Nghiên cứu ứng dụng bộ kit prepfiler® trong tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt phục vụ công tác giám định AND tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Xuân Toàn NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỘ KIT PREPFILER® TRONG TÁCH CHIẾT ADN NHÂN TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH ADN TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Xuân Tồn NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỘ KIT PREPFILER® TRONG TÁCH CHIẾT ADN NHÂN TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH ADN TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VĂN HÀ PGS.TS BÙI PHƢƠNG THUẬN Hà Nội - 2015 Lời cảm ơn Để hoàn thành bản luâ ̣n văn này xin bày tỏ lòng cảm n sâu sắ c tới Đại tá, PGS.TS Nguyễn Văn Hà (Phó giám đốc Trung tâm giám định Sinh học Pháp lý - Viê ̣n Khoa ho ̣c hình sự - Bô ̣ Công an ) PGS TS Bùi Phương Thuận (Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội ) đã rấ t tâ ̣n tì nh hướng dẫn suố t quá trình nghiên cứu hoàn thành bản luâ ̣n văn Tôi xin chân thành cảm ơn Lañ h đa ̣o Viện Khoa học hình , Lãnh đạo Trung Tâm các đồng nghiệp Trung tâm giám đinh ̣ Sinh ho ̣c Pháp lý - Viê ̣n Khoa ho ̣c hình - Bơ ̣ Cơng an đã đô ̣ng viên , giúp đỡ rất nhiều quá trình làm luận văn Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các thầ y cô giáo thuô ̣c khoa Sinh học , trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tâ ̣n tin ̀ h truyề n đa ̣t kiế n thức và giú p đỡ suố t quá triǹ h ho ̣c tâ ̣p Cuố i cùng xin bày tỏ lòng biế t ơn đế n gia đình và ba ̣n bè , đã đô ̣ng viên , góp ý tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Lê Xn Tồn Lời cam đoan Tơi xin cam đoan là công trình nghiên cứu của r iêng Các số liệu, kế t quả nêu luâ ̣n văn là trung thực và chưa từng đươ ̣c công bố bấ t cứ công triǹ h nào khác Tác giả Lê Xuân Toàn Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn MỤC LỤC MỞ ĐẦU Sự cần thiết việc nghiên cứu đề tài Mục đích nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giám định ADN từ nhân tế bào Khoa học hình .9 1.1.1 Lịch sử giám định ADN khoa học hình 1.1.2 Giám định ADN 10 1.2 Các kỹ thuật tách chiết ADN 14 1.2.1 Phương pháp tách chiết hữu (phương pháp tách chiết phenol/ chloroform/ Isoamyl Alcohol) 14 1.2.2 Phương pháp tách chiết chelex 14 1.2.3 Phương pháp tách chiết cột silica 15 1.2.4 Phương pháp tách chiết bợ kit PrepFiler® 16 1.3 Cấu tạo xƣơng, ngƣời sở để phân tích ADN xƣơng, 19 1.3.1 Cấu tạo bộ xương người 19 1.3.2 Phân tích ADN từ xương người 21 1.3.3 Cơ sở để sử dụng bợ kit PrepFiler® việc tách chiết ADN từ hài cốt để phục vụ giám định ADN khoa học hình .25 1.4 Các kit khác có thể sử dụng để tách chiết ADN từ mẫu răng, xƣơng 25 1.4.1 QIAamp Investigator DNA Kit 25 1.4.2 PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction Kit 26 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .27 2.2 Dụng cụ hố chất thí nghiệm 30 2.2.1 Dụng cụ thí nghiệm .30 2.2.2 Hóa chất thí nghiệm 31 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn 2.3.1 Phương pháp làm mẫu 31 2.3.2 Phương pháp nghiền mẫu 32 2.3.3 Phương pháp tách chiết ADN bợ kit PrepFiler® .32 2.3.4 Định lượng sản phẩm ADN sau tách chiết 39 2.3.5 Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết phản ứng PCR 40 2.3.6 Điện di và phân tích kết 41 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Kết định lƣợng sản phẩm ADN sau tách chiết .43 3.2 Kết điện di mẫu xƣơng có thời gian dƣới năm 46 3.2.1 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 46 3.2.2 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 48 3.2.3 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 