LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) nghiên cứu sàng lọc squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở việt nam

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn tốt nghiệp này, Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Diễm Hồng – Trưởng phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo kiện, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi mong muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, thầy cô giáo tham gia giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Bên cạnh đó, tơi nhận ủng hộ nhiệt tình ý kiến đóng góp quý báu tất Anh/Chị Bạn đồng nghiệp Phịng Cơng nghệ Tảo Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn đến người Mẹ tơi, đến gia đình người thân Bạn bè bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng Học viên cao học năm LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung squalene 1.1.1 Nguồn gốc squalene 1.1.2 Cấu trúc squalene 1.1.3 Tính chất hóa học squalene 1.1.4 Con đường sinh tổng hợp cholesterol 1.2 Vai trò squalene 1.2.1 Squalene tác nhân chống lão hóa 1.2.2 Vai trò squalene sức khỏe người 1.2.2.1 Trong điều trị ngăn ngừa bệnh ung thư 1.2.2.2 Vai trò squalene giải độc 11 1.2.2.3 Đối với bệnh khác 11 1.2.3 Vai trị squalene cơng nghiệp mỹ phẩm 12 1.2.4 Vai trò squalene ngành công nghiệp khác .14 1.3 Các nguồn khai thác squalene 14 1.4 Nghiên cứu khai thác squalene từ vi tảo giới 18 1.5 Một số hướng nghiên cứu squalene giới 20 1.6 Nghiên cứu nước squalene 21 1.7 Một số giới thiệu chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium Việt Nam 22 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 25 2.1.1 Chủng tảo điều kiện nuôi cấy 25 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị 26 2.2 Phương pháp .27 2.2.1 Xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào 27 2.2.2 Xác định hình thái kích thước tế bào kính hiển vi quang học 27 2.2.3 Xác định sinh trưởng qua sinh khối khô 28 2.2.4 Phương pháp nhuộn lipid Nile red 28 2.2.5 Tách chiết lipit 29 2.2.6 Định lượng squalene phương pháp so màu 29 2.2.7 Tách chiết tinh squalene thô .30 2.2.7.1 Tách chiết squalene thô 30 2.2.7.2 Tinh squalene thô 31 2.2.8 Xác định squalene phương pháp sắc kí lớp mỏng 31 2.2.9 Tinh squalene phương pháp sắc kí cột 32 2.2.10 Xác định squalene sắc ký lỏng cao áp 32 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng dị dưỡng làm nguyên liệu cho tách chiết squalene .33 3.2 Sàng lọc nhanh chủng vi tảo có tiềm sản xuất squalene cao 36 3.2.1 Phát nhanh lipit nội bào nhuộm Nile Red 36 3.2.2 Phân tích lipit tổng số loài vi tảo biển sử dụng nghiên cứu 38 3.2.3 Xác định hàm lượng squalene sinh khối tảo phương pháp so màu 38 3.2.4 Xác định hàm lượng squalene sinh khối bình lên men 30 lít sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng cao áp 43 3.2.4 Tách chiết lipit khơng xà phịng hóa từ lipit tổng số 43 3.2.4.2.Xác định squalene sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng cao áp 43 3.2.4.3 Sử dụng phương pháp sắc ký mỏng (TLC) - nhỏ để sàng lọc nhanh chóng chủng vi tảo biển chứa hàm lượng squalene cao 47 3.3 Tinh squalene phương pháp sắc kí cột 48 3.3.1 Xác định squalene phương pháp sắc ký lớp mỏng 48 3.3.2 Phân tách tinh squalene sắc ký cột silicagel .49 3.4 Quy trình tách chiết squalene từ sinh khối tảo dị dưỡng S mangrovei PQ6 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .55 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Từ viết tắt Viết đầy đủ Cs Cộng DHA Docosahexaenoic Acid (C22: 6n-3) EPA Eicosapentaenoic Acid (C20:5n-3) GC Gas chromatography (sắc ký khí) GC-MS Gas chromatography mass spectrometry GOT Glutamatoxaloacetat