Khảo sát tần suất các alen trong các locus gen (ADN) hệ identifiler của dân tộc h’mông phục vụ cho công tác giám định gen ở việt nam​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN NHƢ GIANG KHẢO SÁT TẦN SUẤT CÁC ALEN TRONG CÁC LOCUS GEN (ADN) HỆ IDENTIFILER CỦA DÂN TỘC H’MÔNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH GEN Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Đề tài: KHẢO SÁT TẦN SUẤT CÁC ALEN TRONG CÁC LOCUS GEN (ADN) HỆ IDENTIFILER CỦA DÂN TỘC H’MÔNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH GEN Ở VIỆT NAM Học viên : Nguyễn Nhƣ Giang Chuyên ngành : Hóa Sinh Mã số :60420114 Ngƣời hƣớng dẫn : PGS TS Nguyễn Văn Hà Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn tới Thầy, cô giảng dạy Viện sinh thái tài nguyên sinh vật - Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam truyền đạt cho kiến thức chuyên sâu lĩnh vực Công nghệ sinh học, làm tiền đề cho tơi hồn thành Luận văn tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Hà - Phó giám đốc Trung tâm giám định sinh học pháp lý - Viện Khoa học hình tận tình hướng dẫn thời gian thực luận văn Tơi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện khoa học hình sự, Lãnh đạo Trung tâm giám định sinh học pháp lý, toàn tập thể cán Trung tâm tạo điều kiện giúp đỡ Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình ln tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học hoàn thành luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Nhƣ Giang Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ADN STR PCR D8 D21 D7 CSF D3 THO1 D13 D16 D2 D19 D18 D5 χ² χα Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 Tình hình nghiên cứu nước khảo sát tần suất alen locus gen sử dụng giám định ADN 1.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2 Tình hình nghiên cứu Việt nam Giám định gen (ADN) 2.1 Cơ sở khoa học giám định gen 2.1.1 Cấu trúc, chức phân tử ADN 2.1.2 Cơ chế phân ly độc lập tổ hợp tự sinh sản hữu tính 2.2 Lịch sử phát triển giám định ADN 2.3 Khái niệm giám định gen (ADN) 10 2.4 Khái niệm locus alen 12 2.5 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng giám định ADN 13 2.6 Ý nghĩa sở liệu tần suất alen locus STR 14 CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 Nội dung nghiên cứu: 16 Phương pháp nghiên cứu: 16 2.1 Thu mẫu: 16 2.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ: 17 2.2.1 Hóa chất thiết bị cho tách chiết ADN 17 2.2.2 Hóa chất thiết bị cho định lượng ADN 18 2.2.3 Hóa chất thiết bị cho nhân bội điện di .18 2.3 Phân tích mẫu 18 2.3.1 Tách chiết mẫu chelex 18 2.3.2 Định lượng ADN Realtime PCR 19 2.3.3 Nhân bội ADN (PCR) 20 2.3.4 Điện di máy điện di mao dẫn (Capillary Electrophoresis- CE) 22 Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.4 Xử lý thống kê số liệu 2.4.1 Cơ sở lý thuyết 2.4.2 Phương pháp xử lý thống kê 2.4.3 Các bước tính tốn thống kê kiểm định tiến hành phần mềm Excel: CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết 1.1 Thu mẫu 1.2 Phân tích mẫu thu đư kiểu gen 120 cá thể (Xem bảng - phụ lục) 1.3 Xử lý số liệu thống kê (Xem bảng 3.1 đến 3.15); tính bảng tần suất mẫu nghiên cứu (Xem bảng 3.16 đến 3.30); so sánh với số quần thể người Việt người nước (Xem bảng 3.31 đến 3.45) 1.3.1 Xử