Xây dựng quy trình phát hiện staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) và xác định yếu tố di truyền SCCmec của MRSA trên thịt tươi sống bằng kỹ thuật multiplex realtime polymerase chain reaction

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC BÁCH KHOA VƢƠNG XUÂN VÂN XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN Staphylococcus aureus KHÁNG METHICILIN (MRSA) VÀ XÁC ĐỊNH YẾU TỐ DI TRUYỀN SCCmec CỦA MRSA TRÊN THỊT TƢƠI SỐNG BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP.HỒ CHÍ MINH, THÁNG 01 NĂM 2018 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG HCM Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS.Cao Hữu Nghĩa Cán chấm nhận xét 1: TS.Hoàng Mỹ Dung Cán chấm nhật xét 2: TS.Lƣơng Thị Mỹ Ngân Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG HCM ngày 12 tháng 01 năm 2018 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ tịch: PGS.TS.Nguyễn Đức Lƣợng Thƣ ký: PGS.TS.Nguyễn Thúy Hƣơng Phản biện 1: TS.Hoàng Mỹ Dung Phản biện 2: TS.Lƣơng Thị Mỹ Nga Ủy viên: PGS.TS.Lê Phi Nga Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trƣởng khoa quản lý chuyên ngành sau LV đƣợc sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: VƯƠNG XUÂN VÂN MSHV: 13310321 Ngày, tháng, năm sinh: 22/08/1989 Nơi sinh: TP.Hồ Chí Minh Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số : 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình phát Staphylococcus aureus kháng methicilline (MRSA) xác định yếu tố di truyền SCCmec MRSA thịt tươi sống kỹ thuật Multiplex Realtime Polymerase Chain Reaction II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xây dựng quy trình phát MRSA xác định yếu tố di truyền SCCmec tuýp IIV mẫu thịt tươi sống kỹ thuật Multiplex Real-time PCR - Thẩm định quy trình xây dựng so sánh với phương pháp nuôi cấy kết hợp với phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ đo đường kính vịng kháng khuẩn - Ứng dụng quy trình xây dựng vào kiểm tra mẫu thịt tươi sống bán lẻ thị trường III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : (Ghi theo QĐ giao đề tài) 10/07/2017 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo QĐ giao đề tài) 03/12/2017 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): PGS.TS.BS.Cao Hữu Nghĩa CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) Tp HCM, ngày 02 tháng 01 năm 2018 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) Ghi chú: Học viên phải đóng tờ nhiệm vụ vào trang tập thuyết minh LV LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS.Cao Hữu Nghĩa tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ vào tạo điều kiện cho trình thực đề tài nhƣ suốt thời gian công tác Qúy Thầy Cô – Trƣờng Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh giảng dạy, truyền đạt kiến thức giúp đỡ cho suốt trình học tập ThS.Nguyễn Thị Nguyệt – Trƣởng Labo.Vi sinh thực phẩm Viện Pasteur TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành nghiên cứu luận văn Các Cô, Anh Chị Em đồng nghiệp Lab.Vi sinh Thực phẩm hỗ trợ giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu làm việc Các đồng nghiệp Lab.HIV, Lab.Vi sinh bệnh phẩm, Trung tâm Cúm Quốc gia Viện Pasteur TP.HCM giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Gia đình ln bên cạnh động viên, yêu thƣơng điểm tựa vững cho Tôi xin chân thành cảm ơn tất