Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết phân tích trình tựu AND; chẩn đoan phân biệt F.Hepatica và F.Gigantica bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
25(4): 47-52 12-2003 Tạp chí Sinh học định l0ại sán gan lớn (giống Fasciola) ngời gia súc thị ADN đặng tất Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Lê quang hùng Sở Y tế tỉnh Bình Định Cao văn viên Viện Y học lâm sàng bệnh nhiệt đới Các loài sán gan lớn thuộc giống Fasciola ký sinh trùng nguy hiểm ngời gia súc Nhiều tác giả đ ghi nhận hai loài sán gan lớn Fasciola hepatica vµ F gigantica ký sinh ë ng−êi vµ gia sóc ë ViƯt Nam [3] Hai loµi nµy gièng nhiều đặc điểm hình thái, sinh thái, sinh học, nên việc định loại chúng sở hình thái dễ nhầm lẫn Vì vậy, số liệu ®iỊu tra vỊ s¸n l¸ gan lín ë n−íc ta nhiều mâu thuẫn, ví dụ, Bắc bộ, Houdemer (1938) công bố có 64,7% trâu bị nhiễm F hepatica 23,5% bò bị nhiễm F gigantica, nhng Drozdz (1967) lại công bố 76,9% trâu bị nhiễm F gigantica có trâu Tuyên Quang bị nhiễm F hepatica [2] Đ có số công bố ngời Việt Nam bị nhiễm F hepatica, nhng chứng xác đáng mặt định loại [4] Cho đến nay, cha có công trình nghiên cứu sâu phân loại học F hepatica Vì vậy, vấn đề có hay hai loài sán gan lín ë ViƯt Nam vµ loµi nµo ký sinh ngời cha đợc giải đáp Trong vài năm gần đây, đ có hàng trăm bệnh nhân mắc bệnh sán gan lớn đợc ghi nhận, chủ yếu miỊn Trung n−íc ta vµ cã thĨ cã hµng chơc nghìn ngời Việt Nam bị nhiễm loại sán nhng cha đợc phát Việc xác định F gigantica hay F hepatica ký sinh ë ng−êi lµ rÊt quan trọng, tạo sở cho việc lựa chọn phát triển phơng pháp chẩn đoán thích hợp phòng trị bệnh có hiệu quả, gây bệnh chúng có số đặc điểm riêng Mặc dù hai loài sán cha hoàn toàn thích nghi víi ®êi sèng ký sinh ë ng−êi, nh−ng F hepatica thích nghi tốt hơn, khả phát triển đến trởng thành cao, nên phơng pháp chẩn đoán F hepatica qua soi phân tìm trứng có giá trị Ngợc lại, F gigantica phát triển đến trởng thành thờng di chuyển lạc chỗ Hơn nữa, thời gian sán gan lớn phát triển đến truởng thành dài thời kỳ gây bệnh tích nặng cho vật chủ Vì vậy, có phơng pháp chẩn đoán sở phản ứng miễn dịch thích hợp bệnh F gigantica gây ngời bệnh sán gan lớn cha trởng thành gây ngời động vật nói chung Vấn đề quan trọng hàng đầu phải xác định xác loài sán gây bệnh để phát triển chẩn đoán miễn dịch đặc hiệu tạo sở khoa học cho nghiên cứu để phòng trị bệnh sán gan lớn Phơng pháp phân loại, giám định sinh vật dựa trình tù ADN cđa bé gien ty thĨ (mitochondrial DNA- mtDNA) kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đặc hiệu đợc dùng phổ biến Lợi phơng pháp cho kết có độ tin cậy cao, cần vật mẫu không phụ thuộc vào giai đoạn phát triển cá thể sinh vật, nên phù hợp cho giám định loài sán gan lớn ký sinh ngời [9-11] Mặc dù việc thu mẫu sán gan lớn ngời khó khăn, nhng mặt dịch tễ học, bệnh sán gan lớn bệnh lây truyền ngời động vật, chủ yếu trâu, bò, việc xác định loài sán gan lớn gia súc chứng gián tiếp loài sán ký sinh ngời Vì vậy, nghiên cứu này, đ kết hợp hai phơng pháp trên, nhằm đảm bảo độ tin 47 cậy cao tính hiệu khảo