Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate (sulfate reducing bacteria SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt

Phân lập vi khuẩn có khả năng khử sulfate (Sulfate reducing bacteria SRB) nhằm ứng dụng trong xử lý nước bị nhiễm phèn sắt. Đặc điểm của nước bị nhiễm phèn sắt: + Có hàm lượng ion Fe2+ cao+ pH thấp+ Nước có mùi trứng thối+ Có nhiều cặn bẩn màu vàng. Nguyên nhân: Do các khoáng sulfide (như pyrite, FeS2 ) trong quặng tiếp xúc với oxy và nước.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này, kiến thức học suốt năm qua tìm hiểu thân, em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Bùi Xuân Đơng tận tình hướng dẫn em suốt thời gian làm đồ án Đồng thời, em xin cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ Sinh học - Khoa Hóa- trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng có góp ý hữu ích để em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cán phịng thí nghiệm mơn KS Võ Công Tuấn KS Phạm Thị Kim Thảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành tốt thí nghiệm phịng thí nghiệm môn Công nghệ Sinh học Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán phản biện thầy cô Hội đồng bảo vệ dành thời gian để xem xét đánh giá góp ý cho đồ án tốt nghiệp em Trong thời gian làm đồ án tránh khỏi thiếu sót, em kính mong q thầy thông cảm bỏ qua cho em Một lần em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình, q báu thầy bạn bè Ngày tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực Trịnh Thị Mỹ Hạnh SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC ĐỒ THỊ vii TÓM TẮT LUẬN VĂN .viii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 Nước ngầm bị nhiễm phèn sắt vấn đề liên quan 1.1.1 Tình trạng nhiễm nguồn nước ngầm Việt Nam 1.1.2 Tình trạng nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt khu vực Đà NẵngQuảng Nam 1.1.3 Nguyên nhân nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt 1.1.4 Ảnh hưởng nước ngầm bị nhiễm phèn sắt 1.1.5 Phương pháp xử lý nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt 1.2 Tìm hiểu chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB) .9 1.2.1 Tình hình nghiên cứu chủng vi khuẩn khử sulfate ngồi nước 1.2.2 Đặc tính sinh học .10 1.2.3 Đặc tính sinh lý 10 1.2.4 Giới thiệu vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus 11 1.3 Tính cấp thiết đề tài 14 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 Vật liệu, thiết bị hóa chất sử dụng 15 2.1.1 Vật liệu 15 2.1.2 Thiết bị hóa chất sử dụng 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Thí nghiệm khảo sát sơ diện vi khuẩn SRB phân bò 17 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn SRB 18 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.3 Phương pháp nhuộm Gram, quan sát hình thái khuẩn lạc kính hiển vi quang học (Hans Christian Gram, 1884) 24 2.2.4 Thử nghiệm tính di động vi khuẩn 26 2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng SRB phân lập 27 2.2.6 Thiết kế mơ hình khảo sát khả xử lý nước bị nhiễm phèn sắt vi khuẩn khử sulfate (SRB) quy mơ phịng thí nghiệm 28 2.2.7 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết khảo sát sơ diện vi khuẩn khử sulfate (SRB) phân bò 36 3.2 Kết trình phân lập định danh vi khuẩn khử sulfate (SRB) 36 3.2.1 Kết quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc mọc đĩa thạch 36 3.2.2 Kết nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào kính hiển vi 37 3.2.3 Kết thử nghiệm tính di động vi khuẩn khử sulfate (SRB) 38 3.3 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh hóacủa chủng vi khuẩn SRB vừa phân lập 39 3.4 Kết khảo sát khả xử lý nước bị nhiễm phèn sắt .44 3.4.1 Kết thay đổi pH theo thời gian .45 3.4.2 Kết thay đổi nồng độ ion sắt theo thời gian 45 3.4.3 Kết thay đổi hàm lượng sulfate theo thời gian, thông qua việc đo hàm lượn H2S sinh .47 3.5 Giữ giống vi khuẩn SRB môi trường thạch có lớp dầu khống .47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết Luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC .55 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Báo động nhiễm nguồn nước ngầm Hình 1.2: Nguồn nước bị nhiễm phèn sắt Hòa Vang - Đà Nẵng Hình 1.3: Người dân thơn Tây Gia - Đại Lộc dùng nước nhiễm phèn sắt Hình 1.4: Một số bệnh ngồi da sử dụng nước bị nhiễm phèn sắt Hình 1.5: Ảnh hưởng nước bị nhiễm phèn sắt tới trồng trọt chăn ni Hình 1.6: Qúa trình khử sulfate thành sulfide SRB 10 Hình 1.7: Hình thái vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus 11 Hình 1.8: Qúa trình khử sulfate thành sulfide 13 Hình 1.9: Sự kết tủa ion sắt qua hoạt động sinh hóa vi khuẩn 14 Hình 2.1: Mẫu phân bị 15 Hình 2.2: Mẫu nước thải 15 Hình 2.3: Mẫu nước bị nhiễm phèn sắt 15 Hình 2.4: Qúa trình làm giàu vi khuẩn SRB 18 Hình 2.5: Một số dạng mơi trường ống nghiệm hộp petri 21 Hình 2.6: Kỹ thuật trải đĩa .23 Hình 2.7: Một số dạng khuẩn lạc mọc môi trường rắn 22 Hình 2.8: Các kiểu cấy ria đĩa thạch dinh dưỡng 24 Hình 2.9: Thành tế bào vi 24 Hình 2.10: Các bước nhuộm Gram ví dụ minh hoạ kết 26 Hình 2.11: Mơ hình xử lý nước nhiễm phèn sắt quy mơ phịng thí nghiệm 28 Hình 2.12: Máy đo pH 29 Hình 2.13: Một số dụng cụ kỹ thuật cấy giữ giống thạch nghiêng .34 Hình 3.1: Bình serum xuất khí có mùi trứng thối 36 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc đĩa thạch 37 Hình 3.3: Kết nhuộm Gram bào tử vi khuẩn sulfate (SRB) 37 Hình 3.4: Kết nhuộm Gram mẫu đối chứng vi khuẩn Bacillus subtilis 37 Hình 3.5: Tính di động vi khuẩn SRB môi trường 38 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.6: Tính di động vi khuẩn Lactobacillus casei môi trường 38 Hình 3.7: Mơ hình xử lý nước nhiễm phèn sắt quy mơ phịng thí nghiệm 44 Hình 3.8: Giữ giống vi khuẩn SRB mơi trường thạch có lớp dầu 48 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Các loại biết bị sử dụng .15 Bảng 2.2 Thành phần môi trường N92M1 .16 Bảng 2.3 Thành phần môi trường N92M2 .17 Bảng 3.1 Hàm lượng khí H 2S (mg/l) tạo thành chủng vi khuẩn SRB môi trường sử dụng nguồn chất khác 39 Bảng 3.2 Hàm lượng khí H 2S (mg/l) tạo thành chủng vi khuẩn SRB môi trường khơng bổ sung nấm men mơi trường có bổ sung 10% nấm men .