Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ (polycias fruticosa) bằng phương pháp nhân giống vô tính

i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan, cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Nếu nội dung nghiên cứu trùng lặp với cơng trình nghiên cứu cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm tn thủ kết luận đánh giá luận văn Hội đồng khoa học Thanh Hóa, ngày 05 tháng 10 năm 2015 Người cam đoan Nguyễn Thế Đại ii LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp hồn thành theo chương trình đào tạo cao học Đại học Lâm nghiệp Để có luận văn này, tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Trường Đại học Lâm nghiệp, Khoa Lâm học, Phòng đào tạo sau Đại học, Thầy Cô giáo – Các nhà khoa học, đặc biệt Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp Tiến sĩ Hà Văn Huân trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tác giả với dẫn khoa học quý giá suốt trình triển khai, nghiên cứu hoàn thành đề tài “Nghiên cứu nhân giống Đinh Lăng nhỏ (Polycias fruticosa L.Harms) phương pháp nhân giống vơ tính” Tác giả xin gửi lời cảm tạ sâu sắc đến Ban lãnh đạo quan: Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp (Trường Đại học Lâm nghiệp) Trung tâm nghiên cứu ứng dụng khoa học cơng nghệ Lâm nghiệp Thanh Hóa (Sở Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn Thanh Hóa), cho phép tạo điều kiện thuận lợi để tác giả thực tập, tiến hành bố trí thí nghiệm phục vụ luận văn Xin gửi lời tri ân đến đồng nghiệp, gia đình ln quan tâm, động viên, cảm thơng để tác giả hồn thành chương trình đào tạo thạc sĩ hoàn thành luận văn Xin kính chúc Thầy Cơ giáo, Lãnh đạo tập thể cán quan Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp Trung tâm nghiên cứu ứng dụng khoa học cơng nghệ Lâm nghiệp Thanh Hóa, gia đình, bạn bè ln dồi sức khỏe, hạnh phúc thành công sống Xin chân thành cảm ơn! Thanh Hóa, ngày 05 tháng 10 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thế Đại iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu khái quát Đinh lăng 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái giá trị sử dụng 1.1.3 Đặc tính sinh học, sinh thái 1.2 Đại cương nuôi cấy mô tế bào [20] 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2 Cơ sở khoa học chung nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3 Nhân giống vơ tính in vitro 1.3.1 Khái niệm nhân giống vơ tính in vitro 1.3.2 Yêu cầu thực tiễn 1.3.3 Một số phương thức nhân giống vơ tính in vitro 1.3.4 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 10 1.3.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới trình nhân giống 11 1.4 Nhân giống trồng phương pháp giâm hom 16 1.4.1 Cơ sở tế bào hình thành rễ bất định 17 1.4.2 Cơ sở sinh lý hình thành rễ bất định 17 iv 1.5 Một số kết việc nghiên cứu nhân giống vơ tính 21 1.5.1 Trên giới 21 1.5.2 Ở Việt Nam 23 1.6 Tình hình nghiên cứu nhân giống vơ tính Đinh lăng nhỏ 24 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.2.1 Nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro 26 2.2.2 Nhân giống phương pháp giâm hom 26 2.3 Vật liệu nghiên cứu 26 2.4 Địa điểm nghiên cứu 27 2.5 Thiết bị hóa chất 27 2.6 Phương pháp nghiên cứu 27 2.6.1 Phương pháp luận 27 2.6.2 Nguyên tắc bố trí thí nghiệm 28 2.6.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể nội dung nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro 28 2.6.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể nội dung nhân giống phương pháp giâm hom 33 2.7 Phương pháp thu thập số liệu xử lý số liệu 36 2.7.1 Phương pháp kế thừa tài liệu 36 2.7.2 Thu thập số liệu 37 2.8 Phương pháp xử lý số liệu 38 2.8.1 Số liệu nhân giống Đinh lăng nhỏ kỹ thuật ni cấy in vitro tính số sau: 38 2.8.2 Số liệu nhân giống Đinh lăng nhỏ phương pháp giâm hom tính số sau: 39 v Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết nghiên cứu nhân giống Đinh lăng phương pháp nuôi cấy in vitro 40 3.1.1 Ảnh hưởng hóa chất khử trùng đến hiệu tạo mẫu in vitro 40 3.1.