vì vậy, việc phát sớm đóng vai trị quan trọng điều trị ung thư vú Trên sở này, nhóm nghiên cứu kết hợp mơn Cơng nghệ sinh học Điện tử viễn thông trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đề xuất thiết kế thiết bị đo tín hiệu từ dựa hạt nano sắt từ cố định kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2, nhằm tìm phương pháp chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú Trong phạm vi đề tài này, bước đầu khảo sát khả cố định kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ mà đảm bảo giữ nguyên hoạt tính sinh học kháng thể Đề tài “Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đoán ung thư vú” tiền đề cho việc tìm cơng cụ giúp chẩn đốn ung thư vú sớm với hy vọng giúp bệnh nhân sớm phát để điều trị bệnh cách hiệu SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ag 1.1 Bệnh ung thư vú 1.1.1 Khái niệm chung bệnh ung thư vú Ung thư vú hai loại ung thư phổ biến gây chết nhiều phụ nữ, theo sau ung thư cổ tử cung Thường già, từ độ tuổi 40 trở đi, tế bào bất thường hay gọi tế bào ung thư vú phát sinh từ biểu mô ống tuyến hay biểu mô tiểu thùy Nếu không chữa trị sớm, tế bào ung thư phát triển nhanh chóng, tạo thành khối u ác tính Trong q trình phát triển, từ khối u cho tế bào ung thư vào mạch bạch huyết, lan tới hạch bạch huyết Có tế bào ung thư theo mạch máu để xâm nhập quan nội tạng (gan, phổi, óc ) hay xương, dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm chết người [2] Theo ước tính, từ tế bào hình thành khối u đến phát khối u khoảng cm khoảng từ – năm khối u có kích thước từ – cm thời gian trung bình khoảng tháng, thời gian cần có chữa trị sớm Phụ nữ trẻ mắc ung thư vú, xuất độ (tần xuất, độ xảy đến) thấp nhiều so với người lớn tuổi [2] Hình 1.1 Cấu tạo bầu vú có tế bào ung thư [15] SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú [14] 1.1.2 Tình hình mắc bệnh ung thư vú giới Việt Nam Mỗi năm có khoảng 1.3 triệu người chẩn đoán mắc bệnh ung thư vú khoảng 465,000 người chết bệnh Ở Mỹ, năm 2009, tỉ lệ ung thư vú phụ nữ 160/100,000 Ở Châu Âu, năm 2009 có khoảng 3.2 triệu trường hợp ung thư chẩn đốn 1.8 triệu trường hợp tử vong ung thư Trong đó, loại ung thư thường gặp ung thư vú (13.5%), sau ung thư đại trực tràng (12.9%) ung thư phổi (12.1%) [17] Ở Việt Nam, theo ghi nhận tỉ lệ mắc bệnh ung thư vú có xu hướng tăng dần Ở Hà nội, năm 2001, tỉ lệ ung thư vú phụ nữ 20.3/100,000 trước tăng lên 29.7/100,000 vào giai đoạn 2008 – 2011 Ở Thành phố Hồ Chí Minh, tỉ lệ tăng từ 11.7 (năm 1997); 16.1 (năm 1998); 19.2 (năm 1999) đến 19.4/100,000 (năm 2003) đến năm 2011 tăng lên đến mức 29.9/100,000 [17] 1.1.3 Phương pháp chẩn đoán điều trị bệnh ung thư vú Số lượng bệnh nhân mắc ung thư vú có xu hướng tăng toàn giới số ca tử vong bước giảm dần nhờ thành tựu đạt chẩn đoán điều trị bệnh ung thư vú Một số phương pháp thơng dụng chẩn đốn ung thư vú bao gồm chẩn đoán lâm sàng (bệnh nhân thường xuyên kiểm tra nhà siêu âm kết chẩn đoán tốt hơn), chụp nhũ ảnh, chọc hút dịch tế bào sinh thiết tế bào vú [13] Đối với việc điều trị, bệnh nhân xạ trị, hóa trị kết hợp với phẫu thuật Tuy nhiên, phương pháp điều trị ảnh hưởng lên quan bình thường xung quanh khối u nên nhiều hạn chế chiến SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM chống lại bệnh quái ác Sau tiến hành hóa trị, sức đề kháng thể bị suy giảm Hơn nữa, số trường hợp áp