…40 Bảng 3.3 Hàm lượng khí H 2S (mg/l) tạo thành chủng vi khuẩn SRB môi trường nuôi điều kiện nhiệt độ khác .41 Bảng 3.4 Hàm lượng khí H 2S (mg/l) tạo thành chủng vi khuẩn SRB mơi trường có điều kiện pH khác 42 Bảng 3.5 Tổng hợp kết nghiên cứu đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn SRB phân lập 43 Bảng 3.6 Tóm tắt thí nghiệm xử lý nước bị nhiễm phèn sắt mơ hình phịng thí nghiệm 44 Bảng 3.7 Sự thay đổi pH theo thời gian 45 Bảng 3.8 Kết đo OD510nm để xây dựng đường chuẩn 45 Bảng 3.9 Sự thay đổi nồng độ ion sắt theo thời gian 46 Bảng 3.10 Sự thay đổi hàm lượng H2S theo thời gian 47 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Hàm lượng khí H2S tạo thành chủng vi khuẩn SRB môi trường sử dụng nguồn chất khác 40 Đồ thị 3.2: Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành chủng vi khuẩn SRB môi trường không bổ sung nấm men mơi trường có bổ sung 10% nấm men 41 Đồ thị 3.3: Hàm lượng khí H 2S tạo thành chủng vi khuẩn SRB môi trường nuôi điều kiện nhiệt độ khác 42 Đồ thị 3.4: Hàm lượng khí H 2S tạo thành chủng vi khuẩn SRB mơi trường có điều kiện pH khác .43 Đồ thị 3.5: Sự thay đổi pH theo thời gian 45 Đồ thị 3.6: Đường tương quan tuyến tính OD510nm nồng độ [Fe2+] .45 Đồ thị 3.7: Sự thay đổi nồng độ Fe2+ theo thời gian .46 Đồ thị 3.8: Sự thay đổi hàm lượng H2S theo thời gian 47 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TĨM TẮT LUẬN VĂN Tóm tắt – Đề tài nghiên cứu trình bày số kết phân lập chủng vi khuẩn có khả khử sulfate (Sulfate reducing bacteria - SRB) nhằm ứng dụng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt Dựa số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, cấu tạo tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập khóa phân loại Bergey (năm 1994) nhận thấy độ tương đồng với vi khuẩn Desulfovibrio oxamicus đạt 60% Khảo sát đánh giá sơ khả xử lý nước bị nhiễm phèn sắt chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB) quy mơ phịng thí nghiệm thu kết khả quan: hàm lượng H 2S tăng từ 45.7 mg/l lên 92.5 mg/l; Nồng độ ion sắt [Fe2+] giảm từ 57mg/l cịn 28.6 mg/l; pH mơi trường từ 3.8 tăng lên 7.4 sau ngày khảo sát Từ khóa: Desulfovibrio Oxamicus; nước bị nhiễm phèn sắt; phân lập vi khuẩn; vi khuẩn khử sulfate; xử lý nước thải Abstract – Research project results present some isolated bacteria capable of reducing sulfate (Sulfate reducing bacteria-SRB) for applications in water treatment equipment iron alum Based on some morphological characteristics of colonies, cellular, physiological characteristics, biochemistry of bacteria isolated and locked classification of Bergey (1994) found that the degree of similarity with bacteria Desulfovibrio oxamicus reached 60% Surveys and preliminary assessment of the ability of water treatment equipment iron alum of sulfate reducing bacteria (SRB) in laboratory scale and obtained positive results: H2S content increased from 45.7mg/l to 92.5 mg/l; Iron ion concentration [Fe2+] decreased from 57mg/l was 28.6 mg/l; environmental pH from 3.8 to 7.4 after day increase survey Key words: Desufovibrio Oxamicus; water treatment by infected feather alum; isolated bacteria; sulfate reducing bacteria; wastewater treatment SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU Nước nguồn tài nguyên vô quý giá người Cũng giống khơng khí nước thành phần thiết yếu để trì sống Con người, cối, thú vật cần nước để tồn Trên trái đất, ¾ lãnh thổ nước, nước đại dương, biển, sơng ngịi, ao hồ, nước ngầm lòng đất Tuy nhiên nguồn nước dồi nghĩ Tốc độ cơng nghiệp hố thị hố nhanh với gia tăng dân số, với sở hạ tầng yếu kém, lạc hậu, nhận thức người vấn đề mơi trường cịn chưa cao…đã làm cho nguồn nước mặt ngày bị nhiễm cách trầm trọng Trong khí hậu biến đổi thất