sát số lợng mẫu lớn Trình tự axít amin đợc dịch theo bảng m di truyền mt-ADN giun dẹt I phơng pháp nghiên cứu Chẩn đoán phân biệt F hepatica F gigantica kỹ thuật PCR đặc hiệu Phân tích trình tự ADN Mẫu vật sử dụng phơng pháp bao gồm: F.hC F hepatica thu đợc từ ôxtrâylia (hình1, F.hC), F.sp1 F.sp2 thu đợc từ bệnh nhân, F.sp1 cá thể sán non, F.sp2 gồm 200 trứng có cấu tạo trứng sán giống Fasciola, thu đợc tỉnh Bình Định Các mẫu F.sp3, F.sp4, F.sp5 F.sp6 cá thể sán gan lớn thu từ bò tỉnh Bình Định, F.sp3 F.sp4 có hình thái điển hình F gigantica (hình 1, nhóm F.g), F.sp5 F.sp6 có hình thái trung gian F hepatica F gigantica (hình 1, nhóm F.hg) Các tiêu đợc định hình cồn 90%, trừ tiêu trứng sán (F.sp2) đợc định hình sau nuôi đến giai đoạn miracidium Cặp mồi đợc thiết kế để nhân đoạn ADN dµi 518 bp cđa gien cytochrom c oxydaza subunit (CO1) hƯ gien ty thĨ cđa c¶ F hepatica F gigantica Ký hiệu trình tự cặp mồi FFTGGTTTTTTGGGCATCCTGAG FRATAACCAGTCACAAC AGGCCAC ADN tổng số đợc t¸ch chiÕt b»ng bé hãa chÊt QIAamp blood and tissue Kit (QIAGEN Inc.) theo quy trình nhà sản xuất ADN đích đ đợc nhân PCR tiêu chuẩn víi bé hãa chÊt GeneAmp PCR Reagent Kit (PerkinElmer) Chu trình nhiệt PCR máy PTC 100 (MJ Research Inc., Mü) gåm b−íc biÕn tÝnh ë 940C - phót, tiÕp theo lµ 35 chu kú: 940C - phót, 500C - 1,5 vµ 720C - phót, chu kỳ cuối kéo dài phút 720C Sản phẩm PCR đợc tinh chế hóa chất QIAquick PCR purification kit (QIAGEN Inc.) đợc giải trình tự trực tiếp sợi đôi ADN với mồi PCR, nhằm thu đợc kết xác Giải trình tự đợc tiến hành với hóa chất FS-DNA sequencing kit theo qui trình nhà sản xuất máy tự động ABI 377 PRISM (Perkin Elmer) Đối chiếu trình tự thu đợc với trình tự tơng đồng từ số quần thể sán Fasciola đ đợc tác giả khác giới công bố ngân hàng gien (GenBank), nhằm xác nhận trình tự đích phân tích di truyền 48 Mẫu sán gan lớn đợc thu từ trâu, bò hai vùng Bình Định Khánh Hòa Để sán chết tự nhiên trớc định hình cồn 70%, nhằm tránh biến dạng hình thái mẫu vật ADN tổng số đợc tách chiết b»ng BioRad Chelex 100TM, theo quy tr×nh cđa Hillis et al.,1996 Cặp mồi để nhân đoạn ADN đặc hiệu cho loài F gigantica đợc thiết kế từ đoạn trình tự dị biệt F hepatica F gigantica qua so sánh trình tự thu đợc từ mẫu Ký hiệu trình tự cặp mồi FgTTAGTCATATTTGTGTGCTT RgCAAAACCAACAATCCATCAT, nhân đoạn ADN dài 279 bp Nhằm nhân đoạn ADN đích đặc hiệu cho loài F gigantica cặp mồi Fg, Rg, ® dïng kü thuËt PCR lång (nested PCR) víi cặp mồi FF, FR Fg, Rg Sản phẩm PCR cặp mồi FF FR đợc sử dụng để giải trình tự, đồng thời làm ADN khuôn mẫu cho PCR với cặp mồi Fg Rg Chu trình nhiệt PCR với cặp mồi Fg Rg gåm b−íc biÕn tÝnh ë 940C - phót, tiÕp theo 33 chu kỳ: 940C - 30 giây, 500C - 45 giây 720C - phút, chu kỳ cuối kéo dài phút 720C Sản phẩm PCR đợc tách điện di với gel agaroza 1,5%, nhuộm ethidium bromit chụp ảnh gel dới tia UV II Kết thảo luận Độ tơng đồng 350 trình tự ADN nghiên cứu so với trình tự tơng đồng F.gigantica Inđônêxia (F.g(Ind)), Hàn Quốc (F.g(Kor)), Nhật Bản (F.g(Jap)) F.hepatica Mỹ (F.h(USA)), ôxtrâylia (F.h(Aus)) đợc trình bày bảng cho thấy: độ tơng đồng tất trình tự F.spVN Việt Nam nằm khoảng từ 99,199,7 khác biệt sán ký sinh ngời so với sán F gigantica sán có hình thái trung gian (F.hg) gia súc Độ tơng đồng trình tự F.sp Việt Nam so với trình tự F.gigantica Inđônêxia, Hàn Quốc Nhật Bản 98,6-100, riêng với F.g(Kor), F.g(Jap) 99,4-100 Độ tơng đồng trình tự F hepatica Mỹ so ôxtrâylia cao (99,4), nhng thấp so với tất trình tự F.sp Việt Nam F.g nớc (92,393,7) So sánh trình tù axit amin cđa F.sp ë ViƯt Nam vµ F gigantica nớc lại cho thấy có axÝt amin thay thÕ, nh−ng ®Ịu thc F.g cđa Inđônêxia Có axít amin thay đổigiữa F.h(USA), F.h(Aus) so với F.sp Việt Nam F gigantica nớc khác Các tiêu cho thấy có phân hóa cao mặt di truyền F hepatica vµ F gigantica vµ chøng tá chóng lµ hai loài phân biệt Bảng Độ tơng đồng trình tự số quần thể sán F hepatica F gigantica Tr×nh tù Fsp.1 F.sp2 F.sp3 F.sp4 F.sp5 F.sp6 F.g F.g F.g F.h F.h (Vn) (Vn) (Vn) (Vn) (Vn) (Vn) (Ind) (Kor) (Jap) (USA) (Aus) F.sp1 (Vn) 100,0 F.sp2 (Vn) 99,4 100,0 F.sp3 (Vn) 99,4 99,4 100,0 F.sp4 (Vn) 99,7 99,7 99,1 100,0 F.sp5 (Vn) 99,1 99,4 99,4 99,1 100,0 F.sp6 (Vn) 99,1 99,7 99,1 99,7 99,1 F.g (Ind) 98,6 98,9 98,6 98,9 98,6 98,6 100,0 F.g (Kor) 99,4 100,0 99,7 99,7 99,4 99,7 98,9 100,0 F.g (Jap) 99,4 100,0 99,7 99,7 99,4 99,7 98,9 100,0 100,0 F.h (USA) 93,5 92,8 92,8 93,1 92,8 92,6 92,3 93,1 93,1 100 F.h (Aus) 93,7 93,1 93,1 93,5 93,1 93,1 92,8 93,5 93,5 99,4 100,0 F.hC F.hg 100,0 F.h F.g Hình Các dạng hình thái quần thể sán gan lớn trâu, bò hai vùng Bình Định Khánh Hòa F.hC- F hepatica chuẩn, mẫu thu đợc ôxtrâylia, Nhãm F.h- gièng F hepatica; nhãm F.hg- trung gian gi÷a F hepatica vµ F gigantica; nhãm F.g- F gigantica 49 Kết nghiên cứu xác nhận lần loài F.gigantica ký sinh ngời Việt Nam, đồng thời cảnh báo nguy bị nhiễm loài sán này, chúng phổ biến gia súc ăn cỏ nớc ta Kết cho thÊy qn thĨ F.gigantica ë n−íc ta cã biÕn dị hình thái lớn, dễ gây nhầm lẫn định loại Mức độ phân hóa di truyền thấp quần thể F.gigantica Việt Nam số nớc Nam á, trừ quần thể F.gigantica Inđônêxia, có lẽ cách biệt địa lý lớn quốc đảo Phân tích 1350 mẫu sán gan lớn thu đợc từ trâu 12 bò hai vùng Bình Định Khánh Hòa, có 269 mẫu sán trâu 1081 mẫu sán bò Số mẫu vật đ đợc phân loại thành nhóm sở hình thái chúng: nhóm F.h có hình d¹ng gièng F hepatica, nhãm F.hg cã d¹ng trung gian F hepatica F gigantica nhóm F.g có dạng giống F gigantica (hình1) Số lợng sán, tỷ lệ nhóm theo vật chủ đợc trình bày bảng cho thấy dạng Fh Fhg có tỷ lệ cao nhiều trâu so với bò Ngoài ra, khảo sát ấu trùng sán gan lớn giống ốc Lymnaea tỉnh Bình Định, đ thu đợc loại redia chứa 10 cercaria, th«ng th−êng redia cđa F gigantica chøa 56 cercaria (h×nh 2) a b H×nh a- redia chøa 10 cercaria; b- redia cña F gigantica Bảng Số lợng sán tỷ lệ nhóm theo vật chủ Vật chủ Nhóm Trâu Bò Số lợng sán (con) Tỷ lệ (%) Số lợng sán (con) Tû lÖ (%) F.h 57 21,2 23 2,1 F.hg 77 28,6 52 4,8 F.g 135 50,2 1006 93,1 C¸c thực nghiệm dới đ đợc tiến hành để thử khả nhân đoạn ADN đích tính đặc hiệu cặp mồi Fg Rg - Kỹ thuật PCR lồng: sử dụng sản phẩm PCR cặp mồi FF FR đ đợc xác định