dụng biện pháp hóa trị làm tổn hại đến tim, gan Đó chưa kể, biện pháp truyền thống điều trị ung thư tốn Chính mà việc chẩn đốn sớm đtơi lại tia hy vọng lớn cho bệnh nhân mắc ung thư vú để họ tiếp tục sống [13] Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú [14] 1.2 Tổng quan kháng nguyên HER2 1.2.1 Cấu trúc kháng nguyên HER2 HER2 (Human Epidermal growth Receptor) loại thụ thể thuộc họ yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trị quan trọng q trình sinh trưởng biệt hố tế bào Cho đến chưa tìm thấy ligand đặc hiệu HER2; nhiên tạo dạng nhị hợp (dimer) với thân với thụ thể khác họ để hình thành đồng thụ thể thúc đẩy đường truyền tín hiệu [2] Sự khuếch đại gen HER2 nhiễm sắc thể 17 dẫn đến tăng biểu thụ thể HER2 bề mặt tế bào ung thư vú Sự biểu mức HER2 biến đổi tế bào thành dạng ác tính làm tăng trình hình thành khối u Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có khuếch đại gen HER2 biểu mức gen tế bào ung thư Chính điều khiến HER2 trở thành thị hữu hiệu để chẩn đoán sớm đích cơng cho liệu pháp điều trị miễn dịch [2] Protein HER2 có khối lượng phân tử 185 kDa, gồm phần chính: SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Quy trình tiến hành sau: + + Chuẩn bị giếng phủ kháng thể thứ kháng kháng nguyên HER2 Thêm 50 µl kháng nguyên (nồng độ 6ng/ ml) vào giếng, ủ 2,5 nhiệt độ phòng với điều kiện lắc nhẹ + Loại bỏ phần không liên kết cách rửa lần với 200 µl Wash buffer 1X + Thêm 50 µl MNPs có gắn kháng thể biotin hóa với nồng độ pha lỗng khác (0, 320X, 160X, 80X, 40X) so với nồng độ kháng thể gốc vào giếng, ủ nhiệt độ phòng + Lặp lại bước rửa, loại dịch huyền phù + Thêm 40 µl TMB 10 µl H 2O2 vào giếng, ủ nhiệt độ phòng 30 phút tối, lắc nhẹ + Thêm 50 µl Stop solution vào giếng, đo OD 450 nm SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 34 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định nồng độ MNPs Trước hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ liên kết cộng hóa trị APTES – GA trình bày phần phương pháp nghiên cứu (mục 2.2.1) cần biết nồng độ hạt nano sắt từ Do đó, tiến hành đo nồng độ hạt nano sắt từ sau: + + + Chuẩn bị đĩa petri sấy khô khối lượng không đổi (m1) Sau hút vào đĩa ml hạt nano sắt từ đựng dung dịch bảo quản Sấy khô đến dịch bảo quản bay hết đạt khối lượng không đổi (m2) Thu kết sau: Khối lượng hạt nano sắt từ tính ml dung dịch = m - m1 = 13.2629 – 13.2392 = 23.7 (g) Từ suy nồng độ hạt nano sắt từ ban đầu 23.7 g/l 3.2 Hoạt hóa bề mặt MNPs liên kết cộng hóa trị APTES – GA Trong phạm vi đề tài này, đối tượng nghiên cứu chọn hạt nano sắt từ phủ lớp SiO2 kháng thể có chất protein, có gốc –COOH –NH tự Để đảm bảo kháng thể cịn hoạt tính sau cố định lên hạt nano sắt từ, không tác động trực tiếp lên kháng thể mà tiến hành hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ Tuy nhiên, muốn gắn kháng thể lên bề mặt MNPs đòi hỏi phải có liên kết chặt chẽ, chẳng hạn liên kết cộng hóa trị Vì vậy, phạm vi đề tài này, sử dụng phân tử APTES GA cầu nối để gắn kết kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2 lên MNPs Để kiểm tra xem phương pháp hoạt hóa có hiệu hay không, phải xác định diện hoạt tính sinh học kháng thể sau gắn lên MNPs Trước tiên, tiến hành khảo sát với phân tử sinh học có chất protein với kháng thể, Streptavidin 3.2.1 Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs, đo UV – VIS Sau hoạt hóa MNPs APTES – GA, tiến hành gắn Streptavidin lên MNPs Có nhiều phương pháp để định lượng Streptavidin, số tơi chọn phương pháp đo UV – VIS đo bước sóng 280nm Để kiểm tra độ tin cậy SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 35 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM phương pháp đo, tiến hành xây dựng đường chuẩn với Streptavidin nồng độ khác (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/ml) thu kết sau: Bảng 3.1 Biến thiên giá trị OD280nm theo nồng độ Streptavidin Nồng độ Streptavidin 0.00 (mg/ml) OD280nm lần1 0.137 OD280nm lần2 0.137 OD280nm lần3 0.138 OD280nm trung 0.137 bình Delta 0.000 OD280nm ± 0.0004 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 0.279 0.278 0.277 0.475 0.474 0.477 0.821 0.820 0.821 1.176 1.178 1.177 1.492 1.491 1.491 0.278 0.475 0.821 1.177 1.491 0.141 ± 0.0007 0.338 ± 0.0011 0.683 ± 0.0004 1.040 ± 0.0007 1.354 ± 0.0004 Từ bảng 3.1, xây dựng đồ thị thể tương quan tuyến tính độ hấp thụ OD280nm nồng độ Streptavidin sau: Hình 3.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giá trị OD280nm với nồng độ Streptavidin Qua bảng 3.1 hình 3.1, nhận thấy độ hấp thụ OD 280nm thay đổi theo nồng độ Streptavidin với phương trình y = 3.4422x – 0.0098 với độ tin cậy R = 0.9993 Kết cho thấy độ hấp thụ OD 280nm tuyến tính với nồng độ pha lỗng Streptavidin Do vậy, sử dụng phương pháp để kiểm tra khả cố định Streptavidin lên bề mặt hạt sắt từ hoạt hóa Trên sở đường chuẩn xây dựng, tiến hành đo dịch rửa trình cố định Streptavidin lên hạt nano sắt từ, từ nồng độ Streptavidin cho vào ban đầu tính tốn lượng Streptavidin gắn lên hạt nano sắt từ Tuy nhiên, qua kết thu được, nhận thấy lượng Streptavidin thu dịch rửa cao so với lượng Streptavidin cho vào ban đầu Kết cho thấy dịch rửa cịn có chứa protein khác ngồi Streptavidin, đó, phương pháp đo không phù hợp để xác định lượng Streptavidin gắn lên hạt nano sắt từ SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 36 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Do đó, tơi phải thử nghiệm với phương pháp khác đặc hiệu dựa phản ứng chuyển màu chất TMB nhờ enzyme HRP cố định Streptavidin để định lượng xác diện Streptavidin lên hạt sắt từ 3.2.2 Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs, dựa phản ứng màu enzyme HRP chất TMB Từ kết trình đo độ hấp thụ phương pháp UV – VIS (mục 3.2.1), tơi nhận thấy cịn tồn số hạn chế phương pháp đo khơng đặc hiệu cho loại protein đặc biệt Điều gây trở ngại lớn việc đánh giá độ tin cậy phép đo Do đó, tơi tiến hành thí nghiệm dựa phản ứng màu xảy enzyme HRP phân hủy chất TMB chuyển từ trạng thái không màu sang màu xanh dương tiến hành đo độ hấp thụ bước sóng 450nm Như với lượng Streptavidin – HRP gắn lên hạt nano sắt từ khác nhau, cường độ màu thu khác cho giá trị OD 450nm khác Từ đó, với thay đổi OD 450nm mẫu thử nghiệm mẫu đối chứng tơi chứng minh Streptavidin có gắn lên MNPs hay không? Kết thu sau: Bảng 3.2 Giá trị OD450nm mẫu đối chứng mẫu thử nghiệm Đối chứng Thử nghiệm Mẫu (MNPs – Streptavidin – HRP, (MNPs – Streptavidin – 0 t =100 C, phút) HRP) OD450nm lần 0.15 0.434 OD450nm lần 0.144 0.408 OD450nm trung bình 0.147 0.421 Delta OD450nm ± 0.003 0.274 ± 0.013 Với hai mẫu có lượng hạt nano sắt từ (135 µg) nồng độ Streptavidin – HRP (0.1 mg/ml) Qua bảng 3.2, nhận thấy sau biến tính Streptavidin – HRP nhiệt