transaminase GPT Glutamate pyruvate transaminase HCB Hexan chloro benzene HPLC High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng cao áp) 10 HMG-C Hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A 11 LDL-C Low Density Lipoprotein –Cholesterol (lipoprotein tỷ trọng thấp gắn với cholesterol) 12 MJA Methyl jasmonate 13 PFAD Palm fatty acid distillate 14 Ras Rat sarcoma 15 Rf Retention factor 16 SKK Sinh khối khô 17 SKT Sinh khối tươi 18 TLC Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) 19 TBFN Terbinafine 20 VTB Vi tảo biển i Nguyễn Cẩm Hà - K16 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các thơng số lý hóa squalene Bảng 1.2 Thành phần bã nhờn người 13 Bảng 1.3 Hàm lượng squalene loại dầu 16 Bảng 3.1 Danh sách loài vi tảo biển quang tự dưỡng, loài dị dưỡng điều kiện ni cấy chúng điều kiện phịng thí nghiệm 34 Bảng 3.2 Hàm lượng lipit số loài VTB sử dụng nghiên cứu 38 Bảng 3.3 Hàm lượng squalene loài vi tảo biển nghiên cứu 41 Bảng 3.4 Hàm lượng squalene chủng PQ6 phân tích TLC HPLC.46 Nguyễn Cẩm Hà - K16 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học squalene (C30H50) Hình 1.2 Squalene synthase đường sinh tổng hợp cholesterol Hình 1.3 Mặt cắt tuyến bã nhờn da người 13 Hình 1.4 Hình thái tế bào Schizochytrium 23 Hình 3.1 Hình thái tế bào loài vi tảo biển quang tự dưỡng chụp kính hiển vi quang học .34 Hình 3.2 Hình chụp khuẩn lạc tế bào chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 (A) Thraustochytrium striatum (B) .35 Hình 3.3 Hệ thống ni trồng loài vi tảo biển quang tự dưỡng quy mơ bình từ 250 mL đến bình 10 lít 35 Hình 3.4 Hình ảnh minh họa ni trồng chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 36 Hình 3.5 Ảnh chụp tế bào kính hiển vi quang học (A) kính hiển vi huỳnh quang sau nhuộm Nile Red (B) chủng vi tảo quang tự dưỡng chủng vi tảo dị dưỡng với độ phóng đại 1500 lần 37 Hình 3.6 Ảnh minh họa cho giai đoạn khác phản ứng tạo màu squalene chuẩn (1, 2, 3, 4, 5, tương ứng với nồng độ 0,01; 0,04; 0,05; 0,06; 0,08; 0,10 mg) phương pháp xác định squalene so màu 39 Hình 3.7 Ảnh minh họa trình xác định hàm lượng squalene lồi tảo quang tự dưỡng dị dưỡng phương pháp so màu .40 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hàm lượng squalene chuẩn OD400 40 Hình 3.9 Ảnh minh họa cho q trình phân tách lipit khơng xà phịng hóa từ lipit tổng số .43 Hình 3.10 Sắc ký lớp mỏng mẫu lipit khơng xà phịng hóa tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 44 Hình 3.11 Đường chuẩn mối tương quan hàm lượng squalene diện tích peak 45 Hình 3.12 Sắc ký đồ squalene chuẩn xác định sắc ký lớp mỏng TLC HPLC 45 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu PQ6 squalene phân tách sắc ký lớp mỏng xác định HPLC .46 Hình 3.14 Áp dụng phương pháp TLC (bản nhôm, nhỏ) để sàng lọc nhanh chủng vi tảo biển có hàm lượng squalene cao Đường 0- saqualene chuẩn 47 Hình 3.15 Sắc ký lớp mỏng xác định squalene từ mẫu chuẩn mẫu lipit khơng xà phịng hóa chủng PQ6 với hệ dung mơi chạy khác 49 Hình 3.16 Ảnh minh họa cho q trình tinh squalene từ lipit khơng xà phịng hóa49 Hình 3.17 Sắc ký lớp mỏng (A) sắc ký đồ (B) mẫu squalene từ chủng PQ6 sau tinh qua cột silicagel 50 Hình 3.18 Tách lipit tổng số từ sinh khối chủng PQ6 51 Hình 3.19 Tách squalene thô từ lipit tổng số chủng PQ6 52 Hình 3.20 Tinh squalene thô từ lipit tổng số 53 Bổ sung 400ml hh dd hóa chất methanol: acetone tỉ lệ 7:3 (v/v), vontex hỗn hợp phút Hỗn hợp Thu lớp Để hỗn hợp tủ - 20 C, 40h, thấy phân thành lớp Li tâm hợp 4000 vịng/phút, 10 phút Bã sinh khối Bổ sung 100ml hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: aceton tỉ lệ 7:3 (v/v) lạnh Rửa lần Thu