Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt

Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư có tỷ lệ tử vong cao thứ 2 ở nam giới. Tuy nhiên, nếu được phát hiện kịp thời thì cơ hội điều trị thành công cao. PSA là chất chỉ thị quan trọng trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HĨA BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG KHÁNG NGUYÊN PSA LÊN HẠT NANO SẮT TỪ NHẰM CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT Sinh viên thực : NGUYỄN NỮ ZEN NA Lớp : 10SH Giáo viên hướng dẫn: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Giáo viên duyệt : TS BÙI XUÂN ĐÔNG - Đà Nẵng, năm 2015- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc KHOA HĨA BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : NGUYỄN NỮ ZEN NA Lớp : 10SH Khóa : 2010 - 2015 Ngành : Công Nghệ Sinh Học Tên đề tài: “Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến” Nội dung phần: - Lời cảm ơn - Mục lục - Danh mục hình vẽ - Danh mục bảng - Các thuật ngữ viết tắt - Tóm tắt luận văn - Lời mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Vật liệu phương pháp SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM - Chương 3: Kết thảo luận - Chương 4: Kết luận kiến nghị - Tài liệu tham khảo - Phụ lục Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Lý Thùy Trâm Ngày giao nhiệm vụ: 10/2/2015 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/5/2015 Thông qua môn: Ngày …… tháng …… năm…… TRƯỞNG BỘ MÔN GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) GIẢNG VIÊN DUYỆT SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) KẾT QUẢ ĐIỂM ĐÁNH GIÁ: ………………… Ngày … tháng…năm … CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký ghi rõ họ tên) SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM LỜI CẢM ƠN Trên thực tế thành cơng khơng gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt năm học giảng đường trường Đại học Bách Khoa - Đại học Đà nẵng, em nhận nhiều quan tâm giúp đỡ quý thầy cơ, gia đình bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô môn Công nghệ Sinh học với tri thức tâm huyết truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em thời gian học tập trường Em xin chân thành cảm ơn TS Lê Lý Thùy Trâm tận tình hướng dẫn em suốt thời gian làm đề tài Giúp đỡ em vượt qua thời kì khó khăn đề tài Nếu khơng có giúp đỡ, chỉnh sửa tận tình em nghĩ báo cáo khó hồn thành Em xin chân thành cảm ơn TS Đặng Đức Long ThS Tạ Ngọc Ly đóng góp ý kiến, giúp đỡ em hoàn thiện tốt đề tài tốt nghiệp Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cán phịng thí nghiệm mơn KS Võ Công Tuấn KS Phạm Thị Kim Thảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt thí nghiệm phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học Bên cạnh đó, em xin cảm ơn anh chị trường Cao đẳng lương thực thực phẩm, bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng Trung tâm y tế dự phòng Đà Nẵng giúp đỡ em việc sử dụng thiết bị phục vụ cho đề tài Bước đầu vào nghiên cứu khoa học, kiến thức em hạn chế khơng bỡ ngỡ Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, em mong nhận thơng cảm ý kiến đóng góp quý báu quý Thầy Cô để đề tài em hoàn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình, quý báu thầy cô bạn bè Đà Nẵng, ngày 30 tháng năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Nữ Zen Na SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG