Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư có tỷ lệ tử vong cao thứ 2 ở nam giới.Tuy nhiên, nếu được phát hiện kịp thời thì cơ hội điều trị thành công cao.PSA là chất chỉ thị quan trọng trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.
TRƯỜNG ĐẠI BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG KHOA HĨA NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC −−−−−− ĐỒ ÁN ĐỀ TỐT TÀI NGHIỆP Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt SVTH: Nguyễn Nữ Zen Na GVHD: TS Lê Lý Thùy Trâm Ngành: Công nghệ Sinh học ĐẶT VẤN ĐỀ • Ung thư tuyến tiền liệt ung thư có tỷ lệ tử vong cao thứ nam giới • Tuy nhiên, phát kịp thời hội điều trị thành cơng cao • PSA chất thị quan trọng chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt • ELISA kỹ thuật phổ biến dùng để định lượng PSA MÔ HÌNH THIẾT BỊ (a) Cố định kháng thể thứ đặc hiệu PSA lên đế sinh học (b) Phủ mẫu máu chứa PSA, kháng nguyên bị kháng thể bắt giữ (c) Thêm kháng thể thứ hai gắn MNPs (d) Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên giữ lại sau lần rửa (e) Dựa vào thiết bị đo lượng sắt từ, xác định lượng sắt từ từ suy nồng độ kháng nguyên mẫu cần đo MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Y Kháng thể Hoạt hóa bề mặt APTES – GA ? • Liệu có kháng thể gắn lên hạt sắt từ khơng? • Liệu kháng thể có cịn hoạt tính khơng? HOẠT HÓA BỀ MẶT MNPs THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS Kiểm tra độ tin cậy phương pháp 1.600 1.400 Delta OD 280nm f(x) = 3.44x - 0.01 1.200 R² = 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 Nồng độ Streptavidin (mg/ml) THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS 400 µl MNPs hoạt hóa bề mặt 400 µl Streptavidin nồng độ 0.1 mg/ml Thu dịch 400 µl PBS chứa Tris 0,2M + 1% NaCNBH3 400 µl PBS + 0, 05% Tween 20 Lắc nhẹ 3h, lắc nhẹ, nhiệt độ phòng Rửa lần với PBS Thu dịch hút 400 µl PBS/1 lần Li tâm 6000v/p, 5p Lắc , 1h, t0p Rửa lần Thu dịch Thu dịch Li tâm 6000v/p, 5p, 40C Bảo quản 400 µl PBS Giá trị OD dịch rửa cao so với dịch ban đầu, delta OD âm => dịch rửa có tạp chất protein khác streptavidin THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN- HRP, ĐO BẰNG PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN SỰ THAY ĐỔI MÀU CỦA CƠ CHÁT TMB TMB Stop solution OD 450 nm THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN SỰ THAY ĐỔI MÀU CỦA CƠ CHÁT TMB Mẫu Mẫu đối chứng (MNPs- StreptavidinHRP, to = 1000C, phút) Mẫu thử nghiệm (MNPsStreptavidin-HRP) OD450nm 0.147±0.04 0.421 ±0.066 Delta OD mẫu thử nghiệm lớn mẫu đối chứng khẳng định có streptavidin gắn lên hạt nano sắt từ KHÁNG THỂ CÓ GẮN LÊN MNPs? TMB Y Kháng thể (µl) Stop solution Y 25 Y 50 75 OD 450 nm 100 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ TỐI ƯU CỦA KHÁNG THỂ Nồng độ kháng thể 160X 80X 40X KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ TỐI ƯU CỦA KHÁNG THỂ Delta OD450nmn So sánh hoạt tính kháng thể tự kháng thể cố định 1.98 2.01 0.14 80X 0.11 40X 0.93 0 0.06 160X Nồng độ kháng thể 4ng/ml Kháng thể cố định Kháng thể tự - Nồng độ 80X nồng độ thích hợp để gắn kháng thể lên hạt nano - Có trường hợp xảy ra: • Kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ phần bị hoạt tính • Kháng thể gắn lên hạt nano không nhiều KHẢO SÁT LƯỢNG KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH LÊN MNPs TMB Y Nồng độ kháng thể Stop solution Y 160X Y 80X OD 450 nm 40X KHẢO SÁT LƯỢNG KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH LÊN MNPs 2.5 Delta OD450nmn Lượng kháng thể cịn hoạt tính 1.5 Lượng kháng thể gắn lên MNPs Kháng thể tự 0.5 0 160X 80X Nồng độ kháng thể 4ng/ml 40X KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN: • Chứng minh phương pháp sử dụng APTES- GA gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ, nhiên hiệu suất khơng cao • Xây dựng phương pháp kiểm tra tồn kháng thể sau gắn lên hạt nano sắt từ • Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính kháng thể KIẾN NGHỊ: • Tối ưu hóa quy trình sử dụng APTES- GA • Thử nghiệm phương pháp hoạt hóa bề mặt L/O/G/O EM XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN SỰ CHÚ Ý LẮNG NGHE CỦA THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN www.themegallery.com THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS Mẫu Streptavidin ban Streptavidin đầu dịch rửa Nồng độ (mg/ml) 0.1 0.13 Kết quả: Các giá trị thu âm (delta OD dịch rửa dịch hút cao dịch ban đầu đưa vào) chứng tỏ dịch rửa có protein khác ngồi streptavidin làm cho kết khơng xác KHẢO SÁT KHẢ NĂNG “BẮT CHƯỚC” ENZYME PEROXYDASE CỦA MNPs TMB + H2O2 Stop solution OD 450 nm KHẢO SÁT KHẢ NĂNG “BẮT CHƯỚC” ENZYME PEROXYDASE CỦA MNPs Đường chuẩn: Lượng MNPs (µg) OD trung bình 10 20 30 40 0,000 0,679 1,447 2,147 2,459 Đường chuẩn OD trung bình 3.000 2.500 f(x) = 0.06x + 0.07 R² = 0.98 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 10 15 20 25 30 Lượng MNPs (µg) 35 40 45 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG THỂ DỰA VÀO KHẢ NĂNG “BẮT CHƯỚC” ENZYME PEROXYDASE CỦA MNPs TMB + H2O2 Stop solution PSA MNPs – Ab CÔNG THỨC CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG BÀI APTES: (3-Aminopropyl) triethoxysilane GLUTARALDEHYDE : CÔNG THỨC CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG BÀI SMCC: 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylic acid Nhydroxysuccinimide ester CÔNG THỨC CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG BÀI NI-NTA: Nickel nitrilotriacetic Axit Nitrilotriacetic: CÁC PHƯƠNG PHÁP GẮN KẾT KHÁNG THỂ LIÊN KẾT VỚI MNPs THEO XING - Y CÁC PHƯƠNG PHÁP GẮN KẾT KHÁNG THỂ LIÊN KẾT VỚI MNPs THEO XING - Y ... kháng thể 4ng/ml Kháng thể cố định Kháng thể tự - Nồng độ 80X nồng độ thích hợp để gắn kháng thể lên hạt nano - Có trường hợp xảy ra: • Kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ phần bị hoạt tính • Kháng. .. để định lượng PSA MÔ HÌNH THIẾT BỊ (a) Cố định kháng thể thứ đặc hiệu PSA lên đế sinh học (b) Phủ mẫu máu chứa PSA, kháng nguyên bị kháng thể bắt giữ (c) Thêm kháng thể thứ hai gắn MNPs (d) Kháng. .. • Kháng thể gắn lên hạt nano không nhiều KHẢO SÁT LƯỢNG KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH LÊN MNPs TMB Y Nồng độ kháng thể Stop solution Y 160X Y 80X OD 450 nm 40X KHẢO SÁT LƯỢNG KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH LÊN MNPs