Nghiên cứu định danh loài sán lá gan lớn fasciola spp sử dụng các chỉ thị phân tử ITS 2 và nad1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Vân NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN Fasciola spp SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ ITS-2 VÀ Nad1 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Vân NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN Fasciola spp SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ ITS-2 VÀ Nad1 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Bích Nga PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội - 2018 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Bích Nga người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu, học tập hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn cán Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học nơi tơi thực tập nhiệt tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân người đồng hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình nghiên cứu, học tập hồn thành luận văn Cuối tơi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân khuyến khích, động viên chia sẻ khó khăn với tơi suốt q trình học tập hồn thành nghiên cứu Luận văn nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí Quỹ phát triển Khoa học công nghệ quốc gia (Nafosted) cho đề tài mã số 106-YS.02-2013.06 TS Nguyễn Thị Bích Nga làm chủ nhiệm Học viên Nguyễn Thị Hồng Vân iii MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN………………………………………………………………… i MỤC LỤC……………………………………………………………………… ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………… iv DANH MỤC BẢNG BIỂU…………………………………………………… v DANH MỤC HÌNH ẢNH…………………………………………………… vi MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………… 1.1 Giới thiệu loài sán gan…………………………………………… 1.1.1 Phân loại sinh học……………………………………………………… 1.1.2 Đặc điểm hình thái sán gan……………………………………… 1.1.3 Các giai đoạn phát triển sán gan lớn……………………………… 1.1.4 Vòng đời………………………………………………………………… 1.1.5 Hiện tượng lạc vị trí ký sinh sán gan lớn……………………… 10 1.2 Đặc điểm bệnh sán gan lớn……………………………………… 11 1.2.1 Cơ chế bệnh sinh sán gan lớn…………………………………… 11 1.2.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sán gan Fasciola spp người động vật…… 13 1.2.3 Vật chủ trung gian sán gan lớn…………………………………… 15 1.3 Tầm quan trọng nghiên cứu giám định loài phương pháp sinh học 17 phân tử 1.4 Sơ lược hệ gen nhân ribosomal DNA (Rdna)……………………………… 18 1.5 Hệ gen DNA ty thể (Mitochodrial DNA – mtDNA)………………………… 19 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………… 21 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu………………………………………… 21 2.3 Thiết bị hóa chất………………………………………………………… 21 2.3.1 Thiết bị…………………………………………………………………… 21 iv 2.3.2 Hóa chất………………………………………………………………… 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… 22 2.4.1 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu Fasciola spp………………… 22 2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số………………………………… 23 2.4.3 Thiết kế mồi, thục PCR gen ITS2 gen Nad1………………… 23 2.4.4 Phương pháp giải trình tự……………………………………………… 25 2.4.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu………………………………… 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………………… 28 3.1 Thu nhận gen ITS-2 chuẩn đoán phân biệt………………………… 28 3.1.1 Thu thập mẫu sán gan lớn phân loại hình thái……………………… 28 3.1.2 Sử dụng gen ITS-2 chuẩn đoán phân biệt………………………… 28 3.2 Thu nhận gen Nad1, giải trình tự phân thích mối quan hệ phả hệ…… 35 3.2.1 Kết PCR gen ty thể Nad1……………………………………………… 35 3.2.2 Kết giải trình tự so sánh gen Nad1………………………………… 36 3.2.3 Kết phân tích tỷ lệ đồng trình tự gen Nad1………………… 43 3.2.4 Xây dựng mối quan hệ phả hệ loài thuộc lớp sán gan……… 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………… 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 51 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleotide AST Abnormal Spermatogenic Type NST Normal Spermatogenic Type ITS-2 Second internal transcribed spacer