giá trị OD450nm thu nhỏ so với mẫu không bị biến tính với sai số kết đo tin cậy Từ kết luận rằng, có Streptavidin – HRP SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 37 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM gắn lên hạt nano sắt từ hoạt hóa bề mặt liên kết cộng hóa trị APTES – GA 3.3 Cố định kháng thể lên MNPs Sau có kết khảo sát việc cố định Streptavidin lên hạt nano sắt từ, tơi nhận thấy q trình hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ thành công, đồng thời tạo cầu nối với phân tử sinh học cần quan tâm có chất protein, mà Streptavidin – HRP Trên sở đó, hy vọng rằng, với chất protein, Streptavidin gắn hạt nano sắt từ kháng thể gắn Do đó, tơi áp dụng quy trình cho việc cố định kháng thể Và để chứng minh phương pháp có hiệu với kháng thể hay không, phải xác định diện hoạt tính sinh học kháng thể sau cố định hạt nano sắt từ 3.3.1 Xác định diện kháng thể MNPs Để thực mục tiêu đặt trên, tiến hành khảo sát khả gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ cách thay Streptavidin – HRP kháng thể biotin hóa kit ELISA Sau sử dụng Streptavidin – HRP chất TMB để khảo sát lượng kháng thể thông qua phản ứng màu xảy enzyme HRP TMB đo bước sóng OD450nm Thu kết sau: Bảng 3.3 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs MNPs (µg) OD450nm lần OD450nm lần OD450nm trung bình 0.794 0.797 17.5 1.097 1.104 35 2.003 1.994 52.5 2.577 2.561 70 2.621 2.629 0.796 1.101 1.999 2.569 2.625 1.203 ± 0.0045 1.774 ± 0.008 1.830 ± 0.004 0.305 ± 0.0015 ± 0.0035 Từ bảng 3.3, có đồ thị sau: Delta OD450nm Hình 3.2 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Từ kết bảng 3.3, nhận thấy giá trị Delta OD 450nm tăng dần lượng hạt nano sắt từ tăng dần, từ cho thấy có kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 38 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Như vậy, sau xác định có kháng thể gắn hạt nano sắt từ, bước tiếp theo, tiến hành thí nghiệm nhằm kiểm tra hoạt tính sinh học kháng thể, nghĩa kháng thể có cịn khả gắn kết với kháng nguyên hay không? 3.3.2 Xác định hoạt tính sinh học kháng thể sau gắn lên MNPs Để khảo sát hoạt tính kháng thể, sử dụng nồng độ kháng nguyên khác từ – ng/ml Ở thí nghiệm này, mong muốn với nồng độ kháng nguyên tăng dần giá trị OD 450nm thu tăng dần tuyến tính với nồng độ kháng nguyên Kết khảo sát thu sau: Bảng 3.4 Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên Nồng độ kháng nguyên (ng/ml) OD450nm lần OD450nm lần OD450nm trung bình Delta OD450nm 0.022 0.014 0.075 0.089 0.069 0.089 0.07 0.08 0.018 ± 0.004 0.082 0.064 ± 0.007 0.079 0.061 ± 0.01 0.075 0.057 ± 0.005 Từ bảng 3.4, có đồ thị sau: Hình 3.3 Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên Như kì vọng, nồng độ kháng nguyên tăng từ đến (ng/ml), kháng thể cịn hoạt tính giá trị OD 450nm biến thiên tuyến tính theo nồng độ kháng nguyên Tuy nhiên, từ bảng 3.4, nhận thấy giá trị OD 450nm đo nồng độ kháng nguyên khác (2, 4, ng/ml) có chênh lệch so với mẫu đối chứng (giá trị Delta OD450nm mẫu thử lớn 0) Như nói có lượng kháng thể gắn hạt nano sắt từ cịn hoạt tính sinh học Tuy nhiên, giá trị OD 450nm khơng tuyến tính với nồng độ kháng ngun, gần tương tự Từ kết này, nhận định rằng, lượng kháng thể - MNPs có hoạt tính gắn kháng SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 39 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM