Nghiên cứu ứng dụng các chỉ thị phân tử miRNA trong chẩn đoán bệnh ung thư vú

Nghiên cứu ứng dụng các chỉ thị phân tử miRNA trong chẩn đoán bệnh ung thư vú.Theo các kết quả nghiên cứu gần đây, các microRNA (miRNA) là một ứng cử viên tốt trong vai trò là chất chỉ điểm sinh học trong việc phát hiện và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú.

LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học trường Đại Học Bách Khoa – ĐH Đà Nẵng, em học hỏi tích lũy nhiều kiến thức quý giá, nhiều kinh nghiệm học tập hay hoạt động ngoại khóa…Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất thầy cô công tác trường này, thầy cô khoa Hóa, đặc biệt thầy môn Công Nghệ Sinh Học dạy dỗ, bảo nhiệt tình giúp đỡ em suốt thời gian em ngồi ghế nhà trường Trong suốt trình em thực đề tài này, em xin chân thành gởi lời cảm ơn đến thầy giáo TS Đặng Đức Long, thầy ThS Tạ Ngọc Ly hướng dẫn tận tình, bảo em, cho em lời khuyên em vấp phải khó khăn hoàn thành đề tài Em chân thành gửi lời cảm ơn đến cán y tế sở y tế địa bàn Đà Nẵng cán phịng thí nghiệm trường Đại học Duy Tân nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho em thời gian em thu nhận mẫu hoàn thành hạng mục cần có đề tài Em xin cảm ơn chân thành tới thầy cô phụ trách phịng thí nghiệm mơn Cơng Nghệ Sinh Học trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng anh chị khóa tạo điều kiện thuận lợi để giúp em hồn thành thí nghiệm Con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, anh chị em nhà cố gắng tạo điều kiện thuận lợi, tốt động viên lúc khó khăn để hồn thành tốt tất việc suốt trình học tập Mình xin gửi lời cảm ơn đến tất bạn bè ln ủng hộ động viên Trong thời gian làm đồ án khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong thầy thơng cảm bỏ qua cho em Đà Nẵng, ngày 04 tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực Trần Thị Bích Ngọc SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang i Đồ án tốt nghiệp Long SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH GVHD : TS.Đặng Đức Trang ii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH VẼ vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT LUẬN VĂN ix ABSTRACT x LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ung thư vú vấn đề liên quan .3 1.1.1.Khái niệm ung thư vú 1.1.2 Tình hình mắc bệnh ung thư vú giới nước .3 1.1.3 Vấn đề chẩn đoán ung thư vú .4 1.1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 1.1.3.2 Phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng .5 1.2 Chỉ điểm sinh học ung thư microRNA 1.2.1 Chỉ điểm sinh học ( bio-maker) – điểm sinh học ung thư .6 1.2.1.1 Chỉ điểm sinh học ( bio-maker) .6 1.2.1.2 Chỉ điểm sinh học ung thư 1.2.2 Tổng quan microRNA 1.2.2.1 Khái niệm 1.2.2.2 Cơ chế hình thành miRNA SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang iii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức 1.2.2.3 Chức vai trò miRNA thể .10 1.2.2.4 Tác động miRNA lên ung thư nói chung 11 1.2.2.5 Đặc tính miRNA hệ thống máu 12 1.3 Giới thiệu số miRNA dùng chẩn đoán ung thư vú .13 1.4 Giới thiệu số phương pháp định lượng miRNA 15 1.4.1 Phương pháp Microarray 15 1.4.2 Giải chuỗi trình tự microRNA (miRNA sequencing hay miRNA-seq) .16 1.4.3 Phương pháp qRT-PCR .16 1.4.3.1 Phản ứng PCR ( Polymerase Chain Reaction ) 16 1.4.3.2 Phản ứng real time PCR 17 1.4.3.3 Nguyên tắc thực phản ứng realtime PCR đầu dò Taqman .18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Mục đích nghiên cứu 21 2.2 Vật liệu phương pháp tiến hành 21 2.2.1 Mẫu nghiên