Nad1 Nicotinamide Adenine Dinucleotide dehydrogenase subunit Rdna Ribosome DNA SLGL Sán gan lớn PCR Polymerase chain reaction ddNTP dideoxyribonucleotide triphosphate dNTP deoxyribonucleotide triphosphate bp Cặp bazơ (base pair) TAE Tris base-Acetic-EDTA PAGE Điện di gel polyacylamid EtBr Ethidium Bromide EDTA Ethylene Diamine Tetraacemic Acid OD Mật độ quang học Kb Kilobase Kda Kilodalton µl Microlitre µm Micrometer mm Millimeter vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Danh sách mồi dùng phản ứng PCR thu nhận gen ITS- 24 2, gen ty thể Nad1 Bảng 3.1 So sánh nucleotide vị trí biến đổi gen ITS-2 31 mẫu sán gan lớn vùng địa lý vật chủ khác Bảng 3.2 Các mẫu sán Trematoda Ngân hàng gen cung cấp chuỗi 39 Nad1 sử dụng so sánh đối chiếu nghiên cứu Bảng 3.3 Tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide gen Nad1 loài sán gan thuộc lớp sán dẹp Trematoda vii 45 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh mơ tả hình thái sán gan lớn Fasciola spp Hình 1.2 Hình thể trứng sán gan lớn hình thể ấu trùng Miracidium Hình 1.3 Hình nang ấu trùng sán gan lớn hình nang rediae SLGL Hình 1.4 Hình nang cercariae sán gan lớn hình thể nang ấu trùng SLGL Hình 1.5 Cấu tạo thể sán gan lớn trưởng thành Hình 1.6 Chu trình vòng đời phát triển sán gan lớn Fasciola spp 10 Hình 1.7 Mơ hình cấu trúc ribosome DNA gen nhân vùng gen nghiên 18 cứu (vùng gen ITS-2) Hình 1.8 Mơ hình cấu trúc DNA hệ gen ty thể 19 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 22 Hình 3.1 Hình ảnh sán gan lớn 28 Hình 3.2 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR vùng gen ITS-2 29 Hình 3.3 So sánh trình tự chuỗi nucleotide gen ITS-2 19 mẫu Fasciola spp 31 Hình 3.4 Cây phả hệ thể mối quan hệ loài mẫu SLGL Fasciola 34 spp dựa trình tự nucleotide gen ITS-2 chương trình MEGA6 Hình 3.5 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen Nad1 với cặp mồi 35 FAND1F – FAND1R (~ 1kb) Hình 3.6 Trình tự chuỗi gen Nad1 FspNB-VN; FspHU-VN; FspCB-VN 38 Hình 3.7 So sánh trình tự chuỗi nucleotide gen Nad1 FspNB-VN; 42 FspCB-VN FspHU-VN với chuỗi thuộc lớp sán dẹp Trematode Hình 3.8 Cây phả hệ thể mối quan hệ loài mẫu sán gan dựa thành phần nucleotide gen Nad1 phương pháp MEGA6 viii 46 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Bệnh sán gan lớn (fascioliasis) hai loài Fasciola hepatica Fasciola gigantica thuộc họ Fasciolidae ký sinh động vật nhai lại (trâu, bò, dê, cừu…) dần thích ứng gây bệnh người Trước đây, đặc tính hình thái học (morphology), sinh thái học (ecology) huyết học (serology) thường sử dụng chẩn đoán đáp ứng phần lớn yêu cầu phân loại sinh vật có ngành ký sinh trùng [11] Tuy nhiên phân loại sán gan dựa vào hình thái khó phân định Đặc biệt có tượng lai dạng trung gian (hybrid form) quần thể sán gan phát hiện, hệ gen có trộn lẫn F hepatica F gigantica (Fh/Fg), hệ gen nhân tế bào mang gen từ dòng bố (F hepatica) hệ gen ty thể (F gigantica) mang tính di truyền theo dòng mẹ [9] Bệnh sán gan lớn coi bệnh ký sinh trùng bị lãng quên Tổ chức y tế giới (WHO) quan tâm Sán gan lớn gây bệnh người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, chúng gây tổn thương bệnh lý hệ thống gan mật, gây can xi hóa đường mật, ký sinh lạc chỗ di chuyển lạc lên não gây tổn thương nặng nhu mô gan làm suy gan dẫn đến tử vong [6, 9, 20] Một số trường hợp bệnh sán gan lớn người gây phản ứng viêm, xơ hóa gan, dẫn đến chẩn đoán bị nhầm bệnh ung thư gan [3, 5, 14] Đối với động vật ăn cỏ (trâu, bò, dê, cừu…) nhiễm sán gan lớn làm giảm trọng lượng vật, ốm yếu, thiếu máu bệnh lý, vật không sinh sản, gây thiệt hại lớn kinh tế [2] Vì việc phát sớm xác định xác lồi Fasciola spp gây bệnh cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn chẩn đoán điều trị Chẩn đoán, giám định phân biệt loài Fasciola spp thực phương pháp sinh học phân tử dựa thị di truyền ADN hệ gen nhân hệ gen ty thể ứng dụng nghiên cứu thẩm định xác lồi Xuất phát từ u cầu đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu định danh loài sán gan lớn