i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ  Tiếng Việt Kể từ S.aureus kháng methicillin đƣợc tìm thấy thực phẩm, quan tâm lan truyền chúng thực phẩm ngày gia tăng Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp phát MRSA mẫu thịt tƣơi sống xác định yếu tố SCCmec I-IV chúng kỹ thuật Multiplex Realtime PCR hai giai đoạn Mẫu thịt tƣơi sống đƣợc tiền tăng sinh môi trƣờng Giolitti Cantoni broth, tách chiết DNA vi khuẩn phƣơng pháp đun sôi Triton X100 Phản ứng Multiplex Realtime PCR1 phát MRSA dựa hai gen nuc mecA Phản ứng Multiplex Realtime PCR2 xác định yếu tố di truyền SCCmec dựa ba gen SCCmec I, SCCmec II III, SCCmec I II IV Kết thẩm định cho thấy phƣơng pháp xây dựng có độ đặc hiệu tƣơng đƣơng với phƣơng pháp ni cấy đo đƣờng kính vịng kháng khuẩn theo chuẩn mực CLSI; có giới hạn phát 100CFU/g có tính ổn định cao Ứng dụng phƣơng pháp để kiểm nghiệm 100 mẫu thịt tƣơi sống bán lẻ thị trƣờng cho thấy tỷ lệ nhiễm MRSA 26% (26/100 mẫu), mẫu nhiễm MRSA SCCmec tuýp IV 9/26 mẫu, MRSA SCCmec tuýp I phát đƣợc 6/26 mẫu, MRSA SCCmec tuýp III nhiễm 2/26 mẫu, khơng có mẫu nhiễm MRSA SCCmec II, lại 9/26 mẫu nhiễm MRSA mang yếu tố SCCmec tuýp khác  Tiếng Anh Since Methicillin - resistance S.aureus (MRSA) was first found in food, there has been attention that they can possibly spread in food Our study developed a method for MRSA detection in retal meat, and determining their SCCmec elements type I to type IV by two-step Multiplex Realtime PCR technique Sample was precultured in Giolitti Cantoni broth, then bacteria DNA was extracted by boiling with Triton X100 MRSA was detected by Multiplex Realtime PCR1 reaction based on two genes mecA and nuc SCCmec elements of MRSA were determined by Multiplex Realtime PCR2 reaction based on three genes - SCCmec I, SCCmec II III, ii SCCmec I II IV Validation results showed that our method had the same specification as culture method and disk diffusion according to CLSI standard; detection limit was 100CFU/g and had a high stabillity We applied this method for analysing 100 samples of retail meat Prevalence of MRSA contamination of retail meat was 26% (26/100 samples) Among that, MRSA SCCmec type IV contaminated on 9/26 samples; MRSA SCCmec type I, MRSA SCCmec type III were found on 6/26 samples; and 9/26 samples contaminated by other SCCmec type of MRSA There were no samples contaminated by SCCmec type II iii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Ký tên Vƣơng Xuân Vân iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH x DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LƢỢC SỬ MRSA 1.2 Ý NGHĨA LÂM SÀNG CỦA MRSA 1.2.1 MRSA có nguồn gốc từ bệnh viện (HA-MRSA) .4 1.2.2 MRSA có nguồn gốc từ cộng đồng (CA-MRSA) 1.2.3 MRSA động vật (LA-MRSA) 1.3 PHÂN LOẠI - ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ - KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MRSA 1.3.1 Phân loại .6 1.3.2 Đặc điểm hình thái sinh lý .6 1.3.3 Yếu tố độc lực 1.3.4 Khả gây bệnh .9 1.4 CƠ CHẾ KHÁNG KHÁNG SINH HỌ BETA-LACTAM CỦA MRSA 11 1.5 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN MRSA VÀ XÁC ĐỊNH YẾU TỐ DI TRUYỀN SCCmec .12 1.5.1 Nƣớc .12 1.5.2 Trong nƣớc .15 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 17 v 2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN .17 2.3 THIẾT BỊ, SINH PHẨM, HĨA CHẤT, MƠI TRƢỜNG 