49 3.2.4 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 50 3.2.5 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 51 3.2.6 Đánh giá kết tách chiết ADN các mẫu và xương có thời gian 02 năm 52 3.3 Kết tách chiết mẫu xƣơng có thời gian từ 02 - 10 năm: 53 3.3.1 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 53 3.3.2 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 54 3.3.3 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 56 3.3.4 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 58 3.3.5 Phân tích kết điện di từ thí nghiệm 10 59 3.3.6 Đánh giá kết tách chiết ADN các mẫu và xương có thời gian từ 02 đến 10 năm 60 3.4 So sánh kết phân tích ADN mẫu hài cốt .62 3.5 Quy trình tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt kit PrepFiler® 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh kiểu gen 03 người nghi có quan ̣ cha Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm nhóm hài cốt có thời gian 02 năm Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm nhóm hài cốt có thời gian từ 02 – 10 năm Bảng 2.3 Nồng độ mẫu chứng Realtime PCR Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR sử dụng kit Identifiler Bảng 2.5 Chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR sử dụng kit Identifiler Bảng 2.7 Chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR Bảng 2.8 Thành phần hỗn hợp điện di máy ABI 3130 Bảng 3.1 Kết định lượng ADN tổng số từ thí nghiệm đến thí nghiệm các mẫu hài cốt có thời gian 02 năm Bảng 3.2 Kết định lượng ADN tổng số từ nghiệm đến thí nghiệm 10 mẫu hài cốt có thời gian từ 02 – 10 năm Bảng 3.3 So sánh kiểu gen mẫu R1, X1, R2, X2 với mẫu so sánh tương ứng Bảng 3.4 So sánh kiểu gen mẫu R3, X3, R4, X4 với mẫu so sánh tương ứng Bảng 3.5 So sánh kiểu gen mẫu R5, X5, R6, X6 với mẫu so sánh tương ứng DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh phân tích kết điện di phần mềm GeneMapper ID v.3.2 Hình 1.2 Bơ ̣ kit PrepFiler® Hình 1.3 Tỉ lệ thành cơng phân tích ADN ti thể các vị trí xương khác thể người Hình 1.4 Cấu tạo xương dài Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xn Tồn Hình 1.5 Cấu tạo hàm Hình 2.1 Mẫu răng, xương có thời gian 02 năm Hình 2.2 Mẫu răng, xương có thời gian từ 02 - 10 năm Hình 2.3 Ảnh kết Realtime PCR máy Eco™ Real-Time PCR System (hãng Illumina – Mỹ) Hình 3.1 So sánh kết định lượng ADN tổng số từ thí nghiệm đến thí nghiệm mẫu hài cốt có thời gian 02 năm (răng số xương số 1) Hình 3.2 So sánh kết định lượng ADN tổng số thí nghiệm 3,6,7,8 Hình 3.3 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.4 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.5 Ảnh kết điện di thí nghiệm - xương số Hình 3.6 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.7 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.8 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.9 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.10 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.11 Ảnh kết điện di thí nghiệm - xương số Hình 3.12 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.12 Ảnh kết điện di thí nghiệm - số Hình 3.12 Ảnh kết điện di thí nghiệm 10 - số Hình 3.12 Ảnh kết điện di thí nghiệm 10 - số Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Danh mục chữ viết tắt Chữ viết tắt Cụm từ đầy đủ ADN, DNA Deoxyribonucleic acid Axit đêoxiribonucleic Base pair Cặp bazơ DDT Dithiothreitol Dithiothreitol PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen RFLP Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn bp Nghĩa tiếng việt Polymorphism rfu Relative fluorescent units Đơn vị huỳnh quang rpm Rovolutions per minute