Fasciola spp sử dụng thị phân tử ITS-2 Nad1” Mục tiêu đề tài - Giải mã trình tự ITS-2 Nad1 để xác định lồi sán gan lớn Fasciola spp gây bệnh động vật Việt Nam - Xây dựng phả hệ mối quan hệ lồi dựa trình tự nucleotide gen ITS-2 Nad1 phân loại Nội dung nghiên cứu - Thu nhận sàng lọc mẫu sán gan lớn Fasciola spp từ tỉnh Việt Nam - Xác định trình tự gen ITS-2 Nad1 mẫu Fasciola spp thu - Phân tích, so sánh trình tự gen ITS-2 Nad1 nghiên cứu với trình tự ngân hàng gen để định danh loài sán gan lớn Fasciola spp - Xây dựng phả hệ dựa trình gen ITS-2 Nad1 nghiên cứu trình tự ngân hàng gen Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Góp phần cung cấp thêm trình tự liệu gen ITS-2 gen Nad1 sán gan lớn Fasciola spp Việt Nam - Ngoài phân tích trình tự gen kĩ thuật sinh học phân tử ký sinh trùng xác hơn, nhằm ứng dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử giám định phân loại loài Fgig-CN-na Fgig-GX-CN Fhep-JP-AP Fhep-M9338 Fhep-Spain Fhep-Spain Fhep-byJPFhep-GL-AU Fjac-MaduFmag-KokoCsin-AmurCsin-GD-CN Csin-KR-na Ofel-TulaOviv-LA-na : : : : : : : : : : : : : : : FspNB-VN-n FspCB-VN-n Fgig-HU-VN Fsp-GHL-CN Fgig-CN-na Fgig-GX-CN Fhep-JP-AP Fhep-M9338 Fhep-Spain Fhep-Spain Fhep-byJPFhep-GL-AU Fjac-MaduFmag-KokoCsin-AmurCsin-GD-CN Csin-KR-na Ofel-TulaOviv-LA-na : : : : : : : : : : : : : : : : : : : FspNB-VN-n FspCB-VN-n Fgig-HU-VN Fsp-GHL-CN Fgig-CN-na Fgig-GX-CN Fhep-JP-AP Fhep-M9338 Fhep-Spain Fhep-Spain Fhep-byJPFhep-GL-AU Fjac-MaduFmag-KokoCsin-AmurCsin-GD-CN Csin-KR-na Ofel-TulaOviv-LA-na : : : : : : : : : : : : : : : : : : : .G AG C .T.A G AG C .T.A T A A .A AT A TA .T A A .A AT A TA .T A A .A AT A TA .T A A .A AT A TA .T A A .A AT A TA C T A A .A AT A TA .T A G.G .C G A G G.T T .G G C.AA .G C.T A G TAT T G C.T C G AA T.T T.GGGA GG .TT C G.C T G C.T C G AA T.T T.GGGA GG .TT C G.C T G CC.T C G AA T.T T.GGGA GG .TT C G.C T .C.C G G A T.C T.GGGAG.GG G TT G C .A .C.T .C.TA.A T.T C T.AGG AG C TC G G.A 760 * 780 * 800 * 820 * 840 GTTTGTTCTG-GGTTTGACTTTGTTTCATGTTATGTTTTTTGTTTGAGCTCGTGCTACTTTGCCGCGTGTGCGATATGATTATT - G T A .- T T G - G T A .- T T G A .- T T G CT.A- G .G .A T T G C A- G .G .A T T G CT.A- G .G .A T T G CT.A- G .G .A T T G CT.A- G .G .A T T G CT.A- G .G G A T T G T A.GT - A A T A G G G .T T T A.GT - .A AG G G C T T C A.AT A G- A GGA A GT.G A AC.T T A T C A.AT A G- A GGA A GT.G A AC.T T A T C A.AT A G- A GGA C A GT.G A AC.T T A T G.AT G G- A C C GC.T A G GC.A T A.C T .T TG A.TT G G- C .GG.T A.C G C.T T A T C * 860 * TTGTTACTTTTATGTGGCGTTATGCTCTT-TTA : 870 .- : 870 .- : 870 .- : 870 .- : 870 .- : 870 G - : 870 G - : 870 G - : 870 G - : 870 G - : 870 G - : 870 GG .TT - : 870 GA A T - G : 870 A GAA C AAAG T.GA T.A : 871 A GAA C AAAG T.GA T.A : 871 A GAA C AAAG T.GA T.A : 871 .GAG AAAG T.GA T.AT : 871 A.CGAG AAAG T A A.G : 871 : : : : : : : : : : : : : : : 755 755 755 755 755 755 755 755 755 755 755 755 755 755 755 : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 838 Hình 3.7 So sánh trình tự chuỗi nucleotide gen Nad1 FspNB-VN; FspCB-VN FspHU-VN với chuỗi thuộc lớp sán dẹp Trematode Dấu (.) biểu thị giống Sự sai khác thể chữ Kết Hình 3.7 cho thấy, so sánh gen Nad1 mẫu nghiên cứu với chuỗi gen công bố Ngân hàng gen mẫu FspNB-VN FspHU-VN tương ứng với số mẫu thuộc loài F gigantica Trung Quốc Kết rằng: nhóm mẫu Fasciola spp có sai khác thành phần chuỗi nucleotide mẫu thuộc dạng lai Việt Nam FspCB-VN so sánh với mẫu thuộc dạng lai Trung Quốc (FspGHL-CN có số đăng ký Ngân hàng gen KF543343) Như vậy, gen ty thể Nad1 Fasciola spp mẫu 42 nghiên cứu tương đồng cao với F gigantica Tuy nhiên, có vị trí nucleotide Fasciola spp dạng lai Việt Nam (FspCB-VN) Trung Quốc (FspGHL-CN) giống hoàn toàn với F hepatica Fh-Aus (Australia) sai khác hoàn toàn với F gigantica dạng Việt Nam (FspNB-VN) dạng Trung Quốc (Fgig-CN), cụ thể vị trí: C72T; A120G; A247G; A/T775G; A830G (Hình 3.7) Như vậy, gen Nad1 Fasciola sp dạng lai FspCB-VN, có trình tự khác với lồi F hepatica, khơng giống hoàn toàn với F gigantica dạng sở