thường, nắng nhiều, bốc nước tăng lên theo nguyên nhân việc thiếu nước trầm trọng Ở khu vực miền núi, vùng sâu vùng xa, lượng nước mặt khan hiếm, người dân chủ yếu sử dụng nguồn nước ngầm để sinh hoạt sản xuất Một thực trạng diễn số huyện khu vực Đà Nẵng - Quảng Nam nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt nặng Gây tác động xấu đến sinh hoạt, sản xuất người vấn đề mơi trường liên quan Có nhiều phương pháp để xử lý nước bị nhiễm phèn sắt như: phương pháp hóa học, sục khí, hay dùng thiết bị lọc, nhiên phương pháp tốn khơng an tồn, thường gây vấn đề nhiễm thứ cấp Trước thực trạng đó, em xin đưa phương pháp sinh học dùng vi khuẩn khử sulfate (SRB) để xử lý nước bị nhiễm phèn sắt Vi khuẩn khử sulfate (SRB) vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối để oxy hóa hydro hay hợp chất hữu tận thu lượng cho mục đích sinh trưởng Lượng sulfide sinh q trình khử sulfate có tác dụng kết tủa ion kim loại sắt Góp phần giảm hàm lượng sulfate ion sắt hịa tan nước Với tính cấp thiết trên, em tiến hành đề tài: “Phân lập vi khuẩn có khả khử sulfate (Sulfate reducing bacteria- SRB) nhằm ứng dụng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt” phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đồ thị 3.3: Hàm lượng khí H2S tạo thành chủng vi khuẩn SRB môi trường nuôi điều kiện nhiệt độ khác Kết phù hợp với điều kiện tối ưu cho sinh trưởng vi khuẩn khử sulfate nghiên cứu [Davidova et al., 2006; Cravo-Lauveau et al., 2007; Ommedal, Torsvik, 2007; Madigan et al., 2009] Bảng 3.4 Hàm lượng khí H2S (mg/l) tạo thành chủng vi khuẩn SRB mơi trường có điều kiện pH khác pH 6.5 7.5 8.5 Ngày thứ 35.1 41 41 50.2 35.4 Ngày thứ 44.1 65.4 75.7 84.1 45.3 Ngày thứ 65.2 74.2 85.5 94.8 62.4 Ngày thứ 70.1 81.5 91.1 97 62.6 Ngày thứ 10 82 94.2 98.7 112 78.4 Mơi trường trung tính mơi trường thích hợp với đa số vi khuẩn Đối với vi khuẩn khử sulphate, khoảng pH thích hợp nhằm khoảng 6÷9 Tuy nhiên chủng vi khuẩn SRB pH tối ưu cho tăng trưởng nằm khoảng 7÷7.5 Tuy chủng sống pH giảm xuống đến hay tăng lên 8.5 Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu giới [ Dang et al., 1996; Lien, Beeder, 1997; Feio et al., 2004] SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đồ thị 3.4: Hàm lượng khí H2S tạo thành chủng vi khuẩn SRB mơi trường có điều kiện pH khác Từ nghiên cứu trên, tóm tắt kết thu đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn SRB phân lập bảng 3.5 Bảng 3.5 Tổng hợp kết nghiên cứu đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn SRB phân lập ST T Đặc điểm Hình thái khuẩn lạc mọc đĩa thạch: - Hình dạng khuẩn lạc - Bề mặt khuẩn lạc - Màu sắc khuẩn lạc - Độ khuẩn lạc Nhuộm Gram Quan sát hình thái tế bào kính hiển vi quang học Tính di động vi khuẩn Đặc tính sinh lý: - pH mơi trường - Nhiệt độ mơi trường Đặc tính sinh hóa - Nguồn Cacbon - Nguồn Nito SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Kết - Trịn, nhỏ - Xù xì, mép khuẩn lạc khơng đều, hình cưa - Khuẩn lạc có màu đen - Mềm, có khả bám dính vào mơi trường Vi khuẩn Gram (-) - Hình phẩy khun - Kớch thc 1x2ữ3àm Vi khun cú kh nng di động nhờ roi -pH=6.5÷8, tối ưu khoảng pH=7÷7.5 - t0=20÷370C, tối ưu 300C -Sinh trưởng tốt nguồn chất lacte -Nguồn nitơ bổ sung: chiết xuất cao nấm men Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dựa