Số vòng quay mỗi phút STR Short Tandem Repeat Các trình tự lặp lại ngắn Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn MỞ ĐẦU Sự cần thiết việc nghiên cứu đề tài Cùng với phát triển xã hội, tình hình tội phạm ngày phức tạp, phương thức thủ đoạn phạm tội ngày tinh vi nên sử dụng phương pháp giám định dấu vết truyền thống thông qua dấu vân tay, vải sợi… không đủ sở làm chứng các vụ án Ngày nay, nhờ có phát triển công nghệ sinh học, với việc tìm cách tách chiết phân tích ADN nhân tế bào nhân tế bào người, ứng dụng vào công tác điều tra, các điều tra viên có thể truy nguyên cá thể cách xác thông qua dấu vết tưởng chừng rất nhỏ mà thủ phạm để lại dấu vết máu, tế bào đầu lọc thuốc lá, bã kẹo cao su Hàng năm, Viện Khoa học hình nhận rất nhiều trưng cầu giám định ADN, đó dấu vết để lại các vụ án hình khơng máu, lơng tóc hay tinh dịch mà cịn tử thi chưa rõ tung tích các phận thể Khi đó việc giám định ADN từ các mẫu mô rất khó khăn tử thi bị thối rữa nhiều tháng, chí phân hủy hồn tồn qua nhiều năm, có thể giám định ADN thông qua xương cịn sót lại nạn nhân Điển các vụ án ―xác chết không đầu‖, ―thẩm mỹ viện Cát Tường‖… các vụ án rất dư luận quan tâm Tuy nhiên, với các mẫu hài cốt, việc phân tích ADN nhân tế bào gặp rất nhiều khó khăn, bù lại phân tích được, dù vài locus rất có giá trị, chí giá trị truy ngun cịn cao việc phân tích toàn gen ty thể hài cốt đó Đặc biệt việc xác định danh tính hài cốt liệt sĩ, giám định hệ gen ty thể khơng thể phân biệt cá thể đặc điểm di truyền theo dòng mẹ Nhưng thu vài locus gen nhân tế bào, có thể truy nguyên xác danh tính liệt sĩ, thông qua người thân họ Mặt khác, các hài cốt liệt sĩ lượng xương thu hạn chế, nên cần phải tiến hành phân tích lượng mẫu tối thiểu đó việc lựa chọn quy trình tách chiết hiệu bước Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn tăng lượng proteinase K thời gian ủ mẫu khơng thể tăng hiệu tách chiết, hàm lượng chất lượng ADN thu thấp (thí nghiệm 6) Cần phải có biện pháp khác để tăng lượng ADN thu - Để tăng hàm lượng chất lượng ADN thu việc tăng lượng mẫu đưa vào cần thiết, tăng gấp đôi lượng mẫu hóa chất vào ống Eppendoft 1,5 ml (thí nghiệm 7) lượng ADN thu không tăng, có tượng vón cục ủ mẫu lượng bột răng, xương quá nhiều Thấy nhược điểm đó, thí nghiệm 8, lượng bột răng, xương tăng gấp đôi, cách thực thí nghiệm riêng biệt, tiến hành gộp mẫu vào lần rửa thứ bước 5, lượng hóa chất thay đổi cho phù hợp tiết kiệm Sở dĩ cần tiến hành gộp mẫu mà không tách riêng hẳn đến thu ADN bước cần tiến hành nhanh trước hạt từ kịp hồi tính, gộp mẫu lại trước thu ADN có nồng độ cao (gộp mẫu trước thu ~ 45 µl, so với khơng gộp mẫu thu ~ 60 µl, số lượng ADN khơng thay đổi) Kết thu thí nghiệm tốt hẳn so với thí nghiệm 7, hàm lượng chất lượng ADN thu cải thiện nhiều, nhiên vài locus bị mất, cần phải tiếp tục cải tiến phương pháp tách chiết - Đến thí nghiệm 9, tăng lượng bột răng, xương gấp ba, cách thực ủ mẫu riêng rẽ với nhau, gộp mẫu mẫu vào lần rửa thứ bước 5, lượng hóa chất thay đổi cho phù hợp kết thu rất tốt, hàm lượng chất lượng ADN thu cải thiện so với thí nghiệm 8, đặc biệt chất lương ADN thu rất tốt (chỉ locus bị mất) Tuy nhiên thí nghiệm lại cho thấy tiếp tục tăng lượng bột răng, xương lên nữa, lượng hạt từ quá nhiều, tăng lên khơng thể loại bỏ hết hạt từ Nhưng kết mà thí nghiệm đạt đủ để có thể sử dụng thực tế, thí nghiệm 10 thực để kiểm tra tính ổn định tồn phương pháp cho kết rất tốt, hoàn toàn có thể sử dụng các vụ án thực tế 61 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn 3.4 So sánh kết phân tích ADN mẫu hài cốt Trong 12 mẫu xương thuộc hài cốt tiến hành thí nghiệm có 10 mẫu thuộc 