nguyên q ít, khơng đủ để gắn với kháng ngun tồn mẫu nên giá trị bão hịa khơng thay đổi theo thay đổi nồng độ kháng nguyên Ở có nhiều khả xảy ra: − + + Hiệu suất gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ cao: Lượng kháng thể dùng để gắn lên hạt sắt từ chưa đủ Lượng kháng thể dùng để gắn lên hạt sắt từ đủ, bị hoạt tính sau gắn + Lượng kháng thể dùng để gắn lên hạt sắt từ đủ kháng thể giữ ngun − hoạt tính, q trình thao tác, làm kháng thể qua bước rửa Hiệu suất gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ thấp, tức lượng kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ chưa đủ Để tối ưu hóa tồn quy trình cố định kháng thể lên hạt nano sắt từ, tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm nhằm kiểm tra lại giả thiết đặt 3.3.3 Khảo sát nồng độ tối ưu kháng thể Bước đầu tơi sử dụng kháng thể biotin hóa có sẵn kit ELISA để gắn lên hạt nano sắt từ Kháng thể chưa biết rõ nồng độ ban đầu, vậy, tơi tiến hành khảo sát nồng độ kháng thể theo độ pha loãng 0, 320X, 160X, 80X, 40X với X nồng độ gốc ban đầu kháng thể kit ELISA Để tiến hành khảo sát nồng độ kháng thể thích hợp kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cố định lên hạt nano sắt từ, tiến hành thí nghiệm đo hoạt tính kháng thể trước sau gắn lên hạt nano sắt từ với nồng độ kháng nguyên ng/ml thu kết sau: Bảng 3.5: Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể tự Nồng độ kháng thể tự OD450nm lần OD450nm lần OD450nm trung bình 320 X 160X 80X 40X 0.122 0.126 1.35 1.35 1.4 1.34 1.72 1.862 1.83 1.918 0.124 1.35 1.37 1.791 1.874 1.226 1.246 1.667 1.75 ± 0.002 ±0 ± 0.03 ± 0.071 ± 0.044 Bảng 3.6: Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể cố định Delta OD450nm Nồng độ kháng 320X SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 160X 40 80X 40X ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thể cố định OD450nm lần OD450nm lần OD450nm trung bình GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM 0.115 0.115 0.174 0.151 0.192 0.192 0.283 0.291 0.313 0.353 0.115 0.1625 0.192 0.287 0.333 0.077 ±0 0.172 ± 0.004 0.218 ± 0.02 0.0475 ±0 ± 0.0115 Từ bảng 3.5 3.6, có bảng sau: Delta OD450nm Bảng 3.7: So sánh Delta OD450nm kháng thể tự cố định nồng độ pha loãng Nồng độ kháng 320X thể pha loãng Delta OD450nm 1.226 trước gắn ± 0.002 ±0 Delta OD450nm 0.0475 sau gắn ±0 ± 0.0115 Từ bảng 3.7, có đồ thị sau: 160X 80X 40X 1.246 ± 0.03 0.077 ±0 1.667 ± 0.071 0.172 ± 0.004 1.75 ± 0.044 0.218 ± 0.02 Hình 3.4 So sánh hoạt tính kháng thể tự kháng thể cố định Từ hình 3.4, nhận thấy kháng thể tự (đo theo phương pháp ELISA truyền thống) nồng độ kháng thể 80X đủ để gắn với lượng kháng nguyên có nồng độ ng/ml mà tơi sử dụng, khơng có chênh lệch nhiều với kết nồng độ kháng thể 40X Tuy nhiên, sử dụng lượng kháng thể tương tự để cố định lên hạt nano sắt từ kiểm tra hoạt tính gắn kháng ngun kết thu thấp so với mẫu dùng kháng thể tự Như chứng tỏ trình gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ bị kháng thể nhiều kháng thể bị hoạt tính sau q trình gắn kết Tơi tiếp tục tiến hành thí nghiệm khác, kiểm tra trực tiếp lượng kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ sau trình gắn kết cách sử dụng Streptavidin – HRP gắn với kháng thể dựa vào đổi màu chất TMB cho tiếp xúc với enzyme HRP tiến hành đo bước sóng 450nm Kết thu sau: SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 