BIỂU iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT v TÓM TẮT ABSTRACT LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Tổng quan kháng nguyên PSA 1.2.1 Cấu trúc kháng nguyên PSA 1.2.2 Các dạng kháng nguyên PSA 1.2.3 Ảnh hưởng vai trò PSA UTTTL 1.3 Giới thiệu hạt nano 1.4 Cơ chế gắn kết phân tử sinh học hạt nano 10 1.4.1 Gắn kết trực tiếp 10 1.4.2 Gắn kết không trực tiếp 11 1.4.3 Các phương pháp gắn kết kháng thể đặc hiệu hạt nano sắt từ nghiên cứu 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 Vật liệu 15 2.1.1 Hóa chất 15 2.1.2 Dụng cụ 15 2.2 Phương pháp thí nghiệm 16 2.2.1 Cơ sở phương pháp gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ APTES- GA 16 2.2.2 Hoạt hóa bề mặt hạt nano APTES- GA 16 2.2.3 Thử nghiệm gắn kháng thể lên MNPs 19 2.2.4 Khảo sát nồng độ tối ưu kháng thể 21 SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM 2.2.5 Khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs dựa vào khả “bắt chước” enzyme peroxydase MNPs 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Hoạt hóa bề mặt MNPs 24 3.1.1 Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs, đo phương pháp UV- VIS 24 3.1.2 Thử nghiệm với Streptavidin – HRP, dựa vào phản ứng Enzyme HRP TMB 26 3.2 Thử nghiệm gắn kháng thể lên MNPs 27 3.2.1 Khảo sát khả gắn kháng thể lên MNPs 27 3.2.2 Khảo sát khả gắn kết kháng nguyên kháng thể cố định lên MNPs 28 3.2.3 Khảo sát nồng độ tối ưu kháng thể 29 3.2.4 Khảo sát khả “bắt chước” enzyme peroxydase MNPs 32 3.2.5 Khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs dựa vào khả “bắt chước” enzyme peroxydase MNPs 33 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 4.1 Kết luận 34 4.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 36 PHỤ LỤC 38 SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Bảng Tên bảng Số trang 1.1 Tỷ lệ thành phần PSA huyết tương 1.2 Vai trò PSA chuẩn đoán UTTTL 3.1 Biến thiên giá trị delta OD280nm theo nồng độ Streptavidin 24 3.2 Kết thu sau đo UV- VIS mẫu MNPs- 26 Streptavidin- HRP 3.3 Biến thiên giá trị delta OD450nm theo lượng MNPs 27 3.4 Sự biến thiên delta OD theo nồng độ kháng thể trước sau 29 cố định 3.5 Sự biến thiên delta OD theo nồng độ kháng thể khảo 31 sát lượng kháng thể gắn lên hat nano sắt từ 3.6 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 32 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Hình Tên hình Số trang 1.1 Cấu trúc tinh thể PSA 1.2 Hình ảnh tuyến tiền liệt bị ung thư 1.3 Các cách gắn kết phân tử sinh học với hạt nano 11 2.1 Cơ sở phương pháp cố định kháng thể lên MNPs thông 16 qua hoạt hóa bề mặt APTES- GA 2.2 Sơ đồ quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs APTES- GA 17 2.3 Sơ đồ thí nghiệm chuẩn bị mẫu đo UV- VIS 18 2.4 Phương pháp khảo sát khả gắn kháng thể lên MNPs 20 2.5 Hình minh họa phương pháp xác định hoạt tính kháng thể 21 sau cố định lên MNPs 3.