lý số liệu thống kê 1.3.2 Bảng tần suất mẫu nghiên cứu Bảng kết thảo luận sở liệu tần suất phân bố alen 15 locus gen (gồm bảng 3.16 đến bảng 3.30) 1.3.3 Kết so sánh tần suất alen người H’Mông với số người tộc người (xem Bảng từ 3.31 đến 3.45) biện luận : Bàn luận KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ỨNG DỤNG ĐỀ TÀI Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG BIỂU Hình Cấu trúc ADN nhân tế bào (trang 7) Hình Các locus gen hệ Identifiler (trang 24) Bảng 2.1 Thành phần phản ứng Realtime PCR (trang 20) Bảng 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR máy realtime 7500 (trang 20) Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR (trang 22) Bảng 2.4 Chu trình nhiệt máy PCR 9700 (trang 22) Bảng 2.5 Thành phần hỗn hợp điện di (trang 24) Bảng 3.1 đến 3.15 Xử lý số liệu thống kê (trang 27 đến trang 46) Bảng 3.16 đến 3.30 Bảng tần suất alen 120 mẫu nghiên cứu (trang 49 đến trang 55) Bảng 3.31 đến 3.45 So sánh tần suất alen với số quần thể (trang 56 đến trang 67) Bảng 1: Danh sách người H’ Mông thu mẫu (Phần phụ lục) Bảng 2: Kết định lượng 120 mẫu ADN 120 cá thể người H’Mông (Phần phụ lục) Bảng 3: Kết kiểu gen 120 cá thể người H’ Mơng (kí hiệu HM1 đến HM120) (Phần phụ lục) Số hóa trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Cơ sở khoa học, thực tiễn tính cấp thiết việc nghiên cứu đề tài: Người đặt móng cho ngành di truyền học Mendel Ông người phát quy luật di truyền Mendel gọi đặc điểm truyền từ hệ qua hệ khác “nhân tố di truyền”, mà sau gọi gen Trong nhân tế bào, nhiễm sắc thể xếp thành 23 cặp, 22 cặp nhiễm sắc thể thường cặp nhiễm sắc thể giới tính Các cặp nhiễm sắc thể quy định tính trạng khác thể, bảo tồn trì hệ di truyền từ hệ sang hệ khác Con thừa hưởng đặc tính di truyền thơng qua 23 nhiễm sắc thể từ tinh trùng bố 23 nhiễm sắc thể từ tế bào trứng mẹ Xét nghiệm truy nguyên cá thể người xác định huyết thống trực hệ cha - con, mẹ - chủ yếu thực cách sử dụng marker ADN nằm NST nhân tế bào Ngồi phân tích marker nhiễm sắc thể Y cịn xác định quan hệ huyết thống theo dòng cha ADN thường coi vật liệu di truyền cấp độ phân tử tham gia định tính trạng Trong trình sinh sản, phân tử ADN nhân đôi truyền cho hệ sau Năm 1953, Watson Crick xây dựng mơ hình cấu trúc khơng gian phân tử ADN Theo hai ơng, ADN có cấu trúc từ hai sợi xoắn kép có phân tử lượng lớn, sợi ADN chuỗi xoắn nucleotid gồm loại bazơ nitơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) Thymin (T) xếp nhau, xoắn quanh trục theo chiều từ trái sang phải thang dây xoắn, mà tay thang phân tử đường (C5H10O4) axit phôtphoric xếp xen kẽ nhau, bậc thang cặp bazơ nitric đứng đối diện liên kết với liên kết hiđrô theo nguyên tắc bổ sung, nghĩa bazơ lớn (A G) bù 63 Bảng 3.41 Locus vWA Alen 13 14 15 16 17 18 19 20 TS Alen 10 11 12 14 TS 64 Bảng 3.43 Locus D18S51 Alen 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 25 TS Alen người H’Mơng xuất quần thể khác, thấy 11 alen 65 Bảng 3.44 Locus D5S51 Alen 10 11 12 13 14 15 16 17 TS 66 Bảng 3.45 Locus FGA Alen 16 17 18 19 20 20.2 21 21.1 21.2 22 22.2 23 23.2 24 24.2 25 25.2 26 26.2 27 28 28.2 30.2 TS 67 Alen 28.2 alen đặc trưng, xuất người H’Mông; chưa thấy xuất người Thái lan, Malaixia, người Việt (kinh) Bàn luận Qua kết