vào khóa phân loại Bergey (Bergey‘s Manual of SystematicBacteriology) [23] Có thể kết luận chủng vi khuẩn phân lập từ phân bò chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB), có độ tương đồng khoảng 60% với vi khuẩn Desulfovibrio Oxamicus 3.4 Kết khảo sát khả xử lý nước bị nhiễm phèn sắt quy mơ phịng thí nghiệm Bảng 3.6 Tóm tắt thí nghiệm xử lý nước bị nhiễm phèn sắt mơ hình phịng thí nghiệm Nước bị nhiễm phèn sắt: - pH = 3.8 -Nồng độ sắt: [Fe2+] = 57 mg/l - Hàm lượng H2S: [H2S]= 45.7mg/l Nguồn nước thải giàu chất hữu dùng để làm giàu vi khuẩn SRB Nguồn SRB từ dịch làm giàu lần thứ Hình 3.7: Mơ hình xử lý nước nhiễm phèn sắt quy mơ phịng thí nghiệm (1) Ngăn điều hịa chứa nước nhiễm phèn sắt đầu vào (2) Ngăn xử lý nước nhiễm phèn sắt vi khuẩn SRB (3) Ngăn lắng chứa nước đầu sau xử lý Nguyên lý hoạt động: Nước bị nhiễm phèn sắt cho vào ngăn điều hịa để làm lắng số cặn sỏi, cát có nước Sau nước bị nhiễm phèn sắt chuyển sang ngăn thứ có chứa sẵn lớp phoi bao phía dưới, đồng thời bổ sung dịch làm giàu vi khuẩn SRB sau lần cấy truyền thứ vào Ủ điều kiện kỵ khí vịng ngày Sau ngày khảo sát khả xử lý nước bị nhiễm phèn sắt quy mơ phịng thí nghiệm ta thu kết sau: SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4.1 Kết thay đổi pH theo thời gian Bảng 3.7 Sự thay đổi pH theo thời gian Thời gian (ngày) pH 3.8 5.4 5.7 6.0 6.3 6.8 7 7.4 Sau ngày xử lý nước bị nhiễm phèn sắt vi khuẩn SRB pH mơi trường tăng lên từ 3.8 lên 7.4, đưa môi trường nước lên mức trung tính Đồ thị 3.5: Sự thay đổi pH theo thời gian 3.4.2 Kết thay đổi nồng độ ion sắt theo thời gian Bảng 3.8 Kết đo OD510nm để xây dựng đường chuẩn [Fe2+]mg/l OD510n m 0 0.1 0.003 0.5 0.013 0.03 0.096 K 1.075 Đồ thị 3.6: Đường tương quan tuyến tính OD510nm nồng độ [Fe2+] SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP • Kết đo OD510nm mẫu nước bị nhiễm phèn sắt theo thời gian: +Trước xử lý với SRB: OD510K(0) = 1.075 nm y=0.0188x+0.0036 Mà y=1.075 1.075=0.0188x+0.0036 x=57 (mg/l ) Vậy nồng độ [Fe2+] mẫu nước nhiễm phèn sắt ban đầu là: [Fe2+]=57mg/l Thực phép đo tương tự ta có bảng sau: Bảng 3.9 Sự thay đổi nồng độ ion sắt theo thời gian Thời gian (ngày) [Fe2+] (mg/l) (mẫu thí nghiệm) [Fe2+] (mg/l) Số liệu đối chứng [6] 57 55.4 51.6 46.3 43.7 37.1 32.8 30.1 28.6 60 56.9 51.1 43.8 38.2 34.5 30.2 26.1 22.8 Đồ thị 3.7: Sự thay đổi nồng độ Fe2+ theo thời gian SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4.3 Kết thay đổi hàm lượng sulfate theo thời gian, thông qua việc đo hàm lượn H2S sinh Bảng 3.10 Sự thay đổi hàm lượng H2S theo thời gian Thời gian (ngày) [H2S] (mg/l) (mẫu thí nghiệm) [H2S] (mg/l) (Số liệu đối chứng) [6] 45.7 51.2 59.1 68.4 77 85.3 88.3 90.7 92.5 102.1 40.2 47.8 56.2 69.5 80 88.3 95.7 98.3 Đồ thị 3.8: Sự thay đổi hàm lượng H2S theo thời gian Như qua trình xử lý nước bị nhiễm phèn sắt quy mô phịng thí nghiệm vi khuẩn khử sulfate (SRB) ta thấy: nồng độ sulfate, nồng độ [Fe 2+] giảm đồng thời pH môi trường tăng lên sau ngày khảo sát Điều chứng tỏ khả khử khử sulfate loại bỏ ion sắt khỏi nước bị nhiễm phèn sắt chủng vi khuẩn SRB 3.5 Giữ giống vi khuẩn SRB mơi trường thạch có lớp dầu khống Để hạn chế hay đình trao đổi chất, sinh sản phát triển…của vi khuẩn SRB điều kiện môi trường khác Ta phải tiến hành bảo quản cho giống