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giá trị OD280nm với 25 nồng độ Streptavidin 10 3.2 Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên 28 11 3.3 So sánh hoạt tính kháng thể trước sau gắn lên 30 MNPs 12 3.4 Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau gắn lên MNPs 31 13 3.5 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs 32 SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT UTTTL: Ung thư tuyến tiền liệt PSA: Prostate specific antigen MNPs: Hạt nano sắt từ (Magnetic nanoparticles) GA: Glutaraldehyde APTES: 3-aminopropyl triethoxysilane TMB: 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine HRP: Horseradish peroxidase ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay IARC: Cơ quan nghiên cứu ung thư giới A2M: α2- macroglubulin ACT: α1- antichymotrypsin EDAC: 1-ethyl -3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM TĨM TẮT Hiện nay, thuật ngữ cơng nghệ sinh học nano khơng cịn xa lạ xã hội mà kết hợp hai ngành công nghệ sinh học công nghệ nano đem lại nhiều thành tựu lớn nhiều lĩnh vực, đặc biệt lĩnh vực Y sinh Trên giới Việt Nam có nhiều nghiên cứu việc cố định phân tử sinh học axit nucleic, enzyme hay kháng thể, lên hạt nano sắt từ (MNPs) với nhiều mục đích khác Qua q trình tìm hiểu, em nhận thấy sử dụng phương pháp cố định kháng thể lên hạt nano sắt từ nhằm thiết kế quy trình để chẩn đốn ung thư mà cụ thể ung thư tuyến tiền liệt (UTTTL) Trong khuôn khổ đề tài tốt nghiệp, em đề xuất phương pháp cố định kháng thể liên kết APTES- GA sau khảo sát lượng kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ khả trì hoạt tính gắn kết kháng nguyên chúng sau gắn kết Qua trình nghiên cứu em chứng minh có kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ chúng cịn giữ hoạt tính để thực q trình nhận diện có mặt kháng nguyên ABSTRACT Nowadays, the term “nano-biotechnology” is not strange to the society when the combination of biotechnology and nanotechnology has brought many great achievements in many areas, particularly, in the biomedical field In the world as well as in Vietnam, there is a lot of research in immobilizing biological molecules such as nucleic acids, enzymes or antibodies, on ferromagnetic nanoparticles (MNPS) for many different purposes Through research, I has found that we can use the method of immobilization antibody on ferromagnetic nanoparticles to design a new process for diagnosing cancer, concretely, for prostate cancer In the framework of the thesis, we propose using immobilized antibodies by APTES- GA linking After that measuring how many antibodies fixed on ferromagnetic nanoparticles and checking bioactivity of antibodies In conclusion, we have demonstrated that antibodies attached on ferromagnetic nanoparticles and they are still kept active to implement the process of identifying the presence of antigen SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Streptavidin, đó, phương pháp khơng phù hợp để xác định lượng Streptavidin gắn lên hạt nano sắt từ Vì vậy, em phải thử nghiệm với phương pháp khác đặc hiệu dựa phản ứng chuyển màu TMB nhờ enzyme HRP cố định Streptavidin để định lượng xác diện Streptavidin lên hạt sắt từ 3.1.2 Thử nghiệm với Streptavidin – HRP, dựa vào phản ứng Enzyme HRP TMB Từ kết trình đo độ hấp thụ UV- VIS, em nhận thấy phương pháp có nhiều hạn chế phương pháp đo khơng đặc hiệu cho protein Từ đó, em sử dụng phương pháp dựa phản ứng đặc hiệu enzyme HRP chất TMB cách thay Streptavidin tự Streptavidin có gắn enzyme peroxidase HRP HRP enzyme phân hủy chất TMB chuyển TMB từ không màu sang màu xanh đo độ hấp thụ bước sóng 450nm Với lượng Streptavidin gắn lên hạt nano sắt từ khác nhau, cường độ màu thu khác cho giá trị OD khác Từ đó, với thay đổi OD mẫu có gắn Streptavidin mẫu đối chứng em chứng minh Streptavidin có gắn lên MNPs hay khơng Sau q