khảo sát, nhận thấy số alen đặc trưng, thấy xuất người H’Mông mà chưa thấy xuất quần thể khác Khi gặp mẫu có alen coi đặc điểm đặc biệt giúp cho mẫu mang tính truy ngun cao, nghi người H’Mơng, locus D21 có alen 35.2, locus D7 có alen 15, locus THO1 có alen 6.3, locus D19 có alen 17, locus FGA có alen 28.2 - Quần thể người H’Mơng khảo sát có lượng alen locus thường so với quần thể so sánh khác Nguyên nhân tập tục hôn nhân chủ yếu lấy người dân tộc, điều thể qua số lượng đồng hợp tử alen cao (bảng 3.16 đến 3.30) - Ứng dụng bảng tần suất alen locus gen hệ Identifiler 120 cá thể người H’Mông giám định gen (ADN) Viện Khoa học hình nói riêng đơn vị giám định khác giá trị khoa học để giám định viên biện luận trước tòa án, đảm bảo khách quan, công minh pháp luật 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Với kết khảo sát xây dựng bảng sở liệu tần suất alen gen thuộc hệ Identifiler quần thể người H’Mông rút số kết luận sau: - Đã khảo sát 120 mẫu ADN để xây dựng sở liệu tần suất alen gen thuộc hệ Identifiler quần thể người H’Mơng Q trình thống kê, tính tốn tần suất, kiểm định tính tốn phần mềm Exel, cho kết xác Kết kiểm định cho thấy mẫu thực nghiệm phù hợp với quần thể lý thuyết - Các phương pháp, trình tiến hành theo quy trình giám định ADN Viện Khoa học hình sự, kết đủ độ tin cậy để ứng dụng giám định gen cho cá thể người H’Mông - Qua nghiên cứu phát tổng số 120 mẫu nghiên cứu có 05 alen đặc trưng, thấy xuất quần thể H’Mơng Đó locus D21 có alen 35.2, locus D7 có alen 15, locus THO1 có alen 6.3, locus D19 có alen 17, locus FGA có alen 28.2 Những alen đặc điểm có khả truy nguyên cao để truy nguyên cá thể xác định quan hệ huyết thống cha - mẹ - Điều có ý nghĩa lớn để sàng lọc, định hướng truy tìm tội phạm xuyên quốc gia - Ứng dụng sở liệu tần suất giám định gen (ADN) Viện Khoa học hình nói riêng đơn vị giám định gen khác tồn quốc nói chung có ý nghĩa vơ cấp thiết, đặc biệt vụ án truy nguyên cá thể xác định quan hệ huyết thống cha - mẹ - con, kết chứng khoa học chối cãi được, đặc biệt tranh tụng trước tịa Kết có ý nghĩa lớn khơng nước mà cịn giá trị nhà giám định nghiên cứu gen hình giới 69 Kiến nghị Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, nghiên cứu số lượng mẫu phần lớn thuộc khu vực Tây Bắc Việt Nam Tuy nhiên, để có kết toàn diện tần suất alen quần thể người H’Mơng, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Mở rộng quy mô khảo sát, thống kê số lượng mẫu lớn hơn, kiểm định với mức xác suất p = 0,0001 - Tiếp tục khảo sát tần suất alen dân tộc khác Việt Nam, đặc biệt quần thể dân tộc Mường, Trung Quốc, Khơ me… sát - Các alen đặc trưng cho người H’Mông cần tiếp tục khảo Có thể phối hợp kết nghiên cứu đề tài với nghiên cứu di truyền khác quần thể người dân tộc H’Mông để rút đặc điểm quần thể dân tộc phục vụ nghiên cứu dân tộc học, khoảng cách di truyền… 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Chu Văn Mẫn, Đào Hữu Hồ (1999), iáo tr nh thống k sinh học, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Chu Văn Mẫn (2009), Tin học c ng nghệ sinh học, Nhà xuất giáo dục Việt nam iáo tr nh lý thuyết Thống k , NXB Giáo dục,HN 1996 Hà Quốc Khanh (2002), Điều tra xây dựng sở liệu tần suất gen hệ Nineplex người Việt (Kinh), Đề tài khoa