17 2.3.1 Thiết bị .17 2.3.2 Sinh phẩm, hóa chất 18 2.3.3 Môi trƣờng .20 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.4.1 Xây dựng kỹ thuật phát MRSA yếu tố SCCmec MRSA thịt tƣơi sống 21 2.4.2 Thẩm định quy trình xây dựng so sánh với phƣơng pháp nuôi cấy kết hợp với phƣơng pháp thử nghiệm kháng sinh đồ đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn 32 2.4.3 Ứng dụng phƣơng pháp mẫu thịt tƣơi sống bán lẻ thị trƣờng 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 36 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG KỸ THUẬT PHÁT HIỆN MRSA VÀ YẾU TỐ DI TRUYỀN SCCmec CỦA MRSA TRÊN THỊT TƢƠI SỐNG 36 3.1.1 Kết kiểm tra hiệu mồi Taqman probe 36 3.1.2 Kết tối ƣu hóa mồi Taqman probe 41 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG .53 3.2.1 Độ đặc hiệu 54 3.2.2 Độ nhạy – giới hạn phát 59 3.2.3 Độ lặp lại – độ tái lặp .60 3.3 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP TRÊN MẪU THỊT BÁN LẺ TRÊN THỊ TRƢỜNG 64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1 KẾT LUẬN 67 4.2 KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT S.aureus Staphylococcus aureus MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus MSSA Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus ISO International Organization for Standardization CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute CFU Colony Forming Unit BP Baird Parker MH Mueller Hinton BHI Brain Heart Infusion SCCmec Staphylococcal Catssette Chromosome mec PCR Polymerase Chain Reaction PBP Penicillin-binding protein PBP2a Penicillin-binding protein 2a HA-MRSA Hospital-Assositate MRSA CA-MRSA Community-Acquired MRSA LA-MRSA Livestock MRSA CDC Centers for Disease Control and Prevention TSST-1 Toxin shock syndrome toxin -1 R Resistant S Sensitive vii CHƢƠNG KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ VƢƠNG XUÂN VÂN 4.1 KẾT LUẬN  Đề tài xây dựng thành công kỹ thuật phát MRSA xác định yếu tố di truyền SCCmec I-IV thịt tƣơi sống 24 cụ thể: - Mẫu đƣợc tiền tăng sinh môi trƣờng Giolitti Cantonii broth - Tách chiết DNA phƣơng pháp đun sôi Triton X100 - Phản ứng Multiplex Realtime PCR1 để phát MRSA: Tổng thể tích phản ứng 20µl, 10µl thể tích GoTaq Master Mix 2µl thể tích khn mẫu DNA, nồng độ hai cặp mồi cho gen mecA nuc lần lƣợt 900nM 1000Nm; Nồng độ hai Taqman probe cho gen mecA nuc lần lƣợt 250Nm 300nM - Phản ứng Multiplex Realtime PCR2 để để xác định yếu tố di truyền SCCmec MRSA: Tổng thể tích phản ứng 20µl, 10µl thể tích GoTaq Master Mix 2µl thể tích khn mẫu DNA; nồng độ ba cặp mồi cho gen SCCmec I, SCCmec II III SCCmec I II IV lần lƣợt 900Nm, 800nM 700nM; nồng độ ba Taqman probe cho gen SCCmec I, SCCmec II III SCCmec I II IV 200nM  Thẩm định phƣơng pháp xây dựng cho thấy phƣơng pháp hoàn toàn phù hợp để phát MRSA xác định yếu tố SCCmec I-IV thịt tƣơi sống đạt đƣợc tiêu chí sau: - Độ đặc hiệu: phƣơng pháp có khả phát tốt chủng MRSA chuẩn loại trừ chủng MRSA, độ đặc hiệu tƣơng đƣơng với phƣơng pháp ni cấy đo đƣờng kính vịng kháng khuẩn - Độ nhạy: phƣơng pháp có giới hạn phát 100CFU/g, nhạy so với phƣơng pháp nuôi cấy đo đƣờng kính vịng kháng khuẩn - Độ lặp lại độ tái lặp: phƣơng pháp có độ ổn định tốt đƣợc thực lặp lại điều kiện khác điều kiện thử nghiệm  Ứng dụng phƣơng pháp xây dựng đồng thời với phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống thịt tƣơi sống bán lẻ TP.Hồ Chí Minh, đề tài thu đƣợc kết nhƣ sau: 67 LUẬN VĂN THẠC SĨ - VƢƠNG XUÂN VÂN Phát đƣợc 62% mẫu nhiễm S.aureus 26% mẫu nhiễm MRSA, hai tỷ lệ cao tỷ lệ phát S.aureus MRSA phƣơng pháp nuôi cấy (57% 19%) - Tuýp SCCmec MRSA phát đƣợc mẫu thịt tƣơi sống cao MRSA SCCmec tuýp IV (9/26 mẫu), MRSA SCCmec tuýp I phát đƣợc 6/26 mẫu, MRSA SCCmec tuýp III nhiễm 2/26 mẫu, khơng có mẫu nhiễm MRSA SCCmec tuýp II, lại 8/26 mẫu nhiễm MRSA mang yếu tố SCCmec khác Ngồi ra, đề tài cịn xây dựng đƣợc ngân hàng chủng MRSA khuôn mẫu DNA khảo sát yếu tố di truyền SCCmec MRSA mẫu thịt tƣơi sống, làm tiền đề cho nghiên cứu khảo sát MRSA mẫu thịt tƣơi sống mà mẫu thực phẩm nói chung 4.2 KIẾN NGHỊ Ứng dụng phƣơng pháp Multiplex Realtime PCR khảo sát mẫu thịt tƣơi sống để phát MRSA đồng thời với xác định tuýp SCCmec chúng giúp giảm thời gian phân tích, tiết kiệm nhân lực sinh phẩm hóa chất Mở rộng mẫu phƣơng pháp, nhƣ mẫu thủy hải sản, sản phẩm sữa, sản phẩm từ thịt,… để ứng dụng phƣơng pháp phát MRSA nhiều đối tƣợng, nhiều nhóm thực phẩm Tiếp tục xây dựng phƣơng pháp Multiplex Realtime PCR để xác định yếu tố SCCmec khác MRSA Ứng dụng phƣơng pháp Multiplex Realtime PCR vào công tác đánh giá nguy thực phẩm để nhanh chóng đƣa chƣơng trình hành động, phịng ngừa, truyền thông khuyến cáo cho quan chức ngƣời dân nhằm hạn chế lây lan vi khuẩn kháng kháng sinh cộng đồng Đây tiền đề để Labo Vi sinh thực phẩm – Viện Pasteur TP.HCM tiếp tục xây dựng phƣơng pháp Realtime PCR để phát vi khuẩn kháng kháng sinh gây bệnh thực phẩm phục vụ cho cơng tác phịng chống dịch chức giám sát an tồn thực phẩm tỉnh thành khu vực phía Nam 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiếng Việt: C.N.Hồng (2014) Đánh giá thực trạng giết mổ nhiễm vi khuẩn thịt lợn sở giết mổ thuộc tỉnh Nam Định Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 12, số 4, trang 549-557 D.T.Tài (2011), Mối liên quan độc tố ruột tính nhạy cảm kháng sinh S.aureus phân lập Viện Pasteur TP.HCM (2006-2010), Tạp chí Y học dự phịng, tập XXI, số (124), trang 250 -256 L.T.L.Khai (2014) Khảo sát chất lượng thịt heo vấy nhiễm vi sinh vật hai sở giết mổ gia súc thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp thành phố Cần Thơ Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ 2014 -2, trang 53-62 N.H An (2013), Tỉ lệ đề kháng kháng sinh Staphylococcus aureus mẫu bệnh phẩm Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Tạp chí Y học dự phịng, 23, 10, 270-275 N.T.N.Lan (2011), Tình hình kháng kháng sinh chủng vi khuẩn thường gặp phân lập bệnh nhân nhiễm trùng tiểu Viện Pasteur TP.HCM năm 2010, Tạp chí Y học dự phịng, 21, 5, 78-85 P.N.Đ.Trang (2016), Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh gen quy định độc tố exfoliative toxins phân lập từ chủng S.aureus phân lập Viện Pasteur TP.HCM, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, tập 19, số T3-2016, trang 16-23 Nguyễn Đỗ Phúc (2013) Staphylococcus aureus TP.Hồ Chí Minh  Tiếng Anh: Agata Turlej (2011), Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) Classification and Typing Method: an Review, Polish Journal of Microbiology Vol 60, No.2, pg 95-103 Anja Klancnik (2012), Chapter 10: PCR in Food analysis, Polymerase Chain Reaction, Slovenia, pg 197 -220 69 10 Catarina Milheirico (2007), Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in