41 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Bảng 3.8: Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs Nồng độ kháng 320X thể pha loãng OD450nm lần 1.05 1.521 OD450nm lần 1.128 1.357 OD450nm lần 1.216 1.667 OD450nm trung 1.131 1.515 bình Delta OD450nm 0.384 Sai số ± 0.056 ± 0.105 Từ bảng 3.7 3.8, có đồ thị sau: 160X 80X 40X 1.75 1.804 1.98 2.184 2.275 2.195 2.761 2.855 2.257 1.845 2.218 2.958 0.713 ± 0.090 1.087 ± 0.038 1.493 ± 0.245 Hình 3.5: Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau gắn lên MNPs Từ hình 3.5, nhận thấy lượng kháng thể sau gắn lên hạt nano sắt từ giữ lại nhiều so với lượng kháng thể ban đầu đưa vào Tuy nhiên, sau gắn lên hạt nano sắt từ kháng thể lại thể hoạt tính sinh học mức thấp Điều lý giải hiệu suất gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ cao phần lớn kháng thể bị hoạt tính sau gắn Vì vậy, trường hợp này, tơi đề xuất khảo sát phương pháp hoạt hóa bề mặt để củng cố liên kết kháng thể hạt nano sắt từ chặt chẽ để tránh làm hoạt tính sinh học kháng thể sau gắn Mặc dù khảo sát tương đối thành cơng quy trình để xác định diện hoạt tính sinh học kháng thể sau gắn lên hạt nano sắt từ hoạt hóa APTES – GA với phương pháp lại không đảm bảo giữ hoạt tính kháng thể, q trình thực có lượng hạt nano sắt từ bị rửa đi, điều ảnh hưởng đến tính xác độ tin cậy thiết bị đo tín hiệu từ đề xuất thiết kế (mục 1.5) Vì vậy, qua trình nghiên cứu tìm đọc tài liệu, tơi nhận thấy có số báo nhận định hạt nano sắt từ có tính chất tương tự enzyme SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 42 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM peroxydase Nếu nhận định đúng, tơi có phương pháp kiểm tra tồn hạt nano sắt từ, phù hợp với thiết bị mà nhóm nghiên cứu đề xuất 3.3.4 Khả bắt chước enzyme peroxydase MNPs 3.3.4.1 Khảo sát khả bắt chước enzyme peroxydase MNPs Để chứng minh nhận định cho hạt nano sắt từ có tính chất tương tự enzyme peroxydase tơi tiến hành bước khảo sát với hạt nano sắt từ thu kết sau: Bảng 3.9 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Lượng MNPs (µg) OD450nm lần OD450nm lần OD450nm lần 0 0 10 20 30 40 0.678 1.462 2.154 2.455 0.687 1.444 2.148 2.466 0.672 1.436 2.14 2.456 0,679 1,447 2,147 2,459 OD450nm trung bình ± 0.0053 ± 0.0098 ± 0.0049 ± 0.0047 Từ bảng 3.9, xây dựng mối quan hệ đại lượng hạt nano sắt từ giá trị OD450nm theo đồ thị sau: Hình 3.6 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Từ bảng 3.9 hình 3.6, nhận thấy giá trị OD 450nm tăng dần tỉ lệ thuận với lượng nano sắt từ sau pha loãng với lượng tăng dần Dựa vào phương sai đường chuẩn R2 > 0.98 nên số liệu đáng tin cậy, tơi kết luận hạt nano sắt từ có tình chất enzyme peroxydase Trên sở đó, tơi định tiến hành khảo sát hoạt tính kháng thể dựa vào khả bắt chước enzyme peroxydase hạt nano sắt từ 3.3.4.2 Xác định hoạt tính sinh học kháng thể dựa vào khả bắt chước enzyme peroxydase MNPs Sau chứng minh hạt nano sắt từ có khả bắt chước enzyme peroxydase, tơi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả bắt giữ kháng nguyên kháng thể cách sử dụng hạt nano sắt từ có gắn kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2 với nồng độ pha loãng khác 0, 320X, 160X, 80X, SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 43 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM 40X từ nồng độ kháng