học cấp Bộ Lê Đức Vĩnh (2006), iáo tr nh Xác suất thống k , Đại học Nông nghiệp – Hà Nội TS Lê Thị Thu Thủy (2011), Khảo sát xây dựng sở liệu tần suất alen 15 gen hệ Identifiler quần thể người Kinh ứng dụng giám định ADN lực lượng Kỹ thuật h nh sự, Đề tài khoa học cấp Bộ TS Lê Thị Thu Thủy (2012), Vai trò sở liệu tần suất giám định tư pháp gen (ADN), tạp chí Cảnh sát Phịng chống tội phạm, Số 31 (178) Phạm Xuân Kiều (2005), iáo tr nh Xác suất thống k , NXB GD TS Nguyễn Văn Đức (2002), Phương pháp kiểm tra thống kê Sinh học Nhà xuất khoa học kỹ thuật 10 Đào Hữu Hồ (1999), Xác suất thống k , nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội 11 Tăng Văn Khiên (2003), Điều tra chọn mẫu ứng dụng công tác thống k , NXB Thống kê, Hà Nội 12 Viện khoa học hình (2005), Nội iáo tr nh iám định sinh học pháp lý, Hà 13 Viện khoa học hình (2007), iáo tr nh iám định ADN, Hà Nội Tiếng Anh ADN Technology in Forensic Science (1992) Committee on DNA 14 Technology in Forensic Science, National Research Council Commission on Life Sciences (CLS) 15 AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit User’s Manual 16 Angel Carracedo (2005), Forensic DNA Typing Protocols, Humana Press Inc 17 Bio-Rad Cat No 143-2832 Insert Chelex 100 and Chelex 20 Chelating Ion Exchange Resin, Instruction Manual 18 Fung WK, Ye J, Hu L, Zhao X, Liu B, Wong DM, Law MY(2001), Allele frequencies for nine STR loci in Beijing Chinese Forensic Sci Int ; 121(3):207-9 19 John M Butler (2005), Forensic DNA Typing Elsevier 20 John M Butler (2010), Fundamentals of Forensic DNA Typing, Elsevier Inc 21 John M Butler (2012), Advanced Topics in Forensic DNA Typing, 22 John S Buckleton, Christopher M Triggs, Simon J Walsh, (2005), Forensic DNA Evidence Interpretation , CRC PRESS 23 Lawrence Koblinsky, Thomas F Liotti, Jamel Oeser-Sweat, (2005), DNA forensic and legal applications,A John Wiley & Sons, Inc Publication 24 Lawrence Kobilinsky, Louis Levine, Henrietta Margolis-Nunno (2007), 25 John M Butler (2003), Forensic DNA Typing Elsevier 26 Maruyama S, Minaguchi K, Takezaki N, Nambiar P (2008), Population data on 15 STR loci using AmpF/STR Identifiler kit in a Malay population living in and around Kuala Lumpur, Malaysia Leg Med (Tokyo) 10:160-2 27 Rerkammuaychoke B et al Thai population data on 15 tetrameric STR loci-D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 and FGA Forensic Science International 158 (2006) 234 -237 28 The Evaluation of Forensic DNA Evidence (1996) Commission on Life Sciences (CLS) 29 Wing Kam Fung, Yue – Qing Hu (2008), Statistical DNA Forensic ... ? ?Khảo sát tần suất alen locus gen (ADN) hệ Identifiler dân tộc H’Mông phục vụ cho công tác giám định gen Việt Nam” yêu cầu cấp thiết Mục đích đề tài : Khảo sát tần suất alen locus gen (ADN) hệ. .. VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Đề tài: KHẢO SÁT TẦN SUẤT CÁC ALEN TRONG CÁC LOCUS GEN (ADN) HỆ IDENTIFILER CỦA DÂN TỘC H’MÔNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH GEN Ở VIỆT NAM Học viên : Nguyễn Nhƣ Giang... (ADN) hệ Identifiler dân tộc H’Mông phục vụ công tác giám định gen Việt Nam Trên sở đó, tính tần suất xuất alen locus dân tộc H’Mơng, làm sở khoa học để phân tích, đánh giá đưa kết luận giám định