05 hài cốt có mẫu so sánh, người nghi ngờ có mối quan hệ huyết thống trực hệ với hài cốt, Còn 02 mẫu thuộc 02 hài cốt khơng có mẫu so sánh Kết so sánh kiểu gen thu từ 12 mẫu: - Các mẫu đối chứng âm đều cho kết âm tính, chứng tỏ quy trình tách chiết khơng bị nhiễm ADN - 12 mẫu thuộc 06 hài cốt khác nhau, các mẫu thuộc hài cốt có kiểu gen hoàn toàn trùng - 05 hài cốt (Bộ hài cốt số 1,2,3,4 5) có quan hệ huyết thống trực hệ với 05 mẫu so sánh tương ứng Kết chứng tỏ phương pháp tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt kit PrepFiler® hồn tồn có thể tin cậy để sử dụng, Kế t quả nghiên cứu đề tài góp phầ n giải quyế t kip̣ th ời yêu cầu thực tiễn đă ̣t với công tác giám đinh ̣ ADN ta ̣i Viê ̣n Khoa học hình - Bộ Cơng an, viê ̣c đưa quy triǹ h chi tiế t cho tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt và ứng du ̣ng trực tiế p quy trin ̣ vào các vu ̣ án thực tế cho thấ y đề tài đã hoàn thành tố t mu ̣c tiêu đề ̀ h giám đinh và ứng du ̣ng trực tiế p vào thực tiễn ta ̣i phịng thí nghiệm Bộ Cơng an 62 Viện Khoa học hình - Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Bảng 3.3 So sánh kiểu gen mẫu R1, X1, R2, X2 với mẫu so sánh tƣơng ứng KiÓu gen Locus gen R1 X1 Mẫu so sánh R2 X2 Mẫu so sánh D8S1179 15; 17 15; 17 15; 18 14; 17 14; 17 14 D21S11 29; 31 29; 31 29 D7S820 10; 11 10; 11 10; 13 8; 14 8; 14 11; 14 CSF1PO 10; 12 10; 12 12 11; 12 11; 12 11 D3S1358 17; 19 17; 19 17; 18 16; 17 16; 17 16; 17 TH01 7; 7; 8; 10 9 8; D13S317 11 11 11; 13 8; 11 8; 11 8; 12 D16S539 10; 13 10; 13 10 12 12 12; 14 D2S1338 19 19 19; 22 17; 19 17; 19 19; 22 D19S433 13 13 13; 15 13; 14 13; 14 13; 14 vWA 19 19 19; 21 17; 19 17; 19 17 TPOX 8 11 11 8; 11 D18S51 12; 15 12; 15 12; 16 14; 21 14; 21 14; 16 D5S818 7; 10 7; 10 10 10; 13 10; 13 7; 10 FGA 21 21 21; 23 20; 25 20; 25 18; 20 AMEL XY XY XX XY XY XY 63 30;32,2 30;32,2 30; 32,2 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Bảng 3.4 So sánh kiểu gen mẫu R3, X3, R4, X4 với mẫu so sánh tƣơng ứng Kiểu gen Locus gen R3 X3 Mẫu so sánh R4 X4 Mẫu so sánh D8S1179 16 16 15; 16 13; 14 13; 14 13; 15 D21S11 31,2;33,2 31,2;33,2 30; 31,2 30;32,2 30;32,2 30 D7S820 10; 12 10; 12 12 11 11 11; 12 CSF1PO 10; 12 10; 12 10; 11 10; 11 10; 11 10; 11 D3S1358 16; 18 16; 18 16 17; 18 17; 18 17 TH01 8; 8; 9 7; 7; 7; D13S317 8; 12 8; 12 8; 9 9; 10 D16S539 9; 11 9; 11 11; 12 9 9; 10 D2S1338 19 19 19; 22 24 24 24 D19S433 11; 15,2 11; 15,2 11; 13 15;15,2 15;15,2 15; 17 vWA 17 17 17 17; 20 17; 20 17; 21 TPOX 10 10 8; 10 8 8; 12 D18S51 14; 15 14; 15 14; 23 13; 16 13; 16 13; 14 D5S818 7; 12 7; 12 7; 12 10; 13 10; 13 13; 15 FGA 22; 24 22; 24 22 21;23,2 21;23,2 21 XY XY XY XY XY XX AMEL 64 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Bảng 3.5 So sánh kiểu gen mẫu R5, X5, R6, X6 với mẫu so sánh tƣơng ứng Kiểu gen Locus gen R5 X5 Mẫu so sánh R6 X6 D8S1179 11; 12 11; 12 11; 12 14; 15 14; 15 D21S11 29; 31 29; 31 30; 31 29;33,2 29;33,2 D7S820 9; 11 9; 11 11 8; 13 8; 13 CSF1PO 10; 12 10; 12 10 12; 13 12; 13 D3S1358 15; 17 15; 17 15; 16 15 15 TH01 8; 8; 9 9; 9,3 9; 9,3 D13S317 9; 10 9; 10 8; 10; 12 10; 12 D16S539 11; 12 11; 12 9; 12 9; 12 9; 12 D2S1338 17; 19 17; 19 17; 23 21; 23 21; 23 D19S433 13; 16,2 13; 16,2 13; 15,2 12; 13 12; 13 vWA 17; 18 17; 18 17; 19 18; 20 18; 20 TPOX 11 11 8; 11 8 D18S51 12; 16 12; 16 13; 16 14; 21 14; 21 D5S818 10 10 10 11; 14 11; 14 22; 23 22; 23 19; 23 24; 26 24; 26 XY XY XY XY XY FGA AMEL 65 Mẫu so sánh Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xn Tồn 3.5 Quy trình tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt kit PrepFiler® Sau tiến hành nghiên cứu, luận văn đưa quy trình tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt kit PrepFiler® các vụ án hính sau: QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN NHÂN Tế BÀO TẾ BÀO TỪ HÀI CỐT Làm mẫu: - Tiến hành làm học nước cất, bàn chải, giấy nhám, máy mài xương cầm tay cưa sắt để loại bỏ phần bị sâu, xương bị mục các chất bẩn bám bề mặt răng, xương - Lấy lượng xương khoảng 2g cắt thành mảnh nhỏ làm sạch, đưa vào ống Falcon 50 ml chứa Javen 10%, lắc đều 30 giây loại bỏ nước Javen (lưu ý: không để quá lâu javen, để quá lâu làm hỏng mẫu) Sau đó lắc nước cất (5 đến lần tùy chất lượng mẫu) Cuối lắc cồn 90% lấy để khơ tự nhiên điều kiện bình thường - Sử dụng phương pháp khử trùng, diệt vi khuẩn tia UV 15 phút Sau đó có thể nghiền mẫu cất mẫu tủ lạnh sử dụng Nghiền mẫu: Có thể làm cách sau: Nghiền răng, xương nitơ lỏng máy nghiền chuyên dụng Nghiền răng, xương các thao tác học thông thường Sử dụng chày cối inox không gỉ Bột răng, xương thu cất vào tủ lạnh sử dụng Tách chiết ADN kit PrepFiler®: A Đối với mẫu hài cốt có thời gian 02 năm: Bƣớc Ủ mẫu với lysis Buffer: Chuyển 50 mg bột xương (hoặc răng) vào ống Enpendoft 1,5 ml Thêm 300 µl Prepfiler Lysis Buffer, µl DTT 1.0 M µl Proteinaza K (*) 66 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Lắc ống Enpendoft giây, sau đó ly tâm vài giây để hóa chất trộn đều với Bọc ống Enpendoft paraphin để tránh bị bật nắp lắc ủ Để ống Enpendoft chứa mẫu vào máy lắc nhiệt, ủ 560C với tốc độ 900 rpm đến sáng hôm sau (12 - 14 giờ) Bƣớc Loại bỏ chất: Tắt máy lắc nhiệt, lấy ống Enpendoft để nhiệt độ phòng phút, loại bỏ paraphin đưa ống Enpendoft vào máy ly tâm (ly tâm 13000 vòng phút) Hút phần dịch bên chuyển sang ống Enpendoft khác để tiến hành bước (lưu ý: không hút phần bột răng, xương) Phần bột xương lại có thể bỏ giữ lại cho các thí nghiệm khác Bƣớc Gắn ADN với hạt từ tính (Magnetic Particlec) Lắc tuýp Prepfiler Magnetic Particlestrong giây (lật ngược tuýp để chắn không có hạt từ vón cục đáy tuýp) Hút 15 µl hạt từ tính cho vào ống Enpendoft chứa dịch thu từ bước Lắc ống Enpendoft tốc độ chậm (500 đến 1200 vòng/phút) 10 giây để hạt từ tan đều dung dịch Bổ sung thêm 180 µl Isopropanol tiếp tục lắc tốc độ chậm 500 đến 1200 vòng/phút vài giây (nếu có tượng sủi bọt phải thêm Isopropanol), sau đó ly tâm vài giây để đảm bảo không có hạt từ bám bên thành ống Enpendoft Lắc ống Enpendoft máy lắc nhiệt độ phòng 10 phút với tốc độ 1000 vòng/phút Bƣớc Rửa ADN liên kết với hạt từ Lấy ống Enpendoft khỏi máy lắc, ly tâm vài giây để không có hạt từ bám bên thành ống Enpendoft Đưa ống Enpendoft vào giá từ chờ từ - phút để hạt từ chuyển hết về thành ống phía giá từ Lấy pipet hút loại bỏ hết phần chất lỏng nhìn thấy (không hút hạt từ) 67 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Tiếp theo thực bước lần: a Thêm 300 µl Prepfiler Wash Buffer vào ống Enpendoft chứa hạt từ b Lấy ống Enpendoft khỏi giá từ lắc tốc độ cao để hạt từ tan dung dịch Prepfiler Wash Buffer, khơng cịn hạt từ bám thành ống Enpendoft ly tâm vài giây d Đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng - phút e Dùng pipet hút loại bỏ hết phần dịch lỏng nhìn thấy Bƣớc Thu ADN Sau rửa hạt từ Prepfiler Wash Buffer lần, mở nắp ống Enpendoft để khô 10 phút Khi hạt từ khơ hồn tồn, thêm 30 µl Prepfiler Elution Buffer Lắc ống Enpendoft để hạt từ tan vào dung dịch Prepfiler Elution Buffer phải đảm bảo không có hạt từ bám vào thành tuýp, sau đó đưa ống Enpendoft vào máy lắc nhiệt (ủ 560C với tốc độ 900 rpm phút) Sau phút lấy ống Enpendoft khỏi máy máy lắc nhiệt, lắc nhẹ li tâm vài giây để khơng cịn hạt từ bám dính vào thành ống Enpendoft, sau đó đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng phút Hút phần chất lỏng chứa ADN (không hút hạt từ) vào ống Enpendoft Toàn ADN thu chứa ống cuối có thể sử dụng cho các bước bảo quản ngăn đá tủ lạnh đến sử dụng B Đối với mẫu hài cốt có thời gian từ 02 - 10 năm: Bƣớc Ủ mẫu với lysis Buffer: Chuyển 150 mg bột xương (hoặc răng) vào 03 ống Enpendoft 1,5 ml (mỗi ống chứa 50 mg) (*) Thêm 300 µl Prepfiler Lysis Buffer, µl DTT 1.0 M µl Proteinase K vào ống Enpendoft (*) 68 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Lắc ống Enpendoft giây, sau đó ly tâm vài giây để hóa chất trộn đều với Bọc ống Enpendoft paraphin để tránh bị bật nắp lắc ủ Để ống Enpendoft chứa mẫu vào máy lắc nhiệt, ủ 560C với tốc độ 900 rpm đến sáng hôm sau (12 - 14 giờ) Bƣớc Loại bỏ chất: Tắt máy lắc nhiệt, lấy các ống Enpendoft ra, để nhiệt độ phòng phút, loại bỏ paraphin đưa các ống Enpendoft vào máy ly tâm (ly tâm 13000 vòng phút) Hút phần dịch bên chuyển sang ống Enpendoft khác để tiến hành bước (lưu ý: không hút phần bột răng, xương) Phần bột xương lại có thể bỏ giữ lại cho các thí nghiệm khác Bƣớc Gắn ADN với hạt từ tính (Magnetic Particlec) Lắc tuýp Prepfiler Magnetic Particles giây (lật ngược tuýp để chắn không có hạt từ vón cục đáy tuýp) Hút 15 µl hạt từ tính cho vào ống Enpendoft chứa dịch thu từ bước Lắc ống Enpendoft tốc độ chậm (500 đến 1200 vòng/phút) 10 giây để hạt từ tan đều dung dịch Bổ sung thêm 180 µl Isopropanol vào ống tiếp tục lắc tốc độ chậm (500 đến 1200 vòng/phút) vài giây (nếu có tượng sủi bọt phải thêm Isopropanol), sau đó ly tâm vài giây để đảm bảo không có hạt từ bám bên thành ống Enpendoft Lắc các ống Enpendoft máy lắc nhiệt độ phòng 20 phút với tốc độ 1000 vòng/phút (*) Bƣớc Rửa ADN liên kết với hạt từ Lấy các ống Enpendoft khỏi máy lắc, ly tâm vài giây để không có hạt từ bám bên thành ống Enpendoft 69 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Đưa các ống Enpendoft vào giá từ chờ từ - phút để hạt từ chuyển hết về thành ống phía giá từ Lấy pipet hút loại bỏ hết phần chất lỏng nhìn thấy (khơng hút hạt từ) Tiếp theo thực bước rửa lần: Lần 1: a Thêm 300 µl Prepfiler Wash Buffer vào ống Enpendoft chứa hạt từ b Lấy ống Enpendoft khỏi giá từ lắc tốc độ cao để hạt từ tan dung dịch Prepfiler Wash Buffer, khơng cịn hạt từ bám thành ống Enpendoft ly tâm vài giây c Đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng - phút d Dùng pipet hút loại bỏ hết phần dịch lỏng nhìn thấy Lần 2: (*) a Thêm 600 µl Prepfiler Wash Buffer vào ống Enpendoft thứ nhất, trộn đều để hạt từ tan vào dung dịch Prepfiler Wash Bufferm Sau đó hút toàn đưa vào ống thứ 2, tiếp tục mix cho hạt từ tan đều hút tất cho vào ống cuối b Lấy ống Enpendoft khỏi giá từ lắc tốc độ cao để hạt từ tan dung dịch Prepfiler Wash Buffer, khơng cịn hạt từ bám thành ống Enpendoft ly tâm vài giây c Đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng phút d Dùng pipet hút loại bỏ hết phần dịch lỏng nhìn thấy Lần 3: (*) a Thêm 600 µl Prepfiler Wash Buffer vào ống Enpendoft chứa hạt từ b Lấy ống Enpendoft khỏi giá từ lắc tốc độ cao để hạt từ tan dung dịch Prepfiler Wash Buffer, khơng cịn hạt từ bám thành ống Enpendoft ly tâm vài giây c Đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng phút d Dùng pipet hút loại bỏ hết phần dịch lỏng nhìn thấy 70 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn Bƣớc Thu ADN Sau rửa hạt từ Prepfiler Wash Buffer lần, mở nắp ống Enpendoft để khô 10 phút Khi hạt từ khơ hồn tồn, thêm 60 µl Prepfiler Elution Buffer (*) Lắc ống Enpendoft để hạt từ tan vào dung dịch Prepfiler Elution Buffer phải đảm bảo không có hạt từ bám vào thành tuýp, sau đó đưa ống Enpendoft vào máy