MRSA: “SCCmec IV multiplex”, USA, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, pg 42-48 11 Demetrio L.Valle Jr (2016), Molecular and phenotypic characterization of MRSA isolated from a tertiary hospital in the Philippine, Tropical Medicine and Health, pg 1-9 12 Elizabeth L.Palavecino (2014), Chapter 1: Clinical, Epidemiologic, and Laboratory Aspects of Methicillin-Resistant S.aureus Infection, MRSA 13 Guerino Macori (2017), Molecular Epidemiology of MRSA and MSSA in the ovine dairy chain and in farm related Humans, Toxin 2017, 9, 161 14 ISO 6888-3:1999/AMD-1:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium 15 Ivan Brukner (2013), Significantly Improved Performance of a Multitarget Assay Over a Commercial SCCmec-Based Assay for MRSA Screening, Elsevier, Candada 16 Ivan Manga (2013), A new Real-time PCR assay for rapid identificaiton of the S.aureus/MRSA strain, Acta universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae brunensis, volume LXI, pg 1787 - 1791 17 J.Danial (2011), Real-time evaluation of an optimized real-time PCR assay versus Brilliance chromogenic MRSA agar for the detection of MRSA from clinical speciments, Journal of Medical Microbiology, p 323-328 18 Maiko Motoshima (2010), Genetic Diagnosis of Community-Acquired MRSA: A Multiplex Real-time PCR method for SCCmec and detecting toxin genes, Tohoku J.Exp Med., Japan, pg 165-170 19 Ryan R.McDonald (2005), Development of a Triplex Real-time PCR assay for Detection of Panton-Valentine Leukocidin Toxin Genes in Clinical Isolates of MRSA, Journal of Clinical Microbiology, Dec.2005, pg 6147 -6149 70 20 Satoru Kitai (2004), Characterization of MRSA isolated from Retail Raw Chicken Meat in Japan, Japan, Puplic Health 21 Tereza Trncikova (2009), Rapid and Sensitive Detection of S.aureus in Food Using Selective Enrichment and Real-time PCR Targeting a New Gene Marker, Food Anal Method, pg 241-250 22 Tianming Li (2017), Molecular Characteristics of S.aureus Causing Bovine Mastitis between 2014 and 2015, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 23 Valeria Velasco (2014), Multiplex Real-time PCR for detection of Staphylococcus aureus, mecA and Panton-Vanlentine Leukocidin (PVL) Genes from Selective Enrichments from Animals and Reatail meat, US Center for Disease Dynamics Economics & Policy (2015) Chapter 3: Antibiotic in Agriculture and the Environment The State of the World’s antibiotic 2015, Washington D.C, pg 38 – 48 24 World Health Organization (WHO) (2014), Section -Resistance data on specific pathogens Antimicrobial resistance – Global report on surveillance, France, pg 19 25 J.Scott Weese (2010), Methicilline-Resistant Staphylococcus aureus in Animals ILAR Journal Volume 51, Number 3, pg 233-244 26 Steven et al (2009), MRSA: Genetic, Virulence Factor, and Toxin Expression MRSA Second edition, Informa Healthcare, USA 71 PHỤ LỤC DANH SÁCH KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM MẪU THỊT TƢƠI SỐNG BÁN LẺ TẠI CÁC CHỢ Ở TP.HCM PP nuôi cấy Mã số Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Test coagulase Cefoxitin 30µg Multiplex RT PCR nuc mecA Multiplex RT PCR SCCmec SCCmec SCCmec I II III I II IV Thịt heo Thịt heo Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 + S + - Thịt heo Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 + S + + - + - Thịt heo Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 - + + - - - Thịt heo Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 + + + - - + Thịt heo Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 - + + - - - Thịt heo Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 + S + + - - + Thịt heo Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 + S + + - - + Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 Chợ Ng Tri Phƣơng, Q.10 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 + + + S S S + + + - Chợ Xóm Chiếu, Q.4 + R + + 10 11 12 13 Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo 14 Thịt heo S + - + Kết S.aureus MRSA SCCmec tuýp III MRSA MRSA SCCmec tuýp IV MRSA MRSA SCCmec tuýp IV MRSA SCCmec tuýp IV S.aureus S.aureus S.aureus MRSA SCCmec Mã số PP nuôi cấy Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Test coagulase Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Xóm Chiếu, Q.4 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 + + + + + + + + + + + 35 Thịt heo Chợ Tân Định, Q.3 + 36 Thịt heo 37 Thịt heo Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 - 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Cefoxitin 30µg S Multiplex RT PCR nuc mecA S S S S + + + + + + + + + + + + - R + + - - R S S S S S Multiplex RT PCR SCCmec SCCmec SCCmec I II III I II IV Kết tuýp I S.aureus - - - MRSA S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus - - + S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus MRSA SCCmec tuýp IV Mã số PP nuôi cấy Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Test coagulase Cefoxitin 30µg Multiplex RT PCR nuc mecA + + - Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Tân Định, Q.3 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Thiếc, Q.11 Chợ Hóc Mơn, HM Chợ Hóc Mơn, HM Chợ Hóc Mơn, HM Chợ Hóc Mơn, HM + + + + + R R S S + + + + + + + + 56 Thịt heo Chợ Hóc Mơn, HM + R + 57 Thịt heo Chợ Hóc Mơn, HM + R 58 Thịt heo 59 Thịt heo Chợ Hóc Mơn, HM Chợ Hóc Mơn, HM + + S S 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 S Multiplex RT PCR SCCmec SCCmec SCCmec I II III I II IV Kết S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus - - - + - - + + + - - + + + - MRSA MRSA S.aureus S.aureus MRSA SCCmec tuýp IV MRSA SCCmec tuýp IV S.aureus S.aureus Mã số 60 61 62 63 64 PP nuôi cấy Tên mẫu Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Địa điểm lấy mẫu Chợ Hóc Mơn, HM Chợ Hiệp Thành, Q.12 Chợ Hiệp Thành, Q.12 Chợ Hiệp Thành, Q.12 Chợ Hiệp Thành, Q.12 Test coagulase Cefoxitin 30µg + - S 65 Thịt heo Chợ Hiệp Thành, Q.12 + 66 67 68 69 Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Chợ Hiệp Thành, Q.12 Chợ Hiệp Thành, Q.12 Chợ Hiệp Thành, Q.12 Chợ Hiệp Thành, Q.12 70 Thịt heo Multiplex RT PCR nuc mecA + - - Multiplex RT PCR SCCmec SCCmec SCCmec I II III I II IV Kết S.aureus R + + - - + + + S S + + - Chợ Hiệp Thành, Q.12 + R + + - + - 71 Thịt heo Chợ Hiệp Thành, Q.12 + R + + - - + 72 Thịt heo 73 Thịt heo Chợ Gò Vấp, Q.GV Chợ Gò Vấp, Q.GV - - - 74 Thịt heo Chợ Gò Vấp, Q.GV + R + + + - + 75 Thịt heo Chợ Gò Vấp, Q.GV + R + + + - + MRSA SCCmec tuýp IV S.aureus S.aureus MRSA SCCmec tuýp III MRSA SCCmec tuýp IV MRSA SCCmec tuýp I MRSA SCCmec tuýp I Mã số PP nuôi cấy Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Test coagulase