để nhận định mẫu sán gan lớn FspCB-VN nghiên cứu mẫu thuộc dạng lai (F hepatica x F gigantica); mẫu FspNB-VN FspHU-VN thuộc dạng F gigantica 3.2.3 Kết phân tích tỷ lệ đồng trình tự nucleotide gen Nad1 Kết so sánh tỷ lệ đồng thành phần nucleotide gen Nad1 FspNB-VN; FspHU-VN FspCB-VN với trình tự gen Nad1 16 chủng đại diện thuộc lồi sán dẹt thống kê trình bày Bảng 3.3 Ba mẫu sán gan lớn FspNB-VN; FspCB-VN FspHU-VN có tỷ lệ đồng thành phần nucleotide so với mẫu Fasciola Trung Quốc từ 97 100% so với F hepatica Australia Nhật Bản 90-91% Nhóm sán gan nhỏ Clonorchis Opisthorchis sử dụng làm nhóm ngoại hợp tỷ lệ tương đồng nhóm 99%; so sánh với nhóm với nhóm sán gan lớn tỷ lệ đồng đạt từ 70 – 73% Như vậy, qua phân tích kết Bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ tương đồng loài họ thuộc lớp sán dẹp (Trematoda) cao (96 – 99%, đặc biệt số mẫu có tỷ lệ 100%); tỷ lệ khác họ thấp nhiều (thậm chí đạt mức 70% họ Fasciolidae (sán gan lớn) với họ Opisthorchiidae (sán gan nhỏ) 43 Bảng 3.3 Tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide gen Nad1 hai loài sán thuộc lớp sán dẹp Trematoda Số TT FspNB-VN FspCB-VN FspHU-VN Fsp-GHL-CN Fgig-CN Fgig-GX-CN Fhep-JP 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 98 98 98 96 96 90 91 91 91 90 90 86 85 72 72 72 73 71 97 100 96 96 91 91 91 91 91 91 85 85 72 72 72 73 71 97 98 98 90 90 91 90 90 90 85 85 72 72 72 72 70 96 96 91 91 91 91 91 91 85 85 72 72 72 73 71 100 91 91 91 91 91 91 85 85 72 72 72 72 70 91 91 91 91 91 91 85 85 72 72 72 72 70 99 99 99 100 99 85 84 72 72 72 73 70 99 99 99 99 85 84 72 72 72 73 70 99 99 99 85 85 72 72 72 73 70 99 99 85 85 72 72 72 73 70 99 85 84 72 72 71 73 70 85 85 72 72 72 73 70 87 70 70 70 71 70 71 71 70 71 69 99 99 84 80 99 84 80 83 80 Fhep Fhep-Spain 10 Fhep-Spain 11 Fhep-byJP 12 Fhep-GL-Au 13 Fjac-Madu 14 Fmag-Koko 15.Csin-Amur16 Csin-GD-CN 17.Csin-KR 18.Ofel-Tula-RU 79 19 Oviv-LA 45 3.2.4 Xây dựng mối quan hệ phả hệ loài thuộc lớp sán gan Cây phả hệ xây dựng dựa trình tự nucleotide 19 chuỗi gen Nad1 lồi thuộc lớp sán Trematoda có xuất xứ từ nhiều quốc gia (Việt Nam, Trung Quốc, Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản, Lào, Australia) trình bày Hình 3.7 Kết cho thấy, nhóm mẫu sán gan lớn Fasciola spp phân định vào họ Fasciolidae; nghiên cứu nhóm sán gan nhỏ lớp Trematoda (lớp sán dẹt) thuộc họ Opisthorchiidae sử dụng làm nhóm ngoại hợp (Hình 3.7): 92 Fgig-GX-CN-KF543342 Fgig-CN-NC 024025 96 50 Fgig-HU-VN FspNB-VN 86 FspCB-VN 64 Fsp-GHL-CN-KF543343 91 Fhep-GL-AU-AF216697 65 98 100 Fasciolidae Fhep-Spain-KF111633 Fhep-Spain-KF111659 42 Fhep-M93388 60 94 Fhep-JP-AP017707 Fhep-byJP-AP017707 Fjac-Madu-LK-KX787886 98 Fmag-Koko-CZ-KU060148 Ofel-Tula-RU-EU921260 Oviv-LA-JF739555 40 Csin-GD-CN-JF729303 Opisthorchiidae 99 Csin-Amur-RU-)FJ381664 61 Csin-KR-JF729304 0.1 Hình 3.8 Cây phả hệ thể mối quan hệ loài mẫu sán dựa thành phần nucleotide gen Nad1 chương trình MEGA6.06 Ký hiệu (♦) mẫu Fasciola sử dụng nghiên cứu Nhóm thuộc họ Fasciolidae gồm mẫu sán gan lớn Fasciola spp Việt Nam nghiên cứu FspCB-VN; FspNB-VN FspHU-VN phân thành hai phân nhóm gồm: i) Mẫu FspCB-VN mối quan hệ phả hệ nằm nhóm với FspGHL-CN (dạng lai) Trung Quốc; 46 ii) Mẫu FspNB-VN FspHU-VN nằm nhóm với mẫu Fasciola spp Trung Quốc (mẫu Fgig-CN); Nhóm ngoại hợp thuộc họ Opisthorchiidae, gồm phân nhóm sán gan nhỏ Clonorchissinensis (Csin-VN) nhóm với mẫu Trung Quốc (Csin-CN); Hàn Quốc (Csin-KR); Nga (Csin-RU) phân nhóm Opisthorchis viveriini (mẫu Oviv-VN, Việt Nam; Oviv-LA, Lào) Mẫu Ofel-RU thuộc loài Opisthorchis felineus tạo thành nhánh riêng với phân nhóm Sán gan lớn thuộc giống Fasciola Việt Nam từ trước đến xác định Fasciola gigantica, nhiên, số cá thể có hình thái giống F hepatica (F hepatica – like) gen ITS-2 hệ gen nhân giống với F hepatica hệ gen ty thể lại giống với F gigantica, dẫn đến phát có lai chéo loài tự nhiên F hepatica F gigantica [21, 24] Như vậy, sử dụng đơn phần gen ty thể chuỗi gen Nad1 (~ kb) dựa trình tự nucleotide xây dựng