lớp Li tâm hôn hợp 4000 vòng/phút, 10 phút Bã sinh khối Làm bay Cất quay 70 C Methanol, aceton Squalene thơ Hình 3.19 Tách squalene thơ từ lipit tổng số chủng PQ6 Bã sinh khối 5g squalene thô Bổ sung 200ml hexane: methanol Hỗn hợp tỉ lệ 2:1 (v/v), vontex hh phút hợp phút Lớp dƣới Lặp lại lần Lớp dƣới Để lắng hỗn hợp 10phút, phân thành lớp Voltex, để lắng hỗn hợp Lớp 10 phút, thấy phân thành lớp Voltex, đ hợp 10 phút, t Lớp Lớp dƣới Lớp Phân tích squalene phương HPLC chứaLớp Phânnhiều tích squalene Lớppháp dướiTLC methanol squalene hexen chứa squalenebằng p Hình 3.20 Tinh squalene thô từ lipit tổng số Một số nguyên nhân đưa để giải thích cho chênh lệch hàm lượng squalene sinh khối chủng S mangrovei PQ6 theo phương pháp so màu so với phương pháp TLC, HPLC sau: Ở phương pháp chạy sắc kí cần phải qua bước phân tách thành lipit khơng xà phịng hóa từ lipit tổng số Sau mẫu lipit khơng xà phịng hóa sử dụng để chạy TLC nhằm tách squalene khỏi thành phần khác lipit, phần silicagel chứa squalene lúc sử dụng để xác định hàm lượng HPLC Sau nhiều bước tách chiết tinh khơng tránh khỏi thất dẫn đến việc giảm hàm lượng squalene Trong đó, phương pháp so màu, bên cạnh squalene thành phần khác lipit lanosterol ergosterol cho phản ứng màu dương tính, vậy, kết tính tốn bao gồm squalene sterol khác (Bhattacharjee et al., 2001) (10) nên hàm lượng squalene xác định theo phương pháp so màu cao so với giá trị thực có squalene xác định phương pháp khác Nakazawa et al., (2012) [64] xác định hàm lượng squalene số chủng tảo phương pháp TLC kết hợp sắc ký khí (GC), tương tự phương pháp Kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng squalene chủng Aurantiochytrium limacinum 9F-4a, 4W-1b, 18W-13a chủng Schizochytrium limacinum SR21 đạt 0,6; 0,5; 171,1 0,2 mg/g SKK, tương ứng Cũng theo công bố Yue Jiang (2009) hàm lượng squalene đạt 1,17 mg/g sinh khối khô tảo sau bổ sung methyl jasmonate (MJA) thời điểm 48 nuôi chủng S mangrovei [96] Như vậy, hàm lượng squalene chủng S mangrovei nghiên cứu (33,134 mg/g SKK) cao so với chủng Yue Jiang (2009) công bố Dựa kết nghiên cứu tác giả nêu cho thấy q trình sinh tổng hợp squalene tăng cường việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhiệt độ, nồng độ glucose, tuổi tế bào hoăc điều kiện có bổ sung số chất ức chế trình tổng hợp squalene MJA, terbinafine (TBNF) lên sinh trưởng tích lũy squalene chủng VTB khác Vì vậy, để sản xuất squalene từ chủng S mangrovei PQ6 chúng tơi cần phải có nghiên cứu tiếp tục theo hướng tối ưu hóa điều kiện ni trồng chúng ảnh hưởng nhiệt độ, nồng độ glucose thời gian nuôi cấy ảnh hưởng số chất ức chế tổng hợp squalene methyl jasmonate, terbinafine… lên sinh trưởng tích lũy squalene chủng PQ6 để thu sinh khối tảo cao, vừa có khả sản xuất squalene cao quy mơ bình lên men 30 lít 150 lít Do vậy, nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng squalene sinh khối loài vi tảo cần thiết chúng tơi cơng bố cơng trình KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu trình bày phần trên, xin rút số kết luận sau: - Lựa chọn phương pháp so màu nhanh, rẻ tiền để xác định hàm lượng squalene sinh khối tảo điều kiện Việt Nam; hàm lượng squalene chủng vi tảo biển quang tự dưỡng gồm Nannochloropsis oculata, Chlorella vulgaris, Tetraselmis convolutae, Isochrysis galbana, Dunaliella teriolecta loài dị dưỡng (Thraustochytrium striatum Schizochytrium mangrovei) dao động từ 0,193-122 mg/g sinh khối khô; - Chọn loài vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 tập đồn giống phịng Cơng nghệ Tảo có tiềm cho việc sản xuất lượng lớn squalene (122 mg/g sinh khối khô xác định theo phương pháp so màu); - Có phương