giữ ngun tính chất, đặc điểm hình thái đặc biệt hoạt lực thời gian dài SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sử dụng phương pháp giữ giống vi khuẩn SRB mơi trường thạch có lớp dầu khống Giống giữ tủ lạnh điều kiện nhiệt độ 4÷50C Hình 3.8: Giữ giống vi khuẩn SRB môi trường thạch có lớp dầu khống CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết Luận SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Qua trình thực đề tài: ““Phân lập vi khuẩn có khả khử sulfate (Sulfate reducing bacteria- SRB) nhằm ứng dụng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt ” Nhóm nghiên cứu thu số kết sau: Kết nghiên cứu đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn SRB vừa phân lập sau: - Sinh trưởng tốt nguồn chất lacte - Nguồn nitơ bổ sung: chiết xuất cao nấm men - Điều kiện mơi trường: + pH=6.5÷8, tối ưu khoảng pH=7÷7.5 + Nhiệt độ: t0=20÷370C, tối ưu 300C Dựa vào khóa phân loại Bergey (Bergey‘s Manual of SystematicBacteriology) [23] Có thể kết luận chủng vi khuẩn phân lập từ phân bò chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB), có độ tương đồng khoảng 60% với vi khuẩn Desulfovibrio Oxamicus Khảo sát đánh giá sơ khả xử lý nước bị nhiễm phèn sắt chủng vi khuẩn khử sulfate (SRB) quy mơ phịng thí nghiệm thu kết khả quan: hàm lượng H2S, nồng độ [Fe2+] giảm, đồng thời pH môi trường tăng lên sau ngày khảo sát Cụ thể: - Hàm lượng H2S tăng từ 45.7 mg/l lên 92.5 mg/l - Nồng độ ion sắt [Fe2+] giảm từ 57mg/l 28.6 mg/l - pH môi trường từ 3.8 tăng lên 7.4 Giữ giống vi khuẩn SRB phương pháp: giữ giống vi sinh vật mơi trường thạch có lớp dầu khống 4.2 Kiến nghị Do thời gian, hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị…nghiên cứu có hạn nên nhóm nghiên cứu thu kết xin đề xuất số nghiên cứu nhằm hồn thiện q trình phân lập khảo sát hoạt tính vi khuẩn khử sulfate (SRB): • Phương pháp phân tích trình tự gen 16S rDNA: gen 16S rDNA chủng phân lập khuếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (AGAGTTTGATCCTGGTCAG) (weisburg cs,1991) để xây dựng phân loài định danh chủng vi khuẩn khử sulfate SRB phân lập [32] • Khảo sát khả xử lý vi khuẩn khử sulphate SRB với kim loại nặng độc hại khác như: Crom, đồng, kẽm, uranium,… • Nghiên cứu điều khiển q trình lên men để sản xuất chế phẩm vi sinh có khả xử lý nước bị nhiễm phèn sắt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng (chủ biên), Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003) Vi sinh vật Học NXB Giáo Dục SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [2] Vũ Thị Minh Đức (2001) Giáo trình Thực Tập vi sinh vật học NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, trang 28-39 [3] Đặng Thị Cẩm Hà (2006) Giáo trình Cơng nghệ Sinh học bảo vệ môi trường Trường ĐHBK Đà Nẵng [4] Nguyễn Thị Hải (2012) “Phân lập vi khuẩn khử sulphate (SRB) để ứng dụng xử lý nước thải axit từ hoạt động khai thác khống sản” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, số + 7, trang 42 – 40 [5] Lại Thúy Hiền, Đặng Phương Nga (1998) “Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa số chủng vi khuẩn KSF phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ”, tạp chí khoa học 20(2): 33-38 [6] Lại Thúy Hiền, Lê Phi Nga (1992) “Nghiên cứu khả gây ăn mòn kim loại vi khuẩn Desulfovibrio vulgaris” Tạp chí sinh