phả hệ chia làm hai nhóm: nhóm F hepatica nhóm bao gồm tất chủng F gigantica F gigantica-like, có mẫu thuộc kết nghiên cứu FspCBVN Điều chứng tỏ, tất chủng/mẫu sán gan lớn thuộc dạng hay dạng lai có hệ gen ty thể thuộc lồi F gigantica di truyền theo dòng mẹ Dạng trung gian (dạng lai) xuất mẫu sán thu vật chủ trâu, bò người Đây chứng cho dạng gen lai loại sán gan lớn Việt Nam Đơng Nam Á Điều này, góp phần giải thích chế gây bệnh sán gan lớn người Việt Nam Đơng Nam Á có nét đặc trưng không giống vùng khác giới Đây đa dạng sinh học phức tạp loài ký sinh trùng truyền lây từ động vật sang người [3] Như chứng tỏ có tạo dòng lai ngoại lồi (introgressive hybridization) hay lai chéo ngược, dân gian gọi tượng "lại giống" động vật mà số dòng lai dòng F gigantica có khả tìm kiếm thích ứng gây bệnh người 47 Lai chéo loài Fasciola sp phát nhiều nơi giới ghi nhận tượng tự nhiên hai loài F hepatica F gigantica tạo dạng trung gian (hybrid form/intermediate forms) [25, 27, 54, 66] tượng tiến hóa phổ biến lớp Trematoda với dẫn chứng cụ thể loài sán máng Schistosoma [39, 68], sán phổi Paragonimus [31]; loài sán dây Taenia thuộc lớp Cestoda [61] Vấn đề chỗ, dạng lai hai loài, loài cho hệ gen nhân loài cho hệ gen ty thể cần phải nghiên cứu khẳng định Đối với Fasciola sp dạng lai, nay, hệ gen ty thể chúng có thành phần giống với F gigantica [21, 24] khẳng định kết nghiên cứu sử dụng gen Nad1 trình bày nghiên cứu Lai ngoại lồi tượng tiến hóa bất thường gặp lớp sán (Trematoda) nói chung kết chúng tơi minh có dòng lai {F hepatica (bố)- F gigantica (mẹ)} loài sán gan lớn gây bệnh gia súc (trâu, bò) Việt Nam Về vấn đề cần nhà khoa học nước giới quan tâm có nghiên cứu cách sâu sắc có hệ thống Trong nghiên cứu phát mẫu FspCB-VN thu nhận tỉnh Cao Bằng mẫu sán gan thuộc dạng lai (hybrid form) Điều minh chứng thêm lần khẳng định quần thể sán gan lớn Việt Nam chắn có diện tồn “nguồn gốc thủy tổ” F hepatica từ trước Cần có thêm nghiên cứu giải trình tự gen/tồn hệ gen ty thể lai để xem xét, phân tích khoảng cách di truyền mức độ tiến hóa loài loài 48 KẾT LUẬN Nhân giải trình tự nucleotide ITS-2 Nad1 03 mẫu Fasciola spp Thu nhận từ ba tỉnh Việt Nam Xây dựng 02 phát sinh chủng loại sán gan lớn Fasciola spp Dựa trình tự ITS-2 Nad1 So sánh số vị trí nucleotide mẫu sán gan lớn Fasciola spp dựa nucleotide vị trí 327 để xác định loài Fasciola spp Nếu bị khuyết nucleotide vị trí thuộc lồi F gigantica Thymine thuộc F hepatica Định danh mẫu sán gan lớn thu Ninh Bình Thừa Thiên Huế Fasciola gigantica, mẫu thu Cao Bằng dạng lai bố Fasciola hepatica với mẹ Fasciola gigantica 49 KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục giải trình tự tồn hệ gen ty thể FspCB-VN dạng lai, thu thập thêm mẫu sán gan lớn Việt Nam đối tượng vật chủ khác để xác định tính lai chéo tự nhiên quần thể sán gan lớn xây dựng mơ hình tiến hóa theo vùng địa lý theo địa danh phân bố Việt Nam 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Học viện Quân Y (2008), Ký sinh trùng côn trùng Y học, Nhà xuất Y học Hà Nội Nguyễn Quốc Doanh, Lê Thanh Hoà (2006), “Một số đặc điểm hình thái phân tử sán gan (Fasciola spp.) bò tỉnh Nghệ An Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 13(5), tr 59-67 Trần Thanh Dương, Nguyễn Thu Hương, Nguyễn Thị Hương Bình (2013), “Dạng lai mẫu sán gan lớn trâu bò người Quảng Ngãi”, Tạp chí Y học thực hành,(1), tr 48-52 Nguyễn Văn Đề (2003), “Kết bước đầu điều tra bệnh sán gan lớn Khánh Hòa”, Tạp chí y học thực hành, 447, tr 77-79 Nguyễn Văn Đề (2012), “Cập nhật bệnh ký sinh trùng Việt Nam”, Hội nghị khoa học quốc tế Mekong Health III, tr 9-12 Nguyễn Văn Đề, Đỗ Tuấn Anh (2011), “Nhiễm sán gan lớn nhóm bệnh nhân chẩn đoán “u gan” bệnh viện Hà Nội 2006-2010”, Tạp chí Y học Thực hành, (8), tr 169-171 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà (2004), “Xác định thành phần loài SLGL người Việt Nam từ trứng phân lập phân người phương pháp phân tử hệ gen ty thể”, Tạp chí Y học thực hành, 463(7), tr 42-46 Nguyễn Văn Đề, Lê Khánh