cứu 21 2.2.2 miRNA dùng nghiên cứu 21 2.2.3 Quy trình thực tổng quát 22 2.2.4 Hóa chất 23 2.2.5 Dụng cụ thiết bị 24 2.2.4.1 Dụng cụ 24 2.2.4.2 Thiết bị 24 2.3 Thu tách chiết tổng small RNA từ huyết 24 2.3.1 Thu thập mẫu máu li tâm tách huyết 24 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang iv Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức 2.3.1.1 Mẫu thí nghiệm 24 2.3.1.2 Phương pháp thực 25 2.3.1.3 Phương pháp bảo quản mẫu 25 2.3.2 Thu nhận tách chiết tổng small RNA từ huyết 25 2.3.2.1 Mẫu thí nghiệm 25 2.3.2.2.Phương pháp tiến hành 25 2.3.3 Kiểm tra nồng độ tổng small RNA sau tách chiết .28 2.3.3.1 Mẫu thí nghiệm 28 2.3.3.2 Phương pháp tiến hành 28 2.3.3.3 Cách tiến hành .28 2.4 Thực phản ứng định lượng realtime -PCR 29 2.4.1 Phương pháp tiến hành .29 2.4.2 Thiết kế mồi đặc hiệu sử dụng đề tài .30 2.4.3 Quy trình thực phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA 32 2.4.4 Thực phản ứng RT-PCR ( singleplex) cho mục tiêu : miR-155, miR-195, miR-16 miR-21 34 2.5 Xử lí số liệu 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Thống kê tình hình nhóm bệnh nhân có bệnh 36 3.2 Kết đo nồng độ RNA 37 3.3 Giai đoạn chạy phản ứng Reverse Transcription 40 3.4 Kết chạy realtime –PCR 41 3.4.1 Biểu đồ khuếch đại realtime PCR cho mẫu 41 3.4.2 Giá trị chu kì ngưỡng Ct 42 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang v Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức 3.4.3 So sánh mức độ biểu tương đối miRNA nhóm đối tượng 43 3.4.4 Giá trị fold change nhóm bị bệnh .45 3.4.5 Mối quan hệ tình trạng bệnh nhân giá trị fold change 46 3.5 Kiểm chứng miR-16 – miRNA reference 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận .51 4.2 Kiến nghị .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang vi Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 : Các loại ung thư vú Hình 1.2 : Tỉ lệ loại ung thư Việt Nam .4 Hình 1.3 : Các triệu chứng bệnh ung thư vú Hình 1.4 : Cơ chế hình thành miRNA 10 Hình 1.5 : Cơ chế tác động miRNA .11 Hình 1.6 : Đường biểu diễn nhân ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sáng kích thích vào chu kì nhiệt 18 Hình 1.7 : Cơ chế phát huỳnh quang Taqman probe chu kì nhiệt 19 Hình 2.1 : Hình ảnh ống nghiệm đựng máu 25 Hình 2.2 : Sơ đồ quy trình tách chiết thu tổng small RNA mirVana TM PARISTM KIT 27 Hình 2.3 : Máy đo NanoDrop 2000 28 Hình 2.4 : Phản ứng realtime-PCR giai đoạn 30 Hình 2.5 : Cấu trúc mồi RT stem – loop .31 Hình 2.6 : Cấu trúc tổ hợp mồi cho phản ứng RT-PCR định lượng miRNA .31 Hình 2.7 : Sơ đồ quy trình thực phản ứng phiên mã ngược 33 Hình 2.8 : Sơ đồ quy trình thực phản ứng realtime-PCR 34 Hình 3.1 : Biểu đồ khuếch đại realtime PCR 41 Hình 3.2 :Biểu đồ thể giá trị Ct trung bình 42 Hình 3.3 : Biểu đồ thể mối quan hệ giá trị RQ miRNA mục tiêu mẫu 45 Hình 3.4 : Biểu đồ khuếch đại miR-16 nhóm đối tượng 49 Hình 3.5 : Biểu đồ giá trị Ct miR-16 qua mẫu .49 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang vii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Thống kê số điểm sinh học loại ung thư .8 Bảng 2.1 Trình tự miRNA dùng để định lượng 22 Bảng 3.1 Bảng thống kê tình hình bệnh nhân 36 Bảng 3.2 Bảng thống kê độ tuổi nhóm bệnh 36 Bảng 3.3 Kết đo nồng độ RNA 38 Bảng 3.4 Thống kê giá trị trung bình nồng độ RNA A260/280 nhóm đối tượng 39 Bảng 3.5 Bảng tổng hợp giá trị Ct trung bình 43 Bảng 3.6 Bảng thống kê fold changes miRNA .44 Bảng 3.7 Giá trị RQ mẫu bệnh .46 Bảng 3.8 Bảng thống kê mối quan hệ tương quan tình trạng bệnh nhân giá trị fold change