trình thí nghiệm em thu kết sau: Bảng 3.2: Kết thu sau đo UV-VIS mẫu MNPsStreptavidin- HRP Mẫu OD450nm Mẫu đối chứng (MNPs- StreptavidinHRP, to = 1000C, phút) 0.147±0.04 Mẫu thử nghiệm (MNPsStreptavidin-HRP) 0.421 ±0.066 Ở thí nghiệm này, em sử dụng mẫu đối chứng mẫu MNPs có gắn StreptavidinHRP mẫu thí nghiệm bị làm hoạt tính nhiệt độ SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 26 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Qua Bảng 3.2 em nhận thấy rằng, giá trị OD đo mẫu thử nghiệm lớn so với mẫu đối chứng với sai số chấp nhận Điều chứng tỏ có xuất enzyme HRP mẫu thử nghiệm Nói cách khác, Streptavidin cố định MNPs Từ kết trên, em chứng minh q trình hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ APTES GA thành công đồng thời tạo cầu nối với phân tử protein mà cụ thể Streptavidin- HRP Trên sở đó, em hi vọng rằng, với chất protein, Streptavidin cố định lên MNPs kháng thể Do đó, em tiến hành gắn kháng thể lên MNPs 3.2 Thử nghiệm gắn kháng thể lên MNPs 3.2.1 Khảo sát khả gắn kháng thể lên MNPs Từ kết khảo sát khả gắn Streptavidin lên hạt nano sắt từ, em cho kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ phương pháp Streptavidin kháng thể có chất protein Để chứng minh nhận định mình, em tiến hành khảo sát khả gắn kháng thể lên MNPs cách thay Streptavidin- HRP kháng thể biotin hóa Sau sử dụng Streptavidin- HRP chất TMB để khảo sát lượng kháng thể thông qua phản ứng màu enzyme HRP TMB (Hình 2.4) Từ q trình thí nghiệm trên, em thu kết sau: Bảng 3.3: Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs MNPs (µg) Delta OD 17.5 35 52.5 70 0.305 1.203 1.774 1.830 ± 0.0015 ± 0.0035 ± 0.0045 ± 0.008 ± 0.004 Từ Bảng 3.3, em nhận thấy rằng, giá trị delta OD tăng dần lượng MNPs tăng dần, từ cho thấy có kháng thể gắn lên MNPs SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 27 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Như vậy, bước đầu em chứng minh có kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ Để hoàn thành mục tiêu đề tài em tiến hành thí nghiệm kiểm tra hoạt tính sinh học kháng thể, nghĩa kiểm tra kháng thể có cịn khả gắn kết với kháng nguyên hay không? 3.2.2 Khảo sát khả gắn kết kháng nguyên kháng thể cố định lên MNPs Để khảo sát hoạt tính kháng thể, em sử dụng nồng độ kháng nguyên khác nhằm xác định khả bắt giữ kháng nguyên kháng thể Với thí nghiệm em mong muốn với nồng độ kháng nguyên khác giá trị OD khác Kết khảo sát em sau: Delta OD 450nm Kết đo OD 450 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.064 0.061 0.057 Nồng độ kháng nguyên (ng/ml) Hình 3.2: Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên Từ Hình 3.2, em nhận thấy rằng, giá trị delta OD đo nồng độ kháng nguyên khác (2, 4, ng/ml) có chênh lệch so với mẫu đối chứng (thể giá trị delta OD khác 0), ban đầu xem có lượng kháng thể cịn hoạt tính sau gắn lên MNPs Tuy nhiên, từ hình cho thấy giá trị OD thay đổi khơng có tuyến tính có xu hướng giảm, ban đầu em nhận định lượng kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ so với lượng kháng nguyên cho vào mà dù lượng kháng ngun có tăng giá trị đo khơng thay đổi Để giải thích điều em đưa khả xảy ra:  Hiệu suất gắn kháng thể lên MNPs cao rơi vào số trường hợp sau: SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 28 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM - Kháng thể hoạt tính sau gắn lên