pháp sàng lọc nhanh chủng tiềm cho sản xuất squalene phương pháp so màu sắc ký mỏng TLC với kích thước nhỏ có sử dụng chất chuẩn - Đã tiến hành phân tách, làm xác định hàm lượng squalene thành phần lipit khơng xà phịng hóa sinh khối chủng PQ6 phương pháp sắc kí mỏng sắc kí lỏng cao áp - Hàm lượng squalene xác định theo TLC HPLC chủng PQ6 đạt 33,134 mg/g sinh khối khô sản lượng squalene đạt 0,992 g/L ni trồng bình lên men 30 Lít KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thu chúng tơi xin có số kiến nghị cho nghiên cứu sau: Cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu cho thu nhận sinh khối chủng S mangrovei PQ6 có sinh khối cao hàm lượng squalene cao như: ảnh hưởng nồng độ glucose; nhiệt độ; thời gian ni cấy; tuổi tế bào có mặt số chất ức chế tổng hợp squalene… TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Diễm Hồng cs., (2011) Báo cáo tổng kết đề tài “Xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng Việt Nam ni sinh khối số lồi tảo dị dưỡng làm thức ăn nuôi trồng thủy sản” đề tài cấp Nhà nước thuộc chương trình Cơng nghệ sinh học nuôi trồng thủy sản năm 2008-2010 Bộ NN-PTNT quản lý Hoàng Lan Anh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng., (2009) Đánh giá hiệu sử dụng sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 việc làm giàu Luân trùng (Brachionus plicatilis) Artemia nauplii Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc sinh học biển phát triển bền vững Nhà xuất KHTN CN, Hà Nội, 27-28/11/2009 Trang 413-421 Hoang Thi Lan Anh., (2014) Luận án Tiến sỹ sinh học 150 trang Ngơ Thị Hồi Thu, Hoàng Thị Lan Anh, Đặng Diễm Hồng., (2010) Đánh giá hiệu sử dụng sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 làm thức ăn cho tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) Tạp chí sinh học 32(4): 83-88 Tiếng Anh Ab Gapor M.D., Top., Leong L.W., Ong A.S.H., Kawada T., Watanabe H., Tsuchiya N., (1999) Production of high concentration tocopherols and tocotrienols from palm oil by-products Malaysian patent No my-11079-A Aki T., Hachida K., Yoshinaga M., Katai Y., Yamasaki T., Kawamoto S., Kakizono T., Maoka T., Shigeta S., Suzuki O., Ono K (2003) Thraustochytrids as a potential source of carotenoids J Am Oil Chem Soc 80: 789-794 Alvaro L Ronco., Eduardo De Stéfani., (2013) Squalene: a multi-task link in the crossroads of cancer and aging, Functional Foods in Health and Disease, 3(12): 462-476 Barnett G., (1972) Emollient creams and lotions In comestic, Science and Techno-logy (Balsam, M S and Sagaran, E eds.) Second edition, Vol.1 Wiley-Interscience, p.27-104 Beanerjee A, Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.C., (2002) Botryococcus braunii - A renewable source of hydrocacbons and other chemicals Crit Rev Biotechnol 22: 245-279 10 Bhattacharjee P., Shukla V.B., Singhal R.S., and Kulkarni P.R., (2001) Studies on fermentative production of squalene World Journal of Microbiology & Biotechnology 17: 811-816 11 Bhattacharjee P., R.S Singhal., (2003) Extraction of squalene from yeast by supercritical carbon dioxide World Journal of Microbiology & Biotechnology 19: 605–608 12 Blasco L., Duracher L , Forestier J.P., (2006) Skin constituents as cosmetic ingredients: part I: a study of bio-mimetic monoglycerides behavior at the squalene-water interface by the "pendant drop"method in a static mode J Dispers Sci Technol 27: 799-810 13 Bligh E.G., Dyer W.J., (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol 37: 911-917 14 Bordier C.G., Sellier N., Foucault A.P., Goffic F.L., Le, Goffic F., (1996) Purification and characterization of deep sea shark Centrophorus squamosusliver oil 1-O- alkylglycerol