miRNA mục tiêu 47 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang viii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Rinonucleid acid cDNA : complement DNA mRNA : RNA thông tin miRNA : microRNA PCR : Polymerase Chain Reaction qRT-PCR : quantification realtime- polymerase Chain Reaction RT : Reverse Transcription Ct : Cycle threshold RQ : Relative Quantitation = fold change SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang ix Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức TÓM TẮT LUẬN VĂN Theo kết nghiên cứu gần đây, microRNA (miRNA) ứng cử viên tốt vai trò chất điểm sinh học việc phát chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú Trong nghiên cứu này, lần khảo sát nồng độ miRNA huyết với đối tượng bệnh nhân người Việt Nam, để từ xây dựng sở để áp dụng miRNA vào việc chẩn đoán ung thư vú tương lai Nồng độ tương đối miRNA : miR-155, miR-195, miR-21 miR-16 huyết 26 bệnh nhân ung thư vú, người phụ nữ khỏe mạnh đo phương pháp dùng Taqman MicroRNA Assay Kết thu cho thấy hầu hết, tất mẫu tách tổng RNA nhỏ (bao gồm miRNA), nhiên lượng tách không chênh lệch lớn; biểu miRNA : miR-155 miR-21 huyết người bệnh có khuynh hướng giảm so với nhóm khỏe mạnh, cịn miR-195 lại thấy có tăng so với nhóm khỏe mạnh ( gấp 1,33 lần), nên miR-195 xem miRNA có khác biệt rõ Nghiên cứu bước đầu cho thấy có thay đổi nồng độ miRNA nhóm khác nhau, chứng tỏ tiềm phát triển hướng chẩn đoán cho bệnh ung thư vú mức độ biểu miRNA huyết người SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang x Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức ngưỡng trung bình ( Ct ) tất miRNA nhóm đối tượng bị bệnh có xu hướng tăng so với nhóm khỏe mạnh, chứng tỏ nồng độ biểu miRNA mục tiêu huyết người bệnh có khuynh hướng giảm so với đối tượng khỏe mạnh Tuy nhiên, báo nghiên cứu nước ngoài, thay đổi nồng độ miR-195 huyết có khuynh hướng tăng nhóm đối tượng bị bệnh so với khỏe mạnh, miRNA khác miR-155 miR-21 có khuynh hướng giảm Vì vậy, ta thấy khác biệt rõ rệt mức độ biểu miR-195 đối tượng nghiên cứu khác nhau, tùy theo vùng miền, quốc gia, địa lý,… 3.4.3 So sánh mức độ biểu tương đối miRNA nhóm đối tượng So sánh mức độ biểu miRNA tương đối nhóm bệnh nhân bị bệnh với nhóm khỏe mạnh, ta sử dụng phương pháp tính tốn so sánh ngưỡng chu kì ( Comparative Cycle Thresold (Ct) method) Các giá trị Ct trung bình miR-16 ( reference) mẫu trừ vào giá trị Ct trung bình cho miRNA khác cho phản ứng, kết ta ΔCt Mức độ thay đổi ( the fold changes) miRNA tính theo phương trình 2-ΔΔCt, ΔΔCt = ΔCt ( sample ) – ΔCt ( control) Với sample : mẫu bị bệnh control : mẫu đối chứng khỏe mạnh Chúng ta sử dụng phương pháp delta Ct để xử lí số liệu, lượng miRNA cá nhân thay đổi phụ thuộc nhiều yếu tố, quy chuẩn với loại miRNA với miR-16 xác hơn… Dưới biểu đồ bảng tổng hợp thể giá trị fold change miRNA mục tiêu mẫu bị bệnh so với mẫu nhóm khỏe mạnh, với fold change thể giá trị RQ ( Relative quantification ) xây dựng phần mềm tính tốn thiết bị chạy realtime hãng target thể miRNA mục tiêu SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lvii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức Ở đây, ta tính tốn cho vài mẫu chạy Dưới bảng thống kê kết tính tốn : Bảng 3.8 Bảng thống kê fold changes miRNA ΔCt samples ΔCt control ΔΔCt Fold changes (2-ΔΔCt) miR-16 0 miR-155 7,90 9,24 1,34 0,39 miR-195 7,63 7,21 -0,41 1,33 miR-21 5,73 5,78 0,05 0,97 Nhận xét kết quả, dựa vào bảng trên, miR-155, miR-195,miR-21 mẫu bệnh có mức độ biểu thay đổi gấp 0,39 lần; 1,33 lần 