MNPs lượng kháng thể ban đầu đưa vào nhỏ - Kháng thể hoạt tính sau gắn lên MNPs trình rửa phải trải qua nhiều bước nên kháng thể bị rửa trơi - Kháng thể bị hoạt tính sau gắn lên MNPs  Hiệu suất gắn thấp, tức lượng kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ Để tối ưu hóa tồn quy trình cố định kháng thể lên MNPs, em tiếp tục tiến hành thí nghiệm nhằm kiểm tra lại giả thuyết em đưa Ban đầu, em tiến hành khảo sát nồng độ kháng thể tối ưu để gắn lên MNPs thông qua nồng độ khác 0, 160X, 80X, 40X với X nồng độ gốc ban đầu kháng thể trrong kit Elisa 3.2.3 Khảo sát nồng độ tối ưu kháng thể Trong đề tài này, bước đầu em sử dụng kháng thể có gắn biotin có sẵn kit Elisa để gắn lên hạt nano sắt từ Kháng thể có nhược điểm không cho biết nồng độ ban đầu em tiến khảo sát nồng độ kháng thể theo độ pha loãng từ 0, 160X, 80X, 40X với X nồng độ gốc ban đầu (các giá trị pha loãng dao động quanh 80X- nồng độ đề xuất kit Elisa) Để tiến hành khảo sát nồng độ kháng thể thích hợp kiểm tra hoạt tính kháng thể cố định lên hạt nano sắt từ, em tiến hành thí nghiệm đo hoạt tính kháng thể trước sau gắn lên hạt nano sắt từ thu kết sau: Bảng 3.4: Sự biến thiên delta OD theo nồng độ kháng thể tự Nồng độ kháng thể 160X 80X 40X Delta OD trước gắn 0.927 1.975 2.011 DeltaOD sau gắn 0.058 0.143 0.108 Từ Bảng 3.4 em thu đồ thị sau: SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 29 Delta OD450nmn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM 1.975 2.011 0.927 0.058 0.143 0.108 160X 80X 40X Nồng độ kháng thể 4ng/ml Kháng thể cố định Kháng thể tự Hình 3.3: So sánh hoạt tính kháng thể trước sau cố định Từ Bảng 3.4 Hình 3.3, em thấy kháng thể sau gắn lên MNPs nồng độ 80X cho giá trị OD cao có xu hướng bão hịa, đó, em rút nồng độ 80X nồng độ thích hợp để gắn kháng thể lên hạt nano Tuy nhiên, so sánh với nồng độ ban đầu đưa vào kháng thể em nhận thấy giá trị thấp Chứng tỏ có trường hợp xảy ra: - Kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ phần bị hoạt tính - Kháng thể gắn lên hạt nano khơng nhiều (hiệu suất gắn thấp) Để xác định nguyên nhân cách khắc phục nhằm tối ưu quy trình, em tiếp tục tiến hành xác định lượng kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ phương pháp xác định OD dựa đổi màu TMB cho enzyme HRP tương tác với chúng Sau thí nghiệm em thu kết sau: SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 30 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Bảng 3.5: Sự biến thiên delta OD theo nồng độ kháng thể khảo sát lượng kháng thể gắn MNPs Nồng độ kháng thể 160X 80X 40X OD trung bình 2.206 2.351 2.496 2.485 DELTA OD 0.145 0.29 0.279 Sai số ± 0.0005 ±0.0015 ± 0.0705 ± 0.0045 Từ Bảng 3.4 Bảng 3.5, em có đồ thị sau: Delta OD450nmn 2.5 1.5 Lượng kháng thể cịn hoạt tính Lượng kháng thể gắn lên MNPs Kháng thể tự 0.5 0 160X 80X 40X Nồng độ kháng thể 4ng/ml Hình 3.4: Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau gắn lên MNPs Từ Hình 3.4, em thấy phân tử kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ giữ hoạt tính Tuy nhiên, lượng kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ thấp nhiều lần so với lượng kháng thể đưa vào Chứng tỏ hiệu suất gắn kháng thể APTES GA khơng cao Từ thí nghiêm trên, em đưa kết luận ban đầu rằng: hiệu suất gắn phương pháp gắn kết thông qua APTES- GA thấp nhiên khả giữ hoạt SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 