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh nhân nhanh chồi Đinh lăng nhỏ in vitro 44 3.1.3 Tạo rễ cho chồi Đinh lăng in vitro 49 3.1.4 Quy trình nhân giống In vitro Đinh lăng 55 3.2 Kết nghiên cứu nhân giống Đinh lăng phương pháp giâm hom 55 3.2.1 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ rễ phát triển hom giâm 55 3.2.2 Ảnh hưởng chiều dài hom giâm đến tỷ lệ rễ phát triển hom giâm 57 3.2.3 Ảnh hưởng vị trí lấy hom đến tỷ lệ rễ phát triển hom giâm 60 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (IBA) đến tỷ lệ rễ phát triển hom giâm 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ BIỂU Viết tắt IBA BAP NAA ĐHST CTTN MS ĐC vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 viii DANH MỤC CÁC HÌNH TT 3.1 3.2 3.3 3.4a 3.4b 3.5 3.6 3.7a 3.7b 3.8a 3.8b 3.9a 3.9b 3.10 (a,b,c) 3.11 (a,b) 3.12 (a,b) 63 giâm bật chồi, nhiên tỷ lệ rễ hom giảm xuống cịn 88,9% có tượng rễ xuất không mặt cắt hom, xuất phần thân hom Điều giải thích nồng độ cao, mặt cắt hom bị đốt cháy nên rễ, phần thân bị ức chế xuất mô sẹo bật rễ để phát triển Như vậy, sử dụng IBA cho việc giâm hom Đinh lăng, nên sử dụng nồng độ từ 500 – 750ppm cho tỷ lệ rễ hom cao Hình 3.10a Hình 3.10c Hình 3.10 (a,b,c): Rễ khơng xuất phát từ mặt cắt hom sử dụng IBA nồng độ 1000ppm 64 Hình 3.11a Hình 3.11b Hình 3.11 (a,b): Rễ xuất phát từ mặt cắt hom sử dụng IBA với nồng độ 500 – 750 ppm Hình 3.12a Hình 3.12 (a,b): Cây Đinh lăng hom phát triển sau 25 ngày 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Nhân giống Đinh lăng phương pháp In vitro - Phương pháp tạo mẫu in vitro: Công thức khử trùng chồi Đinh lăng tốt khử trùng NaClO 60% với thời gian 15 phút cho tỷ lệ mẫu 83,33% tỷ lệ chồi tái sinh 76% - Kỹ thuật nhân nhanh chồi: Với mơi trường MS, có bổ sung: 20 g/l sucrose + g/l agar + 10% nước dừa Đồng thời sử dụng thêm tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng 1,0mg/l BAP + 0,2mg/l Kinetin cho tỷ lệ tái sinh chồi, hệ số nhân chồi chiều cao chồi sinh trưởng tốt với thông số 78,89%; 3,80 1,85 cm - Công thức tạo rễ Đinh lăng: Sử dụng mơi trường MS, có bổ sung 10% nước dừa, 30g/l sucrose, 1g/l than hoạt tính kết hợp IBA hàm lượng 1mg/l NAA với hàm lượng 0,5mg/l cho tỷ lệ chồi rễ cao (92,22%), thời gian ngắn (11 ngày), số rễ/chồi nhiều (3,9 rễ/chồi) chiều dãi rễ dài (3,2cm/rễ) 1.2 Nhân giống Đinh lăng phương pháp giâm hom - Với thí nghiệm bố trí giá thể phù hợp cho việc giâm hom Đinh lăng sử dụng 50% đất tầng B kết hợp với 50% mùn cưa Khi sử dụng giá thể tỷ lệ rễ đạt 88,9% - Khi giâm hom Đinh lăng, sử dụng hom có chiều dài 15 - 20cm tỷ lệ rễ hom hiệu sản xuất cao Tỷ lệ rễ đạt 84,44% 91,1%, hiệu sử dụng hom tiết kiệm so với hom dài 25cm 25 - 40% - Khi giâm hom Đinh lăng, sử dụng hom lấy từ thân cho tỷ lệ rễ tốt nhất, đạt 92,2% - Khi sử dụng IBA cho việc giâm hom Đinh lăng, nên sử dụng nồng độ từ 500 – 750ppm cho tỷ lệ rễ hom cao nhất, đạt 100% 66 Kiến nghị 2.1 Đối với nhân giống Đinh lăng phương pháp In vitro - Tiếp tục nghiên cứu thêm mơi trường chất điều hịa sinh trưởng cho giai đoạn kích thích tăng trưởng chồi Đinh lăng In vitro để chồi phát triển cách tốt - Tiếp tục nghiên cứu để xác định thêm số biện pháp kỹ thuật chăm sóc thời gian cần thiết nuôi dưỡng vườn ươm để Đinh lăng in vitro đạt tiêu chuẩn xuất vườn đem trồng sản xuất 2.2 Đối với nhân giống Đinh lăng phương pháp giâm hom - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ giâm hom, tuổi cành/cây mẹ lấy hom để nâng cao hiệu việc giâm hom Đinh lăng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Chí Bửu (2012), Hiện trạng nghiên cứu ứng dụng CNSH số trồng tỉnh miền Nam Kỷ yếu Hội thảo Khoa học Quốc gia-Kết nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học lĩnh vực trồng trọt, bảo vệ thực vật bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012 Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyền (2000), Thực vật rừng NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Trần Châu, Đỗ Mai Anh, Nguyễn Phương Dung (2007), Nghiên cứu số tác dụng dược lý thực nghiệm sản phẩm nuôi cấy mô Đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa L.Harms), Y học TP Hồ Chí Minh, tập 1, phụ số (2007) Hoàng Đức Cự (2006), Sinh học thực vật Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội Trần Thị Doanh (2012), Hoàn thiện, triển khai công nghệ vi nhân giống sản xuất công nghiệp giống bạch đàn U6 số dòng bạch đàn urơ có triển vọng khác Quảng Ninh Kỷ yếu Hội thảo Khoa học Quốc gia - Kết nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học lĩnh vực trồng trọt, bảo vệ thực vật bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012 Nguyễn Ngọc Dung (1998), Nhân giống Đinh lăng (Polyscias fruticosa L.Harms) thông qua đường tạo phôi sôma nuôi cấy in vitro Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học 1993 – 1998, Viện sinh học nhiệt đới, NXB Nông nghiệp, trang 442 – 445 Nguyễn Thị Thu Hằng (2009), Phát trình chồi từ ni cấy lóng thân hồn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radik) Báo cáo khoa học – Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Thái Nguyên 2009 tr.109-112 Nguyễn Hữu Hổ (2009), Bước đầu nghiên cứu tạo phôi sô-ma từ rễ in vitro sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) Báo cao khoa học – Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Thái Nguyên 2009 tr.143-146 Hà Bích Hồng (2012), Nhân giống in vitro Lõi thọ (Gmelina arborea Roxb) phục vụ bảo tồn nguồn gen Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn Tháng 6, 2012 10 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam Quyển II, Nhà xuất Trẻ, năm 2003, trang 668 11 Vũ Thị Huệ (2011), Tạo Lõi thọ phương pháp ni cấy in vitro Tạp chí Kinh tế Sinh thái 38:118-12 12 Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, Nguyễn Thới Nhâm (2001), Tác dụng dược lý cao toàn phần chiết xuất từ rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa L.Harms) Cơng trình nghiên cứu khoa học 1987 – 2000, Viện Dược liệu, NXB Khoa học kỹ thuật, trang 241- 244 13 Phạm Thị Tố Liên, Nguyễn Thị Ngọc Mai (2007), Bước đầu nghiên cứu tạo dịch treo tế bào Đinh lăng (Polyscias fruticosa L.Harms), Tạp chí phát triển KHCN, tập 10, số 7-2007 14 Viện dược liệu (2006), Nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam 15 Đỗ Tất Lợi (1986), Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, Trang 268 16 Phùng Văn Phê (2010), Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ 26:248-253 17 Tạp chí Dược học, Nghiên cứu phát triển nguồn gen đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms miền Đông Nam Bộ Số 462 10/2014 18 Tạp chí Dược học, Nghiên cứu tác dụng sâm Việt Nam Đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa L.Harms) trí nhớ, số 6/2005, tập 10 19 Bộ Y tế, (2002), Dược điển Việt Nam 3, NXB Y học, trang PL- 98, PL-128,PL-129 20 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, nghiên cứu ứng dụng Nhà xuất Hà Nội, 2000 21 Lê Thị Thư, Võ Thị Ngọc Mai (2005), Nghiên cứu phát sinh hình thái ni cấy In vitro Đinh lăng (Polyscias fructicosa), Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Tập số 11, trang 47-51, (2005) 22 Đỗ Năng Vịnh (2012), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ tế bào chọn tạo, phát triển giống trồng Kỷ yếu Hội thảo Khoa học Quốc gia - Kết nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học