0,97 so với mẫu người khỏe mạnh Trong số miRNA mục tiêu miR-195 có mức độ thay đổi cao huyết người bị bệnh, có khả dùng làm thị để phát bệnh tốt Tuy RNA từ huyết qua q trình tách chiết khơng đạt độ tinh phù hợp sau chạy phản ứng realtime –PCR định lượng ta thấy khuếch đại miRNA mục tiêu tốt Do chênh lệch độ tuổi nhóm bệnh nên phần ảnh hưởng đến kết nghiên cứu Vì vậy, cần phải thu thập đối tượng mẫu chứng có độ tuổi gần so với mẫu bị bệnh để kết nghiên cứu sau không bị lệch nhiều tương đối xác SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lviii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức 3.4.4 Giá trị fold change nhóm bị bệnh Hình 3.17 : Biểu đồ thể mối quan hệ giá trị RQ miRNA mục tiêu mẫu Bảng 3.9 Giá trị RQ mẫu bệnh RQ Control miR-16 miR-155 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH miR-195 miR-21 Trang lix Đồ án tốt nghiệp Long 3G 3I 3K GVHD : TS.Đặng Đức 0,13 1,51 0,28 1,07 0,89 0,72 0,44 1,76 4,58 Dựa vào biểu đồ bảng trên, ta nhận thấy rằng, giá trị fold change miR-155 chạy từ 0,13 đến 1,07; miR-195 chạy từ 0,89 đến 1,76; miR-21 chạy từ 0,28 đến 4,58 Sự chênh lệch giá trị fold change mục tiêu qua mẫu khác lớn, cho thấy có thay đổi nồng độ miRNA giai đoạn phát triển bệnh khác nhau, mức độ chênh lệch mục tiêu miR-21 Trung bình giá trị fold change nằm khoảng từ 2, có đột biến giá trị mẫu 3K với mục tiêu miR21, 4,58 Ở mẫu 3G, miR-195 có thay đổi lớn nhất; cịn mẫu 3I miR155 có thay đổi lớn nhất, nhiên, chênh lệch giá trị miRNA mẫu 3I có thay đổi khơng đáng kể; cịn mẫu 3K, miR-21 có chênh lệch lớn Ta thấy, mẫu, biểu miRNA khác nhau, nhiên, mức độ thay đổi mẫu bị bệnh mẫu chứng khơng cao, thể có thay đổi cần phải có kết tốt hơn, có chênh lệch độ tuổi nhóm đối tượng nhóm mẫu chứng khơng tốt cho nên kết thể tương đối phần 3.4.5 Mối quan hệ tình trạng bệnh nhân giá trị fold change Bảng 3.10 Bảng thống kê mối quan hệ tương quan tình trạng bệnh nhân giá trị fold change miRNA mục tiêu SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lx Đồ án tốt nghiệp Long Tình trạng GVHD : TS.Đặng Đức Số Giá trị fold change lượng ( median ± Standard deviation) miR-155 miR-195 miR-21 M0 1,07±0,00 0,89±0,00 0,71±0,00 M1 2,06±0,99 1,64±0,13 2,43±2,71 ER(-) 0,76±0,31 1,33±0,44 2,65±1,93 ER(+) PR(-) 0,76±0,31 1,33±0,44 2,65±1,93 PR(+) ki67 + 1,07±0,00 0,89±0,00 0,71±0,00 ki67 - her-2/neu - her-2/neu + 0,76±0,31 1,33±0,44 2,65±1,93 Độ tuổi 50 0,13±0,00 1,51±0,00 0,28±0,00 Độ tuổi 50 ( 40÷50) 0,76±0,31 1,33±0,44 2,65±1,93 Thông qua bảng trên, nhận xét : nhóm bệnh nhân di căn( M1) giá trị fold change miRNA mục tiêu cao so với nhóm bệnh nhân chưa di ( M0) Cụ thể, mục tiêu miR-155, nhóm bệnh nhân M1 có giá trị fold change 2,06±0,99; cịn nhóm bệnh nhân M0 1,07±0,00, suy giá trị fold change M1 gần gấp đơi so với nhóm M0 Tương tự, mục tiêu miR-195, nhóm bệnh nhân M1 có giá trị fold change 1,64±0,13- giá trị gần gấp đơi so với nhóm M0; cịn mục tiêu miR-21, nhóm M1 có giá trị fold change 2,43±2,71, có giá trị cao gấp lần so với nhóm M0 Trong nhóm M1, ta thấy chênh lệch miR-21 mẫu SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxi Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức lớn, cịn miR-195 khơng thay đổi bao nhiêu, cho thấy miR-195 có nồng độ ổn định nhóm Với thơng số khác, ER hay PR, Ki67 Her-2/neu, có biểu giá trị âm dương thông số, nên so sánh mức độ biểu miRNA mục tiêu vấn đề Tuy nhiên, nhìn bảng trên, ta nhận thấy có mối liên hệ giá trị PR, ER, âm giá trị fole change miRNA mục tiêu giống với nhóm có biểu Her-2/neu