31 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM tính kháng thể sau gắn cao, lượng sắt từ cho vào ban đầu đủ để thực phản ứng cuối nồng độ kháng thể tối ưu trường hợp 80X Tuy nhiên, vấn đề em mắc phải cần giải là: Đối với thiết bị “đo đạc phân tách phân tử sinh học sử dụng hạt nano từ tính” mục tiêu cuối khơng cố gắng tối ưu nồng độ kháng thể nhằm đảm bảo bắt giữ tồn lượng kháng ngun có bệnh phẩm, hay 4ng/ml mà phải giữ lượng sắt từ có kháng thể cịn hoạt tính để đo tín hiệu từ, từ xác định nồng độ kháng nguyên mẫu bệnh phẩm Trong đó, phương pháp em có nhược điểm khơng đảm bảo lượng sắt từ cịn giữ lại đầy đủ sau nhiều thao tác rửa phức tạp Từ dẫn đến đưa vào chạy thiết bị có sai số lớn Để giải vấn đề này, qua trình tìm hiểu em biết hạt sắt từ có khả “Bắt chước” hoạt động enzyme peroxidase, tức khả có thật em giảm nhiều cơng đoạn nối, rửa làm giảm hao hụt MNPs 3.2.4 Khảo sát khả “bắt chước” enzyme peroxydase MNPs Như trình bày Mục 3.2.3, ban đầu em khảo sát lại khả “bắt chước” enzyme peroxidase MNPs thu kết sau: Bảng 3.6: Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Lượng MNPs (µg) OD450nm 10 20 30 40 0.679 1.447 2.147 2.459 ±0.005 ±0.01 ±0.005 ±0.005 0.000 Từ Bảng 3.6, em xây dựng mối quan hệ lượng MNPs OD450nm theo đồ thị sau: SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 32 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM 3.000 y = 0,0639x + 0,0693 R² = 0,9833 OD 450nm 2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 10 20 30 Lượng MNPs (µg) 40 50 Hình 3.5: Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Từ Bảng 3.6 Hình 3.5, em nhận thấy giá trị OD tăng dần tỉ lệ thuận với lượng nano sắt từ sau pha loãng với lượng tăng dần Với phương sai đường chuẩn R2 > 0.98 nên số liệu đáng tin cậy, em kết luận hạt nano sắt từ có tình chất enzyme peroxydase Trên sở đó, em định tiến hành khảo sát hoạt tính kháng thể dựa vào khả bắt chước enzyme peroxydase hạt nano sắt từ 3.2.5 Khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs dựa vào khả “bắt chước” enzyme peroxydase MNPs Sau chứng minh MNPs có khả “bắt chước” enzyme peroxidase em tiến hành thí nghiệm, khảo sát khả bắt kháng nguyên kháng thể nồng độ khác Tuy nhiên, kết không mong đợi em, trình rửa giếng, hạt sắt từ bị rửa trôi hết Điều chứng tỏ liên kết kháng thể hạt nano khơng bền chặt Do đó, để đo phương pháp em cần phương pháp cố định khác tối ưu hơn, gắn kháng thể lên MNPs bền vững SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 33 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đề tài “Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt” em đạt kết khả quan sau: - Xây dựng phương pháp cố định kháng thể lên hạt nano sắt từ dựa liên kết cộng hóa trị nhóm NH2 nhóm CHO thông qua APTES GA - Chứng minh phương pháp gắn kháng thể lên bề mặt hạt sắt từ kháng thể cịn hoạt tính - Khảo sát nồng độ tối ưu kháng thể trình gắn 80X với X nồng độ gốc ban đầu kháng thể đặc hiệu kháng nguyên PSA kit - Xây dựng phương pháp xác định lượng kháng thể hoạt tính kháng thể sau gắn lên hạt nano sắt từ Tạo điều kiện thực phương pháp cố định khác sau cần sử dụng phương pháp mà không cần khảo sát lại Các phương pháp là: + Xác định lượng kháng thể hoạt tính dựa thay đổi màu TMB sau cho enzyme HRP tương tác với chúng + Xác định lượng kháng thể hoạt tính kháng thể dựa vào khả “bắt chước” enzyme peroxidase