Thuận (2004), Sán gan (liver flukes), NXB Y học, Hà Nội Lê Thanh Hòa (2007), “Chỉ thị di truyền phân tử sử dụng giám định, chẩn đoán, phân loại, phả hệ, dịch tễ học di truyền quần thể ký sinh trùng”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, (11), tr 9-14 10 Lê Thanh Hoà, Nguyễn Văn Đề (2002), “Xác định Fasciola gigantica Việt Nam phương pháp sinh học phân tử hệ gen ty thể sử dụng gen Nad1 (nicotinamide dehydrogenase subunit 1)”, Tạp chí phòng chống sốt rét bệnh ký sinh trùng, (3), tr 41-48 51 11 Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996), Ký sinh trùng thú y, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 53-62 12 Nguyễn Trọng Kim (1997), Nghiên cứu liên quan đến tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán gan ốc (KCTG) với tỷ lệ nhiễm sán trâu bò (KCTC) để đánh giá tình hình dịch tế bệnh số vùng miền Bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Việt Nam, Hà Nội 13 Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Quang Tuyên (1999), Giáo trình ký sinh trùng thú y, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội, tr 37-46 14 Phan Địch Lân (2004), Bệnh ngã nước trâu bò, NXB Nơng nghiệp Hà Nội, tr - 55 15 Nguyễn Thị Lê (1977), Bệnh giun sán từ động vật lây sang người, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 16 Nguyễn Thị Lê (1995), Danh mục loài sán (trematoda) ký sinh chim thú Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 33-129 17 Nguyễn Thị Bích Liên, Trần Thị Hồng (2007), “Đánh giá mối liên quan mề đay mạn tính nhiễm kí sinh trùng”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 2, tr 48-53 18 Phạm Văn Lực, Phạm Ngọc Doanh (2006), “Bệnh sán gan trâu, bò yếu tố nguy lây nhiễm sang người tỉnh Đắk Lắk”, Tạp chí Y học Thực hành, (9), tr 41-43 19 Đoàn Văn Phúc, Nguyễn Thị Hiền Thảo, Vũ Thị Thận (1980), “Dùng Dertil cho uống tẩy sán gan trâu Việt Nam”, Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y (1968 – 1978), NXB Nông nghiệp, Hà Nội 20 Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Văn Văn (2011), “SLGL lạc chỗ người: Báo cáo loạt ca bệnh tổng hợp y văn giới Việt Nam 2000-2011, Cơng trình NCKH bệnh truyền nhiễm HIV/AIDS giai đoạn 2009 – 2011”, Tạp chí Y học Thực hành, 781, tr 118-123 21 Đỗ Dương Thái, Trịnh Văn Thịnh (1976), Cơng trình nghiên cứu ký sinh trùng Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 201-203 52 22 Phạm Văn Thân, Huỳnh Hồng Quang (2007), “Đặc điểm sinh học vài nét dịch tễ học bệnh SLGL (Fasciola hepatica Fasciola gigantica)”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, (11), tr 2-6 23 Đặng Tất Thế, Lê Quang Hùng, Cao Văn Viên (2003), “Định loại sán gan lớn (giống Fasciola) người gia súc thị DNA”, Tạp chí Sinh học, 25(4), tr 47-52 24 Lương Tố Thu, Norman Aderson, Đoàn Văn Phúc (1997), “Nhận định loại thuốc trị sán gan lớn kết thử nghiệm trâu bò Việt Nam”, Tạp chí Hội thú y Việt Nam, 3, tr 6-12 25 Triệu Nguyễn Trung, Huỳnh Hồng Quang (2008), “Cập nhật loài Fasciola Thế giới kỹ thuật cổ điển đại”, Tạp chí Y dược học Quân sự, (33)2, tr 98-103 Tiếng Anh 26 Adachi S., Kotani K., Shimizu T., Tanaka K., Shimizu T., Okada K (2005), “Asymptomatic fasciolasis Department of General Internal Medicine, Tottori Central Prefectural Hospital”, Japan Intern Med, 44(9), pp 1013-1015 27 Agatsuma T., Arakawa Y., Iwagami M., Honzako Y., Cahuaningsin U., Kang S.Y., Hong S.J (2000), “Molecular evidence of natural hybridization between Fasciola hepatica and F Gigantica”, Parasitol Int, 49, pp 231-238 28 Amer S., Dar Y., Ichikawa M., Fukuda Y., Tada C., Itagaki T., Nakai Y (2011), “Identification of Fasciola species isolated from Egypt based on sequence analysis of genomic (ITS1 and ITS2) and mitochondrial (NDI and COI) gene markers”, Parasitol Int, 60(1), pp - 12 29 Blair D., Agatsuma T., Watanobe T., Okamoto M., Ito A (1997), “Geographical genetic structure within the human lung fluke Paragonimus westermani, detected from DNA Sequences”, Parasitology, 115, pp 411-417 30 Boore J L (1999), “Animal