dương; nhóm này, cho thấy, miR-21 miRNA có thay đổi lớn ( giá trị fold change cao nhất) miR-21 có chênh lệch lớn mẫu nhóm Về nhóm độ tuổi, ta thấy, nhóm tuổi 50, tất miRNA mục tiêu có giá trị thấp so với nhóm tuổi 50 ( từ 40 đến 50), ngoại trừ miR-195 ngược lại ( khơng thay đổi nhóm) miR-195 có giá trị fold change cao Ngược lại, nhóm tuổi 50 miR-21 cho thấy thay đổi lớn 3.5 Kiểm chứng miR-16 – miRNA reference Theo nhiều nghiên cứu trước, cho rằng, miR-16 có khả làm reference cho miRNA khác chúng có mức độ biểu tốt cộng với độ ổn định có thay đổi nhóm đối tượng khác Ta cần kiểm chứng để xem mức độ biểu miR-16 có ổn định nghiên cứu lần hay không Dưới đây, biểu đồ thống kê giá trị Ct miR-16 mẫu nhóm đối tượng khác : SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức Hình 3.18 : Biểu đồ khuếch đại miR-16 nhóm đối tượng Hình 3.19 : Biểu đồ giá trị Ct miR-16 qua mẫu Dựa vào biểu đồ trên, ta thấy nhóm đối tượng bị bệnh giá trị Ct miR-16 có tính ổn định khơng chênh lệch nhiều, giá trị chạy từ : 23,37 tới 27,18, có giá trị trung bình 25,58; khoảng dao động không nhiều nên mức độ biểu miR-16 mẫu nhóm đối tượng bị bệnh có tính ổn định tương đối SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxiii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức So với nhóm đối tượng bị bệnh giá trị chu kì ngưỡng Ct trung bình miR-16 nhóm khỏe mạnh có phần thiếu ổn định, độ chênh lệch giá trị nhỏ lớn cao, từ 21,06 đến 28,63, có giá trị trung bình 24,1; nghĩa nhóm này, tính ổn định miR-16 nhóm khơng khả quan so với nhóm bệnh Tuy nhiên, mức độ biểu miR-16 cao tất mẫu nhóm đối tượng Vì vậy, dùng miR-16 để làm reference cho miRNA mục tiêu khác đề tài SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxiv Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau trình thực đề tài này, em rút kết luận sau : Hồn thiện quy trình định lượng miRNA mục tiêu có mẫu thuộc nhóm đối tượng từ huyết phương pháp chạy phản ứng realtime PCR với giai đoạn sử dụng Taqman MicroRNA Assay, gồm bước sau :  Bước : Thực phản ứng phiên mã ngược ( Revverse Transcription ) tạo cDNA từ RNA tách chiết mồi RNA đặc hiệu- stemloop RT RNA cung cấp từ Taqman MicroRNA Assay với hóa chất dùng Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit 200 reaction size  Bước : Ở giai đoạn thực phản ứng PCR, sản phẩm PCR khuếch đại từ mẫu cDNA mồi đặc hiệu cho miRNA mục tiêu khác Taqman MicroRNA Assay cho mồi khác nhau, sử dụng thêm TaqMan® Universal PCR Master Mix II (2X), no UNG Việc tách chiết tổng small RNA từ huyết người thực thành công Tuy nhiên Lượng RNA tách chiết mẫu khác có chênh lệch lớn khơng ổn định qua đó, độ tinh sản phẩm không khả quan cho Một phần nguyên nhân dẫn tới điều tính chất mẫu hóa chất phần thao tác trình thực có sai sót Việc thực phản ứng định lượng realtime-PCR cho miRNA mục tiêu số mẫu cho kết khả quan Tổng kết lại, mức độ biểu miRNA mục tiêu nhóm đối tượng có thay đổi đáng kể, nhiên thấp so với báo nghiên cứu từ trước Tổng kết lại, với mục tiêu đề tài sử dụng miRNA để chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú, sau q trình thực hiện, thấy thay đổi mức độ biểu SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxv Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức miRNA mục tiêu nhóm đối tượng khác giai đoạn phát triển bệnh khác nhau, thông qua giá trị fold change, sử dụng phương pháp tính -ΔΔCt cho thấy miR-195 có thay đổi lớn nhóm đối tượng bị bệnh khỏe mạnh Cịn nhóm đối tượng bị bệnh, miR-21 cho thấy thay đổi lớn hầu hết giai đoạn số liệu