hạt nano sắt từ 4.2 Kiến nghị Mặc dù bước đầu em đạt kết mong đợi trên, nhiên em nhận thấy rằng, hiệu suất gắn không cao, liên kết kháng thể MNP không bền, điều chứng minh thơng qua thí nghiệm xác định hoạt tính kháng thể dựa vào khả “bắt chước” enzyme peroxidase hạt nano sắt từ Do đó, để hồn thiện đề tài em hi vọng sau tiến hành khảo sát thêm hai phương pháp mà em đề xuất trước thời gian khơng cho phép nên em chưa tiến hành thí nghiệm gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ hoạt hóa bề mặt succinic anhydride N, N-diisopropyethylamine [11] Methyl methacrylate SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 34 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM acid acrylic [6] Em hi vọng phương pháp đem lại hiệu suất gắn kết cao tiết kiệm lượng kháng thể đưa vào Bên cạnh đó, sau chọn phương pháp tối ưu để gắn kháng thể em tiếp tục tối ưu quy trình việc khảo sát yếu tố quy trình nhiệt độ, thời gian ủ, nồng độ kháng thể, lượng hạt sắt từ,… SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 35 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Cao Xuân Hữu, Đề tài tiềm mã số KC.03.TN10/11-15 "Hệ thống đo đạc phân tách phân tử sinh học sử dụng hạt nhân na no từ tính", Đại học Bách khoa Đà Nẵng, 2013 [2] Tống Kim Thuần, Nghiên cứu ứng dụng hạt nano phát quang vào việc đánh dấu tế bào để xác định số lượng vi khuẩn gây độc thực phẩm, Viện công nghệ sinh học, 2011 [3] Vuna- Hội tiết niệu- thận học Việt Nam, Hướng dẫn chẩn đoán điều trị ung thư tuyến tiền liệt, Nhà xuất y học Hà Nội, 2014 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [4] S Bispoa A C A Roquea, A R N Pinheiroa, J M A Antunesa, D Gonc ¸alvesb and H A Ferreirab, Antibody immobilization on magnetic particles, 2008 [5] Alina V Petrakova Alexandr E Urusov 1, Maxim V Vozniak 2, Anatoly V Zherdev and Boris B Dzantiev 1, Rapid Immunoenzyme Assay of Aflatoxin B1 Using Magnetic Nanoparticles, 2014 [6] Filiz Sayar Arzum Erdem, b Hakan Karadeniz, Guldem Guven,b Mehmet Ozsoz,Erhan Piskinb, Development of Streptavidin Carrying Magnetic Nanoparticles and Their Applications in Electrochemical Nucleic Acid Sensor Systems, 2006 [7] Inc Clinton F.LANE Aldrich-boranes, Milwaukee, Wisconsin and USA 53233, Sodium cyanoborohyde- A highly selective Ruducing Agent for Organic Functional Groups, 2013 [8] Marcel Dekker, Brawer-Prostate Specific Antigen 2001: p 84-90, 104-110 [9] Dr Paolo Facci, Synthesis and bio-functionalization of nanoparticles for biosensing and biorecognition, 2011 [10] Moon Il Kim Min-Ah Woo, Jae Hwan Jung, Ki Soo Park, Tae Seok Seo, and Hyun Gyu Park, A Novel Colorimetric Immunoassay Utilizing the Peroxidase Mimicking Activity of Magnetic Nanoparticles, 2013 [11] Sang-Myung Lee Min-Ah Woo, Gunsung Kim, JongHo Baek, Mi Suk Noh, Ji Eun Kim,Sung Jin Park, Arash Minai-Tehrani, Se-Chang Park, Yeong Tai Seo, YongKwon Kim,Yoon-Sik Lee, Dae Hong Jeong, and Myung-Haing Cho, Multiplex Immunoassay Using Fluorescent-Surface Enhanced Raman Spectroscopic Dots for the Detection of Bronchioalveolar Stem Cells in Murine Lung, 2009 [12] Q Chaudry Y Xing, C Shen, et al, Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry, Nat Protocols, 2007, page1152-1165 SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 36 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM TÀI LIỆU WEB [13] http://phongkhamkhuongtrung.com/nam-khoa/tuyen-tien-liet/ung-thu-tuyen-tienliet/772-phuong-phap-chuan-doan-ung-thu-tuyen-tien-liet.html [14] http://thuocmoi.com.vn/dong-trung-ha-thao/15220-ch%E1%BB%89s%E1%BB%91-x%C3%A9t-nghi%E1%BB%87m-total-psa-l%C3%A0g%C3%AC.html [15] http://vast.ac.vn/tin-tuc-su-kien/tin-khoa-hoc/trong-nuoc/563-nghien-cuu-taophuc-hop-khang-the-hat-nano-silica-phat-quang-de-phat-hien-nhanh-vi-khuangay-benh [16] http://vietbao.vn/Suc-khoe/Cach-mang-nano-trong-ung-dung-y-sinhhoc/65042822/248/ [17] https://www.youtube.com/watch?v=wK4TTM8deyk SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 37 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần đệm PBS (Phosphas Buffer) 500ml, pH= 7.4 - KCl: 0.1g - NaCl: 4g - Na2HPO4.12H2O 0.72g - KH2PO4 0.12g Pha nước cất lần Phụ lục 2: Thành phần đệm PBS chứa 0.2M Tris- HCl NaCNBH3, 28ml - Tris- base 0.33908g - NaCNBH3 0.14g Pha đệm PBS (Phụ lục 1) Phụ lục 3: Pha đệm PBS chứa 0.05% Tween 20: Cho 0.01ml Tween 20 vào 19.99 ml PBS Phụ lục 4: Số liệu đo nồng độ hạt sắt từ - M1= 13.2392 g - M2= 13.2629 g - M1-M2= 23.7 g Phụ lục 5: Số liệu Mục 3.1.1, Biến thiên giá trị OD280nm theo nồng độ Streptavidin Nồng độ Streptavidin (mg/ml) 0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 OD lần 0.137 0.279 0.475 0.821 1.176 1.492 OD lần 0.137 0.278 0.474 0.820 1.178 1.491 OD lần 0.138 0.277 0.477 0.821 1.177 1.491 SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 38 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Phụ lục 6: Số liệu mục 3.1.2, Sự khác giá trị OD mẫu đối chứng (MNPs- Streptavidin- HRP- nhiệt độ) mẫu thí nghiệm (MNPsStreptavidin- HRP) Mẫu Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm (MNPs- (MNPs- Streptavidin- HRP- Streptavidin- HRP) nhiệt độ) Lặp lần Lặp lần OD lần 0.15 0.409 0.536 0.356 OD lần 0.144 0.389 0.504 0.33 Phụ lục 7: Số liệu mục 3.2.1, Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs MNPs (µg) 17.5 35 52.5 70 OD lần 0.794 1.104 2.003 2.577 2.621 OD lần 0.7995 1.104 1.994 2.561 2.629 Phụ lục 8: Số liệu mục 3.2.3, Sự biến thiên delta OD theo nồng độ kháng thể khảo sát lượng kháng thể gắn MNPs Nồng độ kháng thể 160X 80X 40X OD lần 2.205 2.352 2.566 2.489 OD lần 2.206 2.349 2.425 2.48 OD lần 2.206 2.351 2.496 2.485 SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 39 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Phụ lục 9: Số liệu mục 3.2.4, Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs Lượng MNPs (µg) 10 20 30 40 OD lần 0.678 1.462 2.154 2.415 OD lần 0.687 1.444 2.148 2.366 OD lần 0.672 1.436 2.140 2.356 Phụ lục 10: Số liệu mục 3.2.5, Biến thiên giá trị OD theo lượng sắt từ Nồng độ kháng thể 320X 160X 80X 40X OD1 0.06 0.068 0.049 0.078 0.057 OD2 0.06 0.074 0.053 0.055 0.058 ODTb 0.06 0.071 0.051 0.0665 0.0575 deltaOD 0.011 -0.009 0.0065 -0.0025 SVTH: NGUYỄN NỮ ZEN NA- 10SH 40 ... ? ?Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt? ?? em đạt kết khả quan sau: - Xây dựng phương pháp cố định kháng thể lên hạt nano sắt từ. .. thể kháng kháng nguyên PSA để chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt? ?? Bước đầu, em khảo sát khả cố định kháng thể kháng PSA lên hạt nano sắt từ mà đảm bảo giữ nguyên hoạt tính sinh học kháng thể SVTH:... Ngành : Cơng Nghệ Sinh Học Tên đề tài: ? ?Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến? ?? Nội dung phần: - Lời cảm ơn - Mục lục - Danh