lắc nhiệt (ủ 560C với tốc độ 900 rpm phút) Sau phút lấy ống Enpendoft khỏi máy máy lắc nhiệt, lắc nhẹ li tâm vài giây để khơng cịn hạt từ bám dính vào thành ống Enpendoft, sau đó đưa ống Enpendoft vào giá từ khoảng phút Hút phần chất lỏng chứa ADN (không hút hạt từ) vào ống Enpendoft khác, đưa ống Enpendoft vào máy ly tâm (ly tâm 10.000 vòng/phút phút) hút phần chất lỏng chứa ADN (không hút hạt từ) vào ống Enpendoft Toàn ADN thu chứa ống cuối có thể sử dụng cho các bước bảo quản ngăn đá tủ lạnh đến sử dụng Ghi chú: - (*): bước thay đổi so với quy trình gốc nhà sản xuất - Quy trình dành riêng cho tách chiết ADN nhân tế bào từ các mẫu răng, xương hài cốt có thời gian 10 năm sau chết (gồm quy trình cho nhóm hài cốt có thời gian 02 năm từ 02 năm đến 10 năm sau chết) - Tồn quy trình thực hồn tất cho kết vịng 02 ngày: Sáng ngày thứ nhất: Làm mẫu Chiều ngày thứ nhất: Nghiền mẫu và ủ mẫu qua đêm Sáng ngày thứ hai: Tách chiết, thu ADN và tiến hành PCR Chiều ngày thứ hai: Điện di và phân tích kết 71 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Bước đầu ứng dụng kit Prepfiler® tách chiết ADN nhân tế bào từ hài cốt có thời gian 10 năm để phục vụ cơng tác giám định ADN hình Viện Khoa học hình - Bộ Cơng an Hiệu tách chiết ADN nhân tế bào kit Prepfiler® từ các mẫu xương tương tự Kiến nghị: Khuyến cáo cán khám nghiệm tử thi cần thu – hàm để phục vụ công tác giám định (do mẫu dễ thu, dễ bảo quản, niêm phong vận chuyển) Tiếp tục tiến hành nghiên cứu ứng dụng kit Prepfiler® để tách chiết ADN từ các mẫu hài cốt có thời gian 10 năm Mở rộng nghiên cứu ứng dụng các kit tách chiết ADN khác để tách chiết ADN từ các mẫu hài cốt nhằm chủ động công tác giám định ADN Việt Nam 72 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Văn Hà (2011), Nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp tách chiết và tinh ADN ti thể từ răng, xương người phục vụ giám định ADN ti thể điều kiện Việt Nam, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, Viện Khoa học hình sự, Tổng cục cảnh sát phịng chống tội phạm, Bộ Cơng an Hồng Tử Hùng (2010), Giải phẫu răng, NXB Y học Hoàng Tử Hùng (2010), Mô phôi miệng, NXB Y học Hà Quốc Khanh, Nguyễn Văn Hà (2007), Giám định ADN, Viê ̣n khoa ho ̣c hin ̀ h sự, Chu Văn Mẫn, Đào Hữu Hồ (2001), Thống kê Sinh học, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Ngô Tiến Quý (2008), Bảo vệ và khám nghiệm trường, NXB Công an Nhân dân Ngô Tiến Quý (2013), Phát hiện, thu, bảo quản, nghiên cứu và giám định dấu vết sinh vật, NXB Công an Nhân dân Ngô Tiến Quý, Hà Quốc Khanh, Nguyễn Văn Hà cộng (2005), Giám ̣nh sinh học pháp lý, Viê ̣n khoa ho ̣c hiǹ h sự Lê Thị Thu Thủy (2012), Khảo sát và xây dựng sở liệu tần suất các alen 15 gen hệ Identifiler quần thể người Việt (Kinh) ứng dụng giám định gen (ADN) lực lượng Kĩ thuật hình sự, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, Viện Khoa học hình sự, Tổng cục cảnh sát phịng chống tội phạm, Bộ Cơng an 10 Phạm Xn Thủy, Hà Quốc Khanh (2010), Dấu vết sinh vật và pháp y hình sự, Giáo trình Học viện Cảnh sát Nhân dân 11 Lê Đình Vấn (2013), Giải phẫu học, NXB Y học Tiếng Anh 12 Budowle B, Onorato AJ, Callaghan TF, Della Manna A, Gross AM, Guerrieri RA, Luttman JC, McClure DL (2009), ―Mixture interpretation: defining the relevant features for guidelines for the assessment of mixed DNA profiles in forensic casework‖, Journal of Forensic Sciences, 54, pp, 810-821 13 Caragine T, Mikulasovich R, Tamariz J, Bajda E, Sebestyen J, Baum H, Prinz M (2009), ―Validation of testing and interpretation protocols for 73 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn low template DNA samples using