liên quan tới tình trạng bệnh nhân Dẫn đến, phần áp dụng phương pháp để chẩn đoán sớm bệnh thư vú tương lai 4.2 Kiến nghị Do chênh lệch độ tuổi nhóm đối tượng nghiên cứu bị bệnh khỏe mạnh lớn, nên dẫn kết cuối khơng tốt cho lắm, rõ thay đổi miRNA mục tiêu nhóm đối tượng Cho nên cần phải tập hợp lại nhóm đối tượng khỏe mạnh có độ tuổi tương đương với nhóm bị bệnh Nồng độ RNA mẫu không đồng không ổn định độ tinh không cao, cần phải sốt lại q trình thực đưa biện pháp khắc phục Hướng sử dụng phương pháp khác để tách RNA, sau so sánh sản phẩm RNA phương pháp phương pháp điện di, để xem thử phương pháp cho kết tốt Do số lượng mẫu để thực phản ứng định lượng realtime-PCR không nhiều, nên kết tổng quát lên thay đổi miRNA khác nhóm khác khơng thể đánh giá kết có ý nghĩa hay khơng Nên cần thực lại tất quy trình với số lượng mẫu lớn hơn, tốt cần cẩn thận thao tác thực Do chưa thể đánh giá chất lượng sản phẩm sau trình tách chiết thu tổng small RNA từ huyết thanh, sản phẩm bị phân cắt từ phân tử lớn phân tử khơng bị phân cắt Cần tìm hiểu cách đánh giá chất lượng bổ sung vào quy trinh cho hoàn thiện SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxvi Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC [1] Đặng Đức Long ( 2013) Các kỹ thuật sinh học phân tử Khoa Hóa, ĐH Bách Khoa-ĐH Đà Nẵng [2] Phùng Phướng (1999), “Góp phần nghiên cứu giá trị kết hợp lâm sàng, chụp X quang tuyến vú xét nghiệm chọc hút tế bào chẩn đoán UTV", Luận văn thạc sỹ y học, Trường Đại học y khoa Huế TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI [3] Ambros V (2003) MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing Cell, 113, 673-676 [4] Banks M., Reeves G (2004), “Influence of personal characteristics of individual women on sensitivity and specificity of mammography in the Million Women Study” ,Cohort study BMJ: 329-377 [5] Bartel D.P (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function Cell, 116, 281-297 [6] Brisco P., Sankbeil J., Kephart D (1997), “RNA Purification: A Rapid and Versatile Protocol for the Isolation of Total RNA” Promega Notes 64: [7] Carthew R.W., Sontheimer E.J (2009), “Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs”, Cell, 136: 642-655 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxvii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức [8] Castañeda C.A., Agullo-Ortuño M.T., Fresno Vara J.A., Cortes-Funes H., Gomez H.L., Ciruelos E (2011) “Implication of miRNA in the diagnosis and treatment of breast cancer” Expert Rev Anticancer Ther.; 11(8): 1265-1275 [9] Cho W C (2010) MiRNAs in cancer – from research to therapy Biochim Biophys Acta, 1805, 209–217 [10] Garzon R., Calin G.A., Croce C.M (2009) MicroRNAs in Cancer Annual Review in Medicine, 60, 167-179 [11] Kenneth J Livak and Thomas D Schmittgen (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the -ΔΔCt Method Elsevier Science (USA), 402-408 [12] Lawrie C H., Gal S., Dunlop H M et al (2008) Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma British Journal of Haematology, 141 (5), 672–675 [13] Mitchell P.S., Parkin R., Kroh E.M et al (2008) Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection PNAS, 105(30), 10513–10518 [14] Paul D.C., Johnson S.M (2008), “Breast cancer screening and diagnostic”, Gynecology and obstetrics: New treatment guidelines, Current clinical strategies Publishing: 18 – 20 [15] Peck R., Devore J.L (2011) “Statistics: The Exploration and Analysis of Data” Cengage Learning : 464–465 [16] Perou C.M., Sorlie T., Eisen