Cefoxitin 30µg Multiplex RT PCR nuc mecA - - 76 Thịt heo 77 Thịt heo Chợ Gò Vấp, Q.GV Chợ Gò Vấp, Q.GV - 78 Thịt heo Chợ Gò Vấp, Q.GV + R + + 79 80 81 82 Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Chợ Gò Vấp, Q.GV Chợ Gò Vấp, Q.GV Chợ Gò Vấp, Q.GV Chợ Phú Nhuận, Q.PN + + + + S S S S + + + + - 83 Thịt heo Chợ Phú Nhuận, Q.PN + R + 84 85 86 87 Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Chợ Phú Nhuận, Q.PN Chợ Phú Nhuận, Q.PN Chợ Phú Nhuận, Q.PN Chợ Phú Nhuận, Q.PN + + + + S S R R 88 Thịt heo Chợ Phú Nhuận, Q.PN + 89 90 91 92 Chợ Phú Nhuận, Q.PN Chợ Phú Nhuận, Q.PN Chợ Phú Nhuận, Q.PN Chợ An Khánh, Q.2 Chợ An Khánh, Q.2 Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo 93 Thịt heo Multiplex RT PCR SCCmec SCCmec SCCmec I II III I II IV Kết MRSA SCCmec tuýp I S.aureus S.aureus S.aureus S.aureus MRSA SCCmec tuýp IV S.aureus S.aureus MRSA MRSA MRSA SCCmec tuýp IV + - + + - - + + + + + + + - - - R + + - - + + + + - S R S + + + - + - - - - MRSA + S + + + - + MRSA SCCmec tuýp I Mã số PP nuôi cấy Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Test coagulase Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Thịt heo Chợ An Khánh, Q.2 Chợ An Khánh, Q.2 Chợ An Khánh, Q.2 Chợ An Khánh, Q.2 Chợ An Khánh, Q.2 Chợ An Khánh, Q.2 + + + - 100 Thịt heo Chợ An Khánh, Q.2 + 94 95 96 97 98 99 Cefoxitin 30µg S S S R Multiplex RT PCR nuc mecA + + + - - + + Multiplex RT PCR SCCmec SCCmec SCCmec I II III I II IV + - + Kết MRSA SCCmec tuýp I PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG GIOLITTI CANTONI BROTH GranuCultTM GIOLITTI-CANTONI BROTH theo ISO 6888 Enzymatic digest of casein 10 g/l Meat extract g/l Yeast extract g/l Lithium chloride g/l D(-)Mannitol 20 g/l Sodium chloride g/l Glycine 1,2 g/l Sodium pyruvate g/l Tween®80 g/l Nƣớc pH 250C 1L 6,9 ± Chất bổ sung theo EN ISO 6888-3 Potassium tellurite 0,11 g/l PHỤ LỤC THỰC NGHIỆM TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA S.aureus BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO ĐƢỜNG KÍNH VÕNG KHÁNG KHUẨN PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: VƢƠNG XUÂN VÂN Ngày, tháng, năm sinh: 22/08/1989 Nơi sinh: TP.Hồ Chí Minh Địa liên lạc: 232/21 Ngô Quyền, phƣờng 8, quận 10 QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO - Từ năm 2007 đến năm 2011: sinh viên trƣờng Đại học Công nghiệp TP.HCM, chuyên ngành Công nghệ sinh học - Từ năm 2013 đến nay: học viên Cao học ngành Công nghệ Sinh học trƣờng Đại học Bách khoa – ĐH Quốc gia HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC Từ 1/2012 đến nay: kiểm nghiệm viên Labo Vi sinh Thực phẩm nƣớc, Khoa Xét nghiệm Sinh học lâm sàng – Viện Pasteur TP.HCM ... thẩm định quy trình phát MRSA xác định yếu tố di truyền SCCmec tuýp I-IV mẫu thịt tƣơi sống kỹ thuật Multiplex Real-time PCR  Mục tiêu cụ thể - Xây dựng quy trình phát MRSA xác định yếu tố di truyền. .. TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình phát Staphylococcus aureus kháng methicilline (MRSA) xác định yếu tố di truyền SCCmec MRSA thịt tươi sống kỹ thuật Multiplex Realtime Polymerase Chain Reaction II... Reaction II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xây dựng quy trình phát MRSA xác định yếu tố di truyền SCCmec tuýp IIV mẫu thịt tươi sống kỹ thuật Multiplex Real-time PCR - Thẩm định quy trình xây dựng so sánh với