thể gốc nồng độ kháng nguyên mức ng/ml, thu kết sau: Bảng 3.10 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng nồng độ kháng thể Nồng độ kháng thể 320X OD450nm lần 0.054 0.058 OD450nm lần 0.054 0.054 OD450nm Trung bình 0.054 0.056 Delta OD450nm 0.002 Từ kết bảng 3.10, nhận thấy giá 160X 0.057 0.052 0.055 0.001 trị OD 450nm 80X 40X 0.064 0.05 0.054 0.049 0.059 0.050 0.005 -0.005 thu từ mẫu đối chứng mẫu thử khơng có sai khác lớn gần giá trị Do đó, tơi nhận định khơng cịn hạt nano sắt từ qua trình thử nghiệm mà nguyên nhân phải trải qua nhiều bước rửa với lực rửa mạnh trình thử nghiệm làm đứt gãy liên kết hạt nano sắt từ kháng thể SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 44 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Af 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài “Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đốn ung thư vú”, tơi đạt số kết sau: − Xây dựng quy trình cố định kháng thể lên hạt nano sắt từ phương pháp hoạt hóa bề mặt dựa vào liên kết cộng hóa trị nhóm amine (-NH 2) − nhóm aldehyde (-COOH) nhờ phân tử APTES GA Xây dựng phương pháp xác định diện hoạt tính sinh học kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2 sau cố định hạt nano sắt từ, nghĩa khả nhận diện kháng nguyên HER2 4.2 Kiến nghị Sau xem xét kiểm tra kết thu từ phương pháp hoạt hóa bề mặt nêu trên, tơi nhận thấy kết chưa tối ưu hiệu suất gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ cao phần lớn kháng thể bị hoạt tính chưa xác định nồng độ tối ưu kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2 Do đó, tơi hy vọng thời gian đến tiếp tục khảo sát thêm phương pháp hoạt hóa bề mặt nhằm củng cố liên kết hạt nano sắt từ kháng thể, giữ hoạt tính sinh học kháng thể Cụ thể gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ hoạt hóa bề mặt succinic anhydride N, N-diisopropyethylamine [11] Methyl methacrylate acid acrylic [8] Đồng thời, sau chọn phương pháp gắn tối ưu nhất, tiến hành tối ưu hóa quy trình thực nhằm đem lại quy trình với hiệu suất gắn cao giữ hoạt tính sinh học kháng thể đạt mức tốt SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 45 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1] Nguyễn Hoàng Hải (2011) Chế tạo hạt nano xít sắt từ tính Khoa Vật lý, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội [2] Nguyễn Phương Hoa (2010) Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch Immunotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu kháng nguyên Her2 Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam [3] Nguyễn Thị Lan (2008) Sinh hóa Miễn dịch Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng [4] Tơn Thất Tín Nghiên cứu cố định kháng thể bề mặt hạt nano sắt từ phiến kính để phát vi khuẩn Salmonella Lớp 09SH, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng Tài liệu tham khảo nước [5] A C A Roquea*, S Bispoa, A R N Pinheiroa, J M A Antunesa, D Gonc¸ alvesb and H A Ferreirab (2008) Antibody immobilization on magnetic particles [6] Adarsh Sandhu, Hiroshi Handa and Masanori Abe (2010) Synthesis and bio functionalization of nanoparticles for biosensing and biorecognition [7] Alexandr E Urusov, Alina V Petrakova, Maxim V Vozniak, Anatoly V Zherdev and Boris B Dzantiev (2014) Rapid Immunoenzyme Assay of Aflatoxin B1 Using Magnetic Nanoparticles [8] Filiz Sayar Arzum Erdem, b