M.B., et al (2000), “Molecular portraits of human breast tumours” Nature; 406(6797): 747-752 [17] Pisano E.D., Gatsonis C., Hendrick E., et al (2005) “Diagnostic performance of digital versus film mammography for breast-cancer screening” N Engl J Med.; 353: 1773-1783 [18] Pritchard C.C., Cheng H.H., Tewari M (2012) “MicroRNA profiling: approaches and considerations” Nat Rev Genet., 13(5): 358-369 [19] Puissant C., Houdebine L.M (1990)."An Improvement of the Single-Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction" BioTechniques 8: 148 – 149 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxviii Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức [20] Protocol “ TaqMan® Small RNA Assays”, 2011, Life Technologise [21] Roth C., Rack B., Müller V., Janni W., Pantel K., Schwarzenbach H (2010) “Circulating microRNAs as blood-based markers for patients with primary and metastatic breast cancer” Breast Cancer Research, 12: R90 [22] Saslow D., Boetes C., Burke W., et al (2007) “American Cancer Society guidelines for breast screening with MRI as an adjunct to mammography” CA Cancer J Clin.; 57:75-89 [23] Shah N.R., Chen H (2014) “MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment” World J Clin Oncol.; 5(2): 48–60 [24] Si H., Sun X., Chen Y., Cao Y., Chen S., Wang H., Hu C (2013) “Circulating microRNA-92a and microRNA-21 as novel minimally invasive biomarkers for primary breast cancer” J Cancer Res Clin Oncol.;139(2): 223-229 [25] Shingara J., Keiger K., Shelton J., et al (2005) “An optimized isolation and labeling platform for accurate microRNA expression profiling” RNA, 11:1461–1470 [26] Smith RA, Saslow D, Sawyer KA, et al (2003) “American Cancer Society guidelines for breast cancer screening: Update 2003” CA Cancer J Clin.;53: 141-169 [27] Sun Y., Wang M., Lin G., Sun S., Li X., Qi J., Li J (2012 ) “Serum microRNA-155 as a potential biomarker to track disease in breast cancer” PLoS One; 7(10): e47003 [28] Swets J.A (1996) “Signal detection theory and ROC analysis in psychology and diagnostics : collected papers” Lawrence Erlbaum Associates, Mahwah, NJ, USA [29] Taplin S., Abraham L., Barlow W E., et al (2008), “Mammography facility characteristics associated with interpretive accuracy of screening mammography”, Journal of the National Cancer Institute, 100( 12): 876–887 [30] Thompson A., Brennan K., Cox A., et al (2008), “Evaluation of the current knowledge limitations in breast cancer research: a gap analysis”, Breast Cancer Research 10(2), article R26 [31] Torres A., Torres K., Wdowiak P., Paszkowski T., Maciejewski R (2013) “Selection and validation of endogenous controls for microRNA expression studies in endometrioid endometrial cancer tissues” Gynecol Oncol.; 130(3): 588-594 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxix Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức [32] Tra cứu file “TaqMan® MicroRNA Assays miRBase v20” cung cấp hãng Life Technology ( 2013) [33] Uehara M., Kinoshita T., Hojo T., Akashi-Tanaka S., Iwamoto E., Fukutomi T (2008), “Long-term prognostic study of carcinoembryonic antigen (CEA) and carbohydrate antigen 15-3 (CA 15-3) in breast cancer”, International Journal of Clinical Oncology 13(5): 447–451 [34] Van Schooneveld E., Wouters M.C., Van der Auwera I., et al (2012) “Expression profiling of cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum from patients with (metastatic) breast cancer and healthy volunteers” Breast Cancer Res.; 21; 14(1): R34 [35] Van