mitochondrial genomes”, Nucleic Acids Res, 27(8), pp 1767-1178 53 31 Dang T T., Nawa Y (2005), “Fasciola and Fascioliasis in Vietnam”, Asian Parasitol, 1, pp 57-60 32 Despommier D D., Gwadz R W., Hotez P J (1995), Fasciola hepatica (Linnaeus 1758), Parasitic Diseases, Springer, New York, NY 33 Echenique-Elizondo M., Amondarain J., Liron de Robles C (2005), “Fascioliasis an exceptional cause of acute pancreatilis”, JOP, 6(1), pp 36- 34 Fritzscha G., Schjegel M., Stadler P F (2006), “Alignments of mitochondrial genome arrangements: applications to metazoan phylogeny”, J Theor Biol, 240(4), pp 511-520 35 Guarro J., Gené J., Stchigel A M (1999), “Review: Developments in fungal taxonomy”, Clin Microbiol Rev, 12(3), pp 454-500 36 Hashimoto K T., Watanobe C., Liu C X., Init I., Blair D., Ohnishi S., Agatsuma T (1997), “Mitochondrial DNA and nuclear DNA indicate that the Japanese Fasciola species is F gigantica”, Parasitol Res, 83, pp 220-225 37 Hu M., Gasser R B (2006), “Mitochondrial genomes of parasitic nematodesprogress and perspectives”, Trends Parasitol, 22(2), pp 78-84 38 Huang Y W., He B., Wang C R., Zhu X Q (2004), “Characterisation of Fasciola species from Mainland China by ITS-2 ribosomal DNA sequence”, Vet Parasitol, 120, pp 75-83 39 Itagaki T., Kikawa M., Sakaguchi K., Shimo J., Terasaki K., Shibahara T., Fukuda K (2005), “Genetic characterization of parthenogenetic Fasciola sp in Japan on the basis of the sequences of ribosomal and mitochondrial DNA”, Parasitolology, 131, pp 679-685 40 Itagaki T., Sakaguchi K., Terasaki K., Sasaki O., Yoshihara S., Van Dung T (2009), “Occurrence of spermic diploid and aspermic triploid forms of Fasciola in Vietnam and their molecular characterization based on nuclear and mitochondrial DNA”, Parasitol Int, 58, pp 81-85 41 Itagaki T., Tsutsumi K I (1998), “Triploid form of Fasciola in Japan: genetic relationships between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica determined by 54 ITS-2 sequence of nuclear rDNA”, International Journal for Parasitology, 28, pp 777-781 42 Jogen H., Brian P (1994), The epidemiology, diagnosis and control of Helminth parasites of Ruminants, Hand bock, pp 32-33 43 Kaufmann J (1996), Parasitic infection of domestic animal, Birkhauser verlag, Basel, Boston, Berlin, pp 90-94 44 Kendall S B., et al (1953), “Life-history of Fasciola gigantica Cobbold 1856”, Nature, 171(4365), pp 1164-1165 45 Kramer F., Schnieder T (1998), “Sequence heterogeneity in a repetitive DNA element of Fasciola”, Int J Parasitol, 28(12), pp 1923-1929 46 Le T H., Blair D., Agatsuma T., Humair P F., Campbell N.J., Iwagami M., Littlewood D T., Peacock B., Johnston D A., Bartley J., Rollinson D., Herniou E A., Zarlenga D S., McManus D P (2000), “Phylogenies inferred from mitochondrial gene orders-a cautionary tale from the parasitic flatworms”, Mol Biol Evol,17(7), pp 1123-1125 47 Le T H., De N V., Agatsuma T., Blair D., Vercruysse J., Dorny P., Nguyen T G T., McManus D P (2007), “Molecular confirmation that Fasciola gigantica can undertake aberrant migrations in human hosts”, Journal of Clinical Microbiology, 45(2), pp 648-650 48 Le T H., Van De N., Agatsuma T., Nguyen T G T., Nguyen Q D., McManus D P., Blair D (2008), “Human fascioliasis and the presence of hybrid/ introgressed forms of Fasciola hepatica andFasciola gigantica in Vietnam”, Int J Parasitol, 38, pp 725-730 49 Lotfy W M., Brant S V., DeJong R J., Le T H., Demiaszkiewicz A (2008), “Evolutionary origins, diversification, and biogeography of liver flukes (Digenea, Fasciolidae)”, Am J Trop Med Hyg,79, pp 248-255 50 Marcilla A., Bargues M D., Mas-Coma S (2002), “Assay for the distinction between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica”, Mol Cell Probes, 16(5), pp 327-333 55 51 Mas-Coma S., Valero M A., Bargues M D (2009), “Fasciola, lymnaeids and human fascioliasis with a global overview on disease transmission, epidemiology, evolutionary genectics, molecular epidemiology and