trình tự làm ADN khuôn mẫu cho PCR với cặp mồi Fg, Rg Kết PCR băng ADN có cỡ đoạn nh dự kiến (279 bp) mẫu F gigantica băng với mẫu 50 F hepatica Kết thực nghiệm đảm bảo cặp mồi Fg, Rg đ nhân đoạn ADN đích đặc hiệu với F gigantica - PCR với cặp mồi Fg, Rg khuôn mẫu ADN tổng số cho kết băng ADN với cỡ đoạn nh dự kiến mẫu F gigantica băng với mẫu F hepatica Kết cho thấy cặp mồi Fg, Rg đặc hiệu cho F gigantica, nên không cần thiết phải tiến hành kỹ thuật PCR lồng chẩn đoán phân biệt F hepatica F gigantica - Kết PCR sai khác dùng ADN tổng số đợc tách chiết QIAamp blood and tissue Kit (QIAGEN Inc.) vµ BioRad Chelex 100TM lµm khuôn mẫu Ưu điểm phơng pháp tách chiết ADN BioRad Chelex 100TM rẻ tiền, cần bớc thao tác nên tránh đợc nguy ngoại nhiễm mẫu Từ kết thực nghiệm cho thấy dùng PCR với cặp mồi Fg, Rg ADN mẫu tách chiết BioRad Chelex 100TM thích hợp cho việc xác định thành phần loài quần thể sán gan lớn trâu, bò đ đợc sử dụng để khảo sát lô mẫu vật đ thu Kết cho thấy 45 cá thể sán nhóm F.h, F.hg F.g (mỗi nhóm có 15 cá thể) loài F gigantica Ngoài ra, redia chứa 10 cercaria còng chØ lµ mét biÕn thĨ cđa redia th−êng gỈp cđa F L gigantica Hình trình bày phần kết điện di sản phẩm PCR đặc hiệu để chẩn đoán phân biệt mẫu khảo sát Kết cho thấy quần thể sán gan lớn thu đợc trâu, bò hai vùng Bình Định Khánh Hòa thuộc loài F gigantica mức độ biến dị hình thái loài lớn Khả tồn quần thể F hepatica vùng nghiên cứu nhỏ, nghĩa khả cã F hepatica ký sinh ë ng−êi còng rÊt nhá Kết nghiên cứu với mâu thuẫn kết điều tra Fasciola trớc đây, đặt câu hỏi có tồn quần thể F hepatica nớc ta hay không? Vấn đề còng t−¬ng tù ë mét sè n−íc khu vùc nh Nhật Bản, gần sở định loại thị ADN đ khẳng định quần thể sán Fasciola đất nớc họ F gigantica, trớc loài F hepatica đ đợc ghi nhận sở định loại hình thái [9] L 10 11 12 13 14 15 16 17 18 300 bp Hình Một phần kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi Fg Rg Ghi chú: L thang cỡ đoạn (ladder) tính bp, F.hC- F hepatica chuẩn ôxtrâylia; 2-6: nhóm F.h; 7-11 nhãm F.hg; 12-16: nhãm F.g; 17: biÕn thÓ redia; 18: redia th−êng cña F gigantica III KÕt luËn So sánh trình tự ADN ty thể cho thấy hai c¸ thĨ s¸n l¸ gan lín ë ng−êi thc loài Fasciola gigantica lần loài sán đợc xác nhận ký sinh ngời Việt Nam Quần thể sán gan lớn thu đợc trâu, bò hai vùng Bình Định Khánh Hòa thuộc loài F gigantica khả tồn quần thể F hepatica ë vïng nµy lµ rÊt nhá Møc độ biến dị hình thái quần thể F gigantica Việt Nam lớn; đ thu thập đợc nhóm có biến dị hình thái nhóm gièng víi F hepatica, nhãm trung gian gi÷a F hepatica F gigantica nhóm giống F gigantica, nhóm đầu có tỷ lệ cao nhiều trâu so với bò Không có khác biệt di truyền nhóm sán Redia cđa F gigantica cã biÕn thĨ chøa nhiỊu cercaria h¬n loại thông thờng 51 Quần thể F.gigantica Việt Nam số nớc vùng Nam á, trừ Inđônêxia, có mức độ tơng đồng cao cấu trúc di truyền Tài liệu tham khảo Đặng Tất Thế cs., 2001: Thông tin Y học lâm sàng, 4: 77-83 Đỗ Dơng Thái, Trịnh Văn Thịnh, 19761978: Công trình nghiên cứu ký sinh trùng Việt Nam, tập NXB KH&KT, Hà Nội Nguyễn Thị Lê, 2000: Động vật chí Việt Nam NXB KH&KT, Hà Nội, 8: 52-64 Trần Vinh Hiển, Trần Thị kim Dung, 1998: Nhân 125 trờng hợp nhiễm sán gan Fasciola hepatica phát ngời năm 1997 Thông tin phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trïng, 2: 42- 47 Agatsuma T et al.,2000: J Parasitol Int., 49: 231-238 Avise J C., 1994: Molecular markers, natural history and evolution Chapman & Hall, NY, USA Bogitsh J B., Cheng C T., 1996: Human parasitology.Saunder College Publishing,USA 174- 177 Brown W H.,1969: Basic clinical parasitology.Appleton-Century-Cropt,New York,USA 227-229 Hashimoto K T et al., 1997: Parasitol Res., 83: 220-225 10 Hillis D M., Mritz C., Mable B K., 1996 Molecular systematics Sinauer associate USA 11 Itagaki T I et al., 1998: J Parasitol., 84: 445- 448 12 Kaufmann J., 1996: Parasitic infections of domestic animals Birkhauser Verlag, Berlin DNA Identification of Fasciola spp on human and cattle in Central Vietnam Dang Tat The, Le Quang Hung, Cao Van Vien Summary The comparison and analysis of the DNA sequence of two Fasciola samples collected from humans and four other Fasciola samples with different morphology collected from cows in Binhdinh province, to the homologous sequences of the nucleotide of other Fasciola from some countries in South Asia and around the world, shows that all Fasciola samples from both humans and cows are F.gigantica For the first time, this Fasciola species is detected as endoparasites in humans in Vietnam The F.gigantica population in Vietnam and some countries in South Asia except Indonesia have the relatively high structural homogentisic The macroscopic observation of 1350 Fasciola specimens collected from humans and cattle in Binhdinh and Khanhhoa provinces identified three different morphological types of the body of F.hepatica, F.gigantica and the resemblance between F.gigantica and F.hepatica Specified Polymerase Chain Reaction (PCR) shows that they are all F.gigantica This means that F.gigantica has a high potential for morphological disguise, and that all sanples Fasciola detected in cattle from Binhdinh and Khanhhoa provinces are F gigantica It is possible that F hepatica does not exist in this region Also, based on the results of this study and the conflicting results before, existence of F hepatica in Vietnam is still open to question Furthermore, a variant of redia of F gigantica with more cercaria than other common types was found from Lymnaea snails Ngµy nhËn bµi: 11-10-2002 52 ... tự số nớc khu vực nh Nhật Bản, gần sở định loại thị ADN đ khẳng định quần thể sán Fasciola đất nớc họ F gigantica, trớc loài F hepatica đ đợc ghi nhận sở định loại hình thái [9] L 10 11 12 13 14... gigantica III Kết luận So sánh trình tự ADN cđa ty thĨ cho thÊy hai c¸ thĨ s¸n l¸ gan lớn ngời thuộc loài Fasciola gigantica lần loài sán đợc xác nhận ký sinh ngời Việt Nam Quần thể sán gan lớn. .. lẫn định loại Mức độ phân hóa di truyền thấp quần thể F.gigantica Việt Nam số nớc Nam á, trừ quần thể F.gigantica Inđônêxia, có lẽ cách biệt địa lý lớn quốc đảo Phân tích 1350 mẫu sán gan lớn