Schooneveld E., Wouters M.C., Van der Auwera I., et al (2012) “Expression profiling of cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum from patients with (metastatic) breast cancer and healthy volunteers” Breast Cancer Res.; 21; 14(1): R34 [36] World Health Organization, (2014), “World Cancer Report 2014” Chapter 5.2 ISBN 92-832-0429-8 [37] Wu Q., Lu Z., Li H., Lu J., Guo L., Ge Q (2011) Next-generation sequencing of microRNAs for breast cancer detection J Biomed Biotechnol., 2011, e597145 TÀI LIỆU INTERNET [38] http://ykhoa.net/binhluan/nguyenvantuan/23.htm [39] http://hyvong.com.vn/vi/tim-hieu-ve-ung-thu/cac-loai-ung-thu/ung-thu-vu/ [40] http://www.parkwaycancercentre.com/vn/tim-hieu-ve-ung-thu/cac-loai-ungthu/ung-thu-vu/ [41] http://benhvienvanhanh.com/ung-thu-vu/sp-185lvi.html [42] http://hai3c.com/forums/threads/viet-nam-la-nuoc-co-ty-le-mac-benh-ung-thu-caonhat-the-gioi-vay-dau-la-nguyen-nhan-va-giai-phap.93369/ [43] http://www.bmir.vn/index.php/breast-intervention/ung-thu-vu/194-ch-n-doan-xac-dnh-ung-thu-vu [44] http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=3181 SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxx Đồ án tốt nghiệp Long GVHD : TS.Đặng Đức [45] http://dieutri.vn/daicuongungthu/14-3-2013/S3598/Cac-chat-chi-diem-khoi-u-trongung-thu.htm [46] http://hoilaseryhoc.com/hoi-laser-y-hoc-binh-duong/chi-tiet/tim-hieu-nhung-chatchi-diem-/53.html [47] http://vietsciences.free.fr/timhieu/khoahoc/ykhoa/miRNA-pptrilieuungthu.htm [48] https://acrossthegradient.wordpress.com/tag/mirna/ [49] http://luanvan.co/luan-van/chuyen-de-sinh-hoc-phan-tu-ky-thuat-pcr-3193/ [50] http://www.ysinhhocphantu.com/training/ky-thuat-pcr/6/ [51] http://www.ysinhhocphantu.com/training/ky-thuat-real-time-pcr/8/ [52]http://www.vsmmb.com/data/upload_file/File/PCR%20book %201/realtimePCR_basic.pdf [53] http://www.nihe.org.vn/new-vn/dao-tao-ngan-han taphuan412312272/400/Phuong-phap-lay-benh-pham-bao-quan-va-van-chuyen-benhphamchan-doan-vi-rut-gay-benh.vhtm [54] http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx [55] http://ungbuouvietnam.com/yeu-to-nguy-co-va-cac-loai-ung-thu-vu/ [56] http://ungthubachmai.com.vn/tin-tc-a-s-kin/item/826-t%C3%ACnh-h%C3%ACnhm%E1%BA%AFc-b%E1%BB%87nh-ung-th%C6%B0-tr%C3%AAn-th%E1%BA%BFgi%E1%BB%9Bi-v%C3%A0-%E1%BB%9F-vi%E1%BB%87t-nam.html [57] http://prosure.com.vn/about-cancer/what-is-cancer [58] http://ykhoakyhoa.vn/ung-thu/2014/2/nhung-dieu-can-biet-ve-ung-thu-vu-0 [59] http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Biomarker:_D%E1%BA%A5u_%E1%BA %A5n_sinh_h%E1%BB%8Dc_v%C3%A0_gi%E1%BA%A3i_ph%C3%A1p_cho_ch %E1%BA%A9n_%C4%91o%C3%A1n,_tr%E1%BB%8B_li%E1%BB%87u_t %C6%B0%C6%A1ng_lai [60] https://medlatec.vn/chi-tiet/can-lam-sang/psa-va-fpsa-nhung-dau-an-cua-ung-thutuyen-tien-liet-3367-3367.aspx SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH Trang lxxi ... giới Việc ứng dụng sinh học phân tử vào chẩn đoán bệnh ung thư thiết thực, có ý nghĩa thực tiễn, cho nên, em chọn đề tài ? ?Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử miRNA chẩn đoán bệnh ung thư vú? ?? làm đề... phát chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú Trong nghiên cứu này, lần khảo sát nồng độ miRNA huyết với đối tượng bệnh nhân người Việt Nam, để từ xây dựng sở để áp dụng miRNA vào việc chẩn đoán ung thư vú. .. ung thư vú Ung thư vú định nghĩa u (bướu) ác tính có vú Sự phát sinh ung thư vú, giống dạng ung thư khác, hậu rối loạn trình tái sản xuất tế bào[38] Ung thư vú loại bệnh tế bào ác tính (ung thư)