lĩnh vực trồng trọt, bảo vệ thực vật bảo vệ môi trường, Viện Di truyền Nông nghiệp 2012 23 Phan Hùng Vĩnh cộng (2009), Nhân nhanh in vitro Lan điểm hồng (Dendrobium draconis) lồi lan rừng có nguy tuyệt chủng Báo cáo khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc 2009 Trang 469-472 Tiếng Anh Adekola, O.F., I.G Akpan, and A.K Musa (2012), Effect of varying concentration of auxins and stem lengthon growth and development of Jatropha curcas L Ethioian Journal of Ennironmental Studies and Management EJESM, (3): 23-24 Fuffy, Soundy, W Mpati Kwena, S.du Toit Elsa, N Mudau Fhatuwani, T Araya Hintsa (2008), Influence of cutting position, Medium, Hormone and Season on Rooting of Fever tea (Lippa javanica L.) stem cuttings Medicinal anh Armomantic Plant Science anh Biotechnology, Global Science books, pp 114 - 116 Long J.C (1933), The influence of rooting media on the character of roots producced by cutting Proc, Amer Soc Hort Sci 21, pp 352 – 355 Marry weich – Keesey and B Rosie Lemer (2006), New plants from cuttings Http://www.hort.purdue.edu/ext/Ho-37 web.html PHỤ BIỂU Phụ biểu 01: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng BAP đến hiệu tái sinh chồi) Anova: Single Factor SUMMARY Groups ĐC NN1 NN2 NN3 NN4 NN5 NN6 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 02: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng BAP + IBA đến hiệu tái sinh chồi) SUMMARY Groups NT7 NT8 NT9 NT10 NT11 NT12 NT13 NT14 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 03: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng BAP + Kinetin đến hiệu tái sinh chồi) Anova: Single Factor SUMMARY Groups NN15 NN16 NN17 NN18 NN19 NN20 NN21 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 04: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi Đinh lăng) Anova: Single Factor SUMMARY Groups TR0 TR1 TR2 TR3 TR4 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 05: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Đinh lăng) Anova: Single Factor SUMMARY Groups TR5 TR6 TR7 TR8 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 06: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng IBA+ NAA đến khả rễ chồi Đinh lăng) Anova: Single Factor SUMMARY Groups TR9 TR10 TR11 TR12 TR13 TR14 TR15 TR16 TR17 TR18 TR19 TR20 TR21 TR22 TR23 TR24 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 07: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ rễ hom Đinh lăng) Anova: Single Factor SUMMARY Groups GT1 GT2 GT3 GT4 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 08: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng chiều dài hom đến tỷ lệ rễ hom Đinh lăng) Anova: Single Factor SUMMARY Groups HG1 HG2 HG3 HG4 HG5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 09: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng vị trí lấy hom đến tỷ lệ rễ hom Đinh lăng) Anova: Single Factor SUMMARY Groups LH1 LH2 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Phụ biểu 10: Phân tích phương sai nhân tố (Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng IBA đến tỷ lệ rễ hom Đinh lăng) SUMMARY Groups ĐC ĐH1 ĐH2 ĐH3 ĐH4 ĐH5 ĐH6 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total ... vật, công nghệ tạo giống nhân nhanh giống đại 1.6 Tình hình nghiên cứu nhân giống vơ tính Đinh lăng nhỏ Đã có số cơng trình nghiên cứu nhân giống Đinh lăng nhỏ, như: Nghiên cứu phát sinh hình... Hệ số nhân giống không cao,… Xuất phát từ sở thực tiễn nhu cầu nguồn giống Đinh lăng, sở khoa học nhân giống vơ tính, chúng tơi tiến hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu nhân giống Đinh Lăng nhỏ (Polycias. .. VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.2.1 Nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro 26 2.2.2 Nhân giống phương pháp