AmpFlSTR Identifiler‖, Croatian Medical Journal, 50, pp, 250-267 14 Gaines ML, Wojtkiewicz PW, Valentine JA, Brown CL (2002), ―Reduced volume PCR amplification reactions using the AmpFlSTR Profiler Plus kit‖, Journal of Forensic Sciences, 47, pp, 1224-1237 15 Gilbert N (2010), “Science in court: DNA’s identity crisis”, Nature, 464, pp, 347-348 16 Gill P, Whitaker J, Flaxman C, Brown N, Buckleton J (2000), “An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA”, Forensic Science International, 112, pp, 1740 17 Greenspoon SA, Scarpetta MA, Drayton ML, Turek SA (1998), ―QIAamp Spin columns as a method of DNA isolation for forensic casework‖, Journal of Forensic Sciences, 43, pp,1024-1030 18 John M, Butler (2005), Forensic DNA Typing: Biology, Technology and Genetics of STR Markers, Elsevier, USA 19 Kloosterman AD, Kersbergen P (2003), ―Efficacy and limits of genotyping low copy number (LCN) DNA samples by multiplex PCR of STR loci”, Soc Biol, 197, pp, 351-359 20 Locard E (1930), ―The analysis of dust traces—Part I‖, American Journal of Political Science, 1, pp, 276–298 21 Mulero JJ, Chang CW, Lagacé RE, Wang DY, Bas JL, McMahon TP, Hennessy LK (2008), ―Development and validation of the AmpFlSTR MiniFiler PCR amplification kit: a miniSTR multiplex for the analysis of degraded and/or PCR inhibited DNA‖, Journal of Forensic Sciences, 53, pp, 838-852 22 Oorschot RA, Szepietowska I, Scott DL, Weston RK, Jones MK (1999), Retrieval of genetic profiles from touched objects, Proceedings of the First International Conference in Forensic Human Identification, London 23 Oorschot RAH, Phelan DG, Furlong S, Scarfo GM, Holding NL,Cummins MJ (2003), ―Are you collecting all the available DNA from touched objects?‖, International Congress of the SER, 1239, pp, 803-807 24 Park SJ, Kim JY, Yang YG, Lee SH (2008), ―Direct STR amplification from whole blood and blood- or saliva-spotted FTA without DNA purification‖, Journal of Forensic Sciences, 53, pp, 335-341 74 Luận văn thạc sỹ khoa học Lê Xuân Toàn 25 Prinz M, Schiffner L, Sebestyen JA, Bajda E, Tamariz J, Shaler RC, Baum H, Caragine T (2006), ―Maximization of STR DNA typing success for touched objects‖, International Congress of the SER, 1288, pp, 651-653 26 Raymond JJ, Walsh SJ, van Oorschot RAH, Gunn PR, Evans L, Roux C (2008), ―Assessing trace DNA evidence from a residential burglary: abundance, transfer and persistence‖, Forensic Science International Genet Suppl Ser, 1, pp, 442-443 27 Schiffner L, Bajda E, Prinz M, Sebestyen J, Shaler R, Caragine T (2005), ―Optimization of a simple, automatable extraction method to recover sufficient DNA from low copy number DNA samples for generation of short tandem repeat profiles‖, Croatian Medical Journal, 46, pp, 578586 28 Smith PJ, Ballantyne J (2007), ―Simplified low-copy-number DNA analysis by post-PCR purifiaction‖, Journal of Forensic Sciences, 52, pp, 820829 29 Timothy P McMahon (2015), ―Post Mortem Affects on DNA, DNA Extraction and Challenged DNA Processing‖, American Registry of Pathology Contractor, 3, pp 10 – 50 30 Weston AA, Nagel JHA, Benschop CCG, Weiler NEC, de Jong BJ, Sijen T (2009), ―Higher capillary electrophoresis injection settings as an efficient approach to increase the sensitivity of STR typing‖, Journal of Forensic Sciences, 54, pp, 591-598 31 Wickenheiser RA (2002): ―Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact‖, Journal of Forensic Sciences, 47, pp, 442-450 32 Wickenheiser RA, Jobin RM (1999), ―Case of comparison of DNA recovered from a contact lens using PCR DNA typing‖, Canadian Society of Forensic Science Journal, 32, pp, 67–73 75