ether lipids Lipids 31 (5): 521-528 15 Busquets A., Kein V., Closa M., del Arco A., Boronat A., Arro M., Ferrer A., (2008) Arabidopsis thaliana contain a single gene encoding squalene synthase Plant Mol Biol, 67: 25-36 16 Chang M.H., Kim H.J., Jahng K.Y., Hong S.C., (2008) The isolation and chacracteration of Pseudozyma sp JCC 207, a novel producer of squalene Appl Microbiol Biotechnol 78: 963-972 17 Chen F., (1996) High cell density culture of microalge in hetero-trophic growth Trends Biotechnol 14: 421-426 18 Chen G., Fan K.W., Lu F.P., Li Q., Aki T., Chen F., Jiang Y., (2010) Optimization of nitrogen source for enhanced production of squalene from thraustochytrids Aurantiochytrium sp N Biotechnol, 27(4): 382-9 19 Christian M., (1982) Final report on the safety assessment of squalane and squalene J Am Coll Toxicol, (2): 37–56 20 Cooksey K.E., Guckert J.B., Williams S.A., Callis P.R., (1987) Fluorometric determination of the neutral lipid-content of microalgal cells using nile red J Microbiol Meth 6: 333–345 21 Cutler R.G., (2005) Oxidative stress profiling: part I Its potential importance in the optimization of human health Ann N Y Acad Sci 1055: 93-13 22 Dang Diem Hong., Hoang Thi Lan Anh., Ngo Thi Hoai Thu., (2011) Study on biological characteristics of heterotrophic marine microalga – Schizochytrium mangrovei PQ6 isolated from Phu Quoc Island, Kien Giang province, Vietnam J of Phycology 47 (4): 944-954 23 Dang Diem Hong, Dinh Thi Ngoc Mai, Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Bui Dinh Lam, Luu Thi Tam, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu., (2013) Biodiesel production from Vietnam heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6 J of Bioscience and Bioengineering 116 (2): 180-1185 24 Das B., (2000) The science behind Squalene (The Human Antioxidant) ICBR Publishers, Toronto 25 Das B., Yeger H., Baruchel H., Freedman M.H., Koren G., Baruchel S., (2003) In vitro cytoprotective activity of squalene on a bone marrow versus neuroblastoma model of cisplatin-induced toxicity: implications in cancer chemotherapy Eur J Cancer 39: 2556-2565 26 Desai KN, Wei H, Lamartiniere C.A., (1996) The preventive and therapeutic potential of thesqualene-containing compound, Roidex, on tumor promotion and regression Cancer Lett 19: 93-96 27 Dessi M.A., Deiana M., Day B.W., Rosa A., Banni S., Corongiu F.P., (2002) Oxidative stability of polyunsaturated fatty acids: effect of squalene Eur J Lipid Sci Tech 104(8): 506-512 28 Do R, Kiss RS, Gaudet D, Engert JC, (2009) Squalene synthase: a critical enzyme in the cholesterol biosynthesis pathway Clin Genet, 75 (1): 19-29 29 Elsey D., Jameson D., Raleigh B., Cooney M.J (2007) Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids J Microbiol Meth 68: 639–642 30 Fan K.W., Chen F., (2007) Production of high – value products by the marine microalgae thraustochytrids In: Yang ST (ed) Bioprocessing for valueadded products from renewable resources: new technologies and applications: 293-323 31 Fan K.W., Aki T., Chen F., (2010) Enhanced production of squalene in the thraustochytrid Aurantiochytrium mangrovei by medium optimization and treatment with terbinafine World J Microbiol Biotechnol 26: 1303-1309 32 Formaron-Bonnefond C., Demaretz V., Rosenfeld E., Salmon J.M., (2002) Oxygen addition and sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae during enological fermentation J Biosci Bioeng 93: 176- 182 33 Gapor M.T., Hazrina A.R., (2000) Squalene in oils and fats Palm Oil Developments 32: 36-40 34 Gershbein L.L., Sing E.J., (1969) Hydrocarbons of dogfish and cod livers and herring oil J