control”, Adv Parasitol, 69, pp 41-146 52 Mercer E., Dixon K (1967), “The fine structure of the cystogenic cells of the cercaria of Fasciola hepatica L.”, Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie, 77(3), pp 331-344 53 Nguyen S T., Nguyen D T., Van Nguyen T., Huynh V V., Le D Q., Fukuda Y., Nakai Y (2012), “Prevalence of Fasciola in cattle and of its intermediate host Lymnaea snails in central Vietnam”, Trop Anim Health Prod, 44(8), pp 1847-1853 54 Nguyen T G T., De N V., Vercruysse J., Dorny P., Le T H (2009), “Genotypic characterization and species identification of Fasciola spp with implications regarding the isolatesinfecting goats in Vietnam”, Exp Parasitol, 123, pp 354-361 55 Nguyen T G., Le T H., Dao T H., Tran T L., Praet N., Speybroeck N., Vercruysse J., Dorny P (2011), “Bovine fasciolosis in the human fasciolosis hyperendemic Binh Dinh province in Central Vietnam”, Acta Trop,117(1), pp 19-22 56 Soulsby E J L (1982), Helminth, arthropod an protozoa of domestic animal, Lea & Febiger, pp 40-71 57 Szymanski M., Barciszewska M Z., Barciszewski J., and Erdmann V A (2000), “5S ribosomal RNA database Y2K”, Nucleic Acids Res, 28, pp 166-167 58 Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S (2013), “MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0”, Mol Biol Evol, 30, pp 2725-2729 59 Van de peer Y., Chapelle S., De Wachter R (1996), “A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA”, Nucleic Acids Res, 24(17), pp 3381-3391 56 60 Walker S M., Prodöhl P A., Hoey E M., Fairweather I., Hanna R E., Brennan G., Trudgett A (2012), “Substantial genetic divergence between morphologically indistinguishable populations of Fasciola suggests the possibility of cryptic speciation”, Int J Parasitol, 42(13-14), pp 1193-1199 61 Wannasan A., Khositharattanakool P., Chaiwong P., Piangjai S., Uparanukraw P., Morakote N (2014), “Identification of Fasciola species based on mitochondrial and nuclear DNA reveals the co-existence of intermediate Fasciola and Fasciola gigantica in Thailand”, Exp Parasitol,146, pp 64-70 62 Xuan Le T, Hung NT, Waikagul J (2005), “Cutaneous fascioliasis: a case report in Vietnam”, Am J Trop Med Hyg, 72(5), pp 508 - 509 63 Zarowiecki M Z., Huyse T., Littlewood D T (2007), “Making the most of mitochondrial genomes-markers for phylogeny, molecular ecology and barcodes in Schistosoma (Platyhelminthes: Digenea)”, Int J Parasitol, 37(12), pp 1401-1418 64 Zimmerman G L,, Jen L W., Cerro J E., Farnsworth K L., Wescott R B (1982), “Diagnosis of Fasciola hepatica infections in sheep by an enzymelinked immunosorbent assay”, Am J Vet Res, 43(12), pp 2097-2100 Tài liệu dịch 65 Skrjabin K I., Petrov A M (1977), “Ngun lý mơn giun tròn thú y”, Bùi Lập Đoàn Thị Băng Tâm dịch từ nguyên tiếng Nga, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 56-57 Tài liệu từ mạng internet 66 http://iranhelminthparasites.com/species/fasciola.htm 67 http://www.cdc.gov/parasites/Fasciola/biology.html 68 http://www.dostbinhdinh.org.vn/kyYeu/KyyeuSTKT1997-2007/Giaidoan20022003/P101 - 102.htm 69 www.biologie.uni-erlangen.de/ parasit/fasciola 70 www.cdc.gov/dpdx/fascioliasis/index.html 71 www.dpd.cdc.gov/DPDX/HTML 72 http://www.who.int/foodborne_trematode_infections/fascioliasis/en/ 57 ... thực đề tài: Nghiên cứu định danh loài sán gan lớn Fasciola spp sử dụng thị phân tử ITS- 2 Nad1 Mục tiêu đề tài - Giải mã trình tự ITS- 2 Nad1 để xác định lồi sán gan lớn Fasciola spp gây bệnh... HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Vân NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN Fasciola spp SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ ITS- 2 VÀ Nad1 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 420 121 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA... nucleotide gen ITS- 2 Nad1 phân loại Nội dung nghiên cứu - Thu nhận sàng lọc mẫu sán gan lớn Fasciola spp từ tỉnh Việt Nam - Xác định trình tự gen ITS- 2 Nad1 mẫu Fasciola spp thu - Phân tích, so sánh trình