học 14(4): 26-29 [7] Nguyễn Thị Thu Huyền, Trương Đại Dương, Lại Thúy Hiền (2011) “Vi khuẩn khử sulphate ưa ấm sử dụng dầu thô Desulfovibrio Desulfuricans DH3P phân lập từ giếng khoan dầu khí mỏ Đại Hùng, Vũng Tàu” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ biển T11 Số Trang 21-33 [8] Lê Thị Vu Lan, Phạm Minh Nhật (2012) Giáo trình Thực tập Vi Sinh Đại Cương Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cơng Nghệ thành phố Hồ Chí Minh [9] Biền Văn Minh (2003) Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật kiểm định Thừa Thiên Huếdùng làm đối tượng dạy thực hành vi sinh vật khoa sinh, trường ĐHSP-ĐH Huế Tạp chí khoa học giáo dục số 3, trường ĐHSP Hà Nội, trang 84-86 [10] Nghiêm Ngọc Minh, Phạm Ngọc Long, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2008) “Nghiên cứu số đặc điểm phân loại chủng kỵ khí khơng bắt buộc BDNS3 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin khu vực sân bay Đà Nẵng” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 6(3): 391-396, 2008 [11] Đồn Thị Hồi Nam (2008) Giáo trình Công Nghệ Sinh Học Môi Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng [12] Lê Xn Phương (2010) Giáo Trình Thí Nghiệm Vi Sinh Vật Học Khoa Hóa, Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [13] Lê Xuân Phương (2008) Giáo trình Hình thái, Cấu tạo đặc tính vi sinh vật Khoa Hóa, Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng [14] Võ Cơng Tuấn (2012) Giáo trình Thí nghiệm kỹ thuật phân tích cơng nghệ Sinh Học Khoa Hóa, trường Đại học Bách Đà Khoa Nẵng [15] Trần Thị Thanh (2009) Công nghệ vi sinh NXB giáo dục Việt Nam [16] Trần Linh Thước (2005) Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước,Thực Phẩm Và Mĩ Phẩm NXB Giáo Dục [17] Đào Hữu Vinh, Từ Vọng Nghi (1996) Các phương pháp hóa phân tích – tập NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh [18] Abhishek Mishra and Anushree Malik (2007) “Heavy metal removal from synthetic wastewaters in an anaerobic bioreactor using stillage from ethanol distilleries as a carbon source” Environmental science and Technology, DOI: 10,1080 / 10934529.2011.627044 [19] Bijmans, M.F.M., (2008).” Sulfate reduction under acidic conditions for selective metal recovery” Thesis Wageningen doctorship, Wageningen, The Netherlands Netherlands Research School for the Socio-Economic and Natural Sciences of the Environment [20] DeMaré, Frank, Donald M Kurtz Jr, Pär Nordlund " Desulfovibrio vulgaris rubrerythrin rubredoxin" (1996): 539-546 [21] Gallegos-Garcia M., Celis L.B., Rangel-Mendez R., Razo-Flores E ( 2009) Precipitation and recovery of metal sulfides from metal containing acidic wastewater in a sulfidogenic down-flow fluidized bed reactor Biotechnol and Bioeng., 102:91-99 [22] Hao OJ, Chen JM, Huang L, Buglass RL (1996) “Sulphate reducing bacteria” Crit Rev Enviro Sci Technol., 26, pp 155-187 [23] Hemme, Christopher, Judy Wall (2004) "Insights Desulfovibrio vulgaris Hildenborough" Omics Integrative Biology 8: 43-55 SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [24] Holt J.G, Krieg N.R.,Sneath PHA., Staley J.T., Williamss.T (1994) “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology”, Ninth Edition, The wiliams willins company, pp, 88-145 [25] Kremer DR, Hansen TA (1988) “Pathway of propionate