Hakan Karadeniz, Guldtem Guven,b Mehmet Ozsoz, Erhan Piskinb (2006) Development of Streptavidin Carrying Magnetic Nanoparticles and Their Applications in Electrochtôiical Nucleic Acid Sensor Systtems [9] Min-Ah Woo, Moon Il Kim, Jae Hwan Jung, Ki Soo Park, Tae Seok Seo, and Hyun Gyu Park (2013) A Novel Colorimetric Immunoassay Utilizing the Peroxidase Mimicking Activity of Magnetic Nanoparticles [10] Nida Iqbal and Naveed Iqbal (2014) Human Epidermal Growth Factor Receptor (HER2) in Cancers: Overexpression and Therapeutic Implications [11] Sang-Myung Lee Min-Ah Woo, Gunsung Kim, JongHo Baek, Mi Suk Noh, Ji Eun Kim,Sung Jin Park, Arash Minai-Tehrani, Se-Chang Park, Yeong Tai Seo, Yong-Kwon Kim,Yoon-Sik Lee, Dae Hong Jeong, and Myung-Haing Cho SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 46 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM (2009) Multiplex Immunoassay Using Fluorescent-Surface Enhanced Raman Spectroscopic Dots for the Detection of Bronchioalveolar Stem Cells in Murine Lung Tài liệu từ Website [12] https://www.bangslabs.com/sites/default/files/imce/docs/TechNote %20205%20Web.pdf [13] http://www.benhvienbinhduong.org.vn/bvdkbd/index.php? option=com_content&view=article&id=639:nhng-tin-b-y-hc-trong-lnh-vc-iu-trung-th ngi-&catid=15:thong-tin-y-hc-tng-hp&lang=vi [14] http://bvdkquangnam.vn/tin-tc/y-hc-thng-thc/996-mt-s-iu-cn-bit-v-khangnguyen-ung-th-biu-mo-phoi-cea.html [15] http://cumargold.vn/vi/benh-ung-thu.nd204/thu-pham-am-tham-gay-nen-canbenh-ung-thu-vu.i477.html [16] http://cumargold.vn/vi/tin-tuc su-kien.nd282/ung-thu-vu-co-the-chua-khoineu-phat-hien-som.i444.html [17] http://www.huemed-univ.edu.vn/?cat_id=46&id=268 [18] http://kc03.vpct.gov.vn/News.aspx?ctl=newsdetail&aID=72&p=58 [19] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17976236 [20] http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009912000002010 [21] http://vast.ac.vn/tin-tuc-su-kien/tin-khoa-hoc/trong-nuoc/563-nghien-cuu-taophuc-hop-khang-the-hat-nano-silica-phat-quang-de-phat-hien-nhanh-vi-khuangay-benh [22] http://123doc.org/document/1310274-nghien-cuu-ung-dung-cac-hat-nanophat-quang-vao-viec-danh-dau-te-bao-de-xac-dinh-so-luong-vi-khuan-gay-doctrong-thuc-pham.htm?page=5 SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 47 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần đệm PBS (Phosphas Buffer) 500ml, pH= 7.4 - KCl: NaCl: Na2HPO4.12H2O KH2PO4 Pha nước cất lần 0.1g 4g 0.72g 0.12g Phụ lục 2: Thành phần đệm PBS chứa 0.2M Tris - HCl NaCNBH 3, 28ml - Tris- base 0.33908g NaCNBH3 0.14g Pha đệm PBS (Phụ lục 1) Phụ lục 3: Pha đệm PBS chứa 0.05% Tween 20: Cho 0.01ml Tween 20 vào 19.99 ml PBS SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC LỚP: 10SH – MSV: 107261101136 48 ... kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ mà đảm bảo giữ nguyên hoạt tính sinh học kháng thể Đề tài ? ?Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đốn ung thư vú? ??... đề tài ? ?Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đốn ung thư vú? ??, tơi đạt số kết sau: − Xây dựng quy trình cố định kháng thể lên hạt nano sắt từ phương... nồng độ kháng nguyên Ở có nhiều khả xảy ra: − + + Hiệu suất gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ cao: Lượng kháng thể dùng để gắn lên hạt sắt từ chưa đủ Lượng kháng thể dùng để gắn lên hạt sắt từ đủ,