degradation in Desulfobulbus propionicus” FEMS Microbiol Lett., 49, pp 273-277 [26] Lovley, Derek, Elizabeth Phillips (1994) "Cromat Desulfovibrio vulgaris c3 cytochrome" 60: 726-728 [27] Lansing M Prescott, john P Harley, Donal A Klein (2005) Microbiology Mc Graw Hill Science [28] Metcalf and Eddy (March 26, 2002) Wastewater Engineering : Treatment and Reuse McGraw-Hill [29] Peck HD, Lissolo T (1988) “Assimilatory and dissimilatorymsulphate reduction: enzymology and bio energentics” The Ntrogen and Sulphur Cycles, pp 99-132 [30] Postage JR (1984) The sulphate reducing bacteria Cambridge Univertsity Press, Cambridge [31] Widdel F (1988) “Microbiology and ecology of sulphate- and sulphurreducing bacteria” in Biology of Anaerobic Microorganism, pp 469-585 [32] Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991) "16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study" J Bacteriol., 173: 697–703 Tài liệu internet [33] (Ngày 20.09.2014) [34] (Ngày 25.10.2014) [35] ( Ngày 02.01.2015) [36] (Ngày 02.01.2015) [37] (Ngày 15.02.2015) [38] (Ngày 07.03.2015) SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [39] (Ngày 03.04.2015) PHỤ LỤC SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Một số cơng thức pha hóa chất 1.Pha thuốc nhuộm Gram • Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): + 2g tím kết tinh hồ tan 20ml etanol 95% + 0,8 g ammon oxalat hoà tan 80 ml nước cất Trộn hai dịch nói lại với nhau, giữ 48 lọc Bảo quản lọ tối, sử dụng vài tháng • Dung dịch Iod:Hồ tan 1g Iod (Iodine) 3÷5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản lọ tối • Dung dịch tẩy màu:Etanol 95% trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton • Dung dịch nhuộm bổ sung:Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5% Pha dung dịch đệm acetate Hòa tan 40g amoni acetate CH3COONH4 50ml axit acetic CH3COOH nước pha loãng tới 100ml Pha dung dịch 1,10-phenantrolin Hòa tan 0,5g 1,10-phenantrolin clorua, ngậm phân tử nước (C12H9ClN2.H2O) nước pha loãng 100ml Có thể thay cách hịa tan 0,42g 1,10-phenantrolin ngậm phân tử nước (C 12H9N2.H2O) 100ml nước chứa hai giọt axit clohydric HCl Dung dịch ổn định tuần bảo quản tối Pha hóa chất thí nghiệm xác định nồng độ H2S • Dung dịch Iot 0,01N: Hịa tan 3.5g KI nước cất, cho tiếp 1,27g I vào dung dịch KI, định mức thành lít • Dung dịch Natrithisunfat (Na2S2O3) 0,01N: Pha từ ống chuẩn có bán thị trường SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP • Dung dịch hồ tinh bột 0,5%: Cân 0,5g hồ tinh bột hòa tan 100ml nước cất, khuấy cho tan hết đun sôi để nguội SVTH: TRỊNH THỊ MỸ HẠNH Trang ... trên, em tiến hành thực đề tài: ? ?Phân lập vi khuẩn có khả khử sulfate (Sulfate reducing bacteria- SRB) nhằm ứng dụng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt? ?? Nước sau xử lý dùng cho hoạt động động trọt chăn... kết phân lập chủng vi khuẩn có khả khử sulfate (Sulfate reducing bacteria - SRB) nhằm ứng dụng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt Dựa số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, cấu tạo tế bào, đặc điểm sinh lý, ... khảo sát khả xử lý nước bị nhiễm phèn sắt vi khuẩn khử sulfate (SRB) quy mơ phịng thí nghiệm Hình 2.11: Mơ hình xử lý nước nhiễm phèn sắt quy mơ phịng thí nghiệm (1) Ngăn điều hịa chứa nước nhiễm