Am Oil Chem Soc 46: 554–557 35 Goldstein J.L., Brown M.S., (1984) Progress in understanding the LDL receptor and HMG-CoA reductase, two membrane proteins that regulate the plasma cholesterol J Lipid Res 25:1450-1461 36 Han-Ping He, Yizong zcai, Mei Sun, Harold Corke, (2002) Extraction and purification of squalene from Amaranthus Grain J Agric Food Chem 50: 368-372 37 Hata S., Sanmiya K., Kouchi H., Matsuoka M., Yamanoto N., Izui K., (1997) cDNA cloning of squalene synthase genes from mono and dicotyledonous plants, and expression of the gene in rice Plant Cell Physiol 38: 1409-1413 38 Hauß T., Dante S., Dencher N.A., Haines T.H., (2002) Squalane is in the midplane of the lipid bilayer: implications for its function as a proton permeability barrier Biochim Biophys Acta 1556(2-3):149-154 39 Heilbron I.M., Kamm E.D., Owens W.M., (1926) The unsaponifiable matter from the oils of elasmobranch fish Part I A contribution to the study of the constitution of squalene (spinacene) J Chem Soc, 1630-1644 40 Heller J.H., Pasternak V.Z., Ranson J.P., Heller M.S., (1963) A new reticulo-endothelial stimulating agent from shark livers Nature (London), 199:904-905 41 Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu and Dang Diem Hong., (2010) Isolation and screening of Schizochytrium microalgae from Vietnamese coasts for polyunsaturated fatty acid production Journal of Science and Technology in the Tropics Volume p: 179-184 42 Honda D., Yokochi T., Nakahara T., Erata M., Higashihara T., (1998) Schizochytrium limacinum sp nov., a new thraustochytrid from a mangrove area in the west Pacific Ocean Mycol Res 102:439-448 43 Howard G M and Poucher W A., (1974) Perfumes, cosmetic and soaps In the Raw Materials of Perfumery, Volume I Chapman and Hall Ltd., p 344 44 Jara A.D.L., Mendoza H., Martel A., Molina C., (2003) Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii J Appl Phycol 15: 433-438 45 Jiang Y., Fan KW, Wong RTY., (2004) Fatty acids composition and squalene content of the marine microalga Schizochytrium mangrovei J Agric Food Chem 52: 1196-1200 46 Kamimura H., Koga N., Oguri K., Yoshimura H., (1992) Enhanced elimination of theophylline, phenobarbital and strychnine from the bodies ofrats and mice by squalene treatment J Pharmacobiodyn 15:215-221 47 Katan M.B., Zock P.L., Mensink R.P., (1995) Dietary oils, serum lipoproteins, and coronary heart disease Am J Clin Nutr, 61:1368S-1373S 48 Kelly G.S (1999) Squalene and its potential clinical uses Altern Med Rev 4: 29-36 49 Kennedy M.A., Bard M., (2001) Positive and negativeregulation of squalene synthase (erg9), an ergosterol biosynthetic gene, in Saccharomyces cerevisiae Biochem Biophys Acta 1517: 177-189 50 Kim YS., Cho J H., Park S., Han YJ., Back K., Choi Yong-Eui., (2011) Gene regulation patterns in triterpene biosynthetic pathway driven by overexpression of squalene synthase and methyl jasmonate elicitation in Bupleurum falcatum Planta 233: 343-355 51 Ko T.F., Weng Y.M., Chiou R.Y.Y., (2002) Squalene content and antioxidant activity of Treminalia catappa leaves and seeds J Agric Food Chem 50:5343-5348 52 Kohno Y., Ragawa Y., Itoh S., Nagaoka S., Takahashi M., Makai K., (1995) Kinetic study of quenching reaction of singlet oxygen and scavenging reaction of free radical by squalene in n-butanol Biochim Biophys Acta 1256:52-56 53 Langdon R.G., Bloch K., (1953) The utilization of squalene in the biosynthesis of cholesterol J Biol Chem 200(1):135-144 54 Lee S.J., Yoon B.D., Oh H.M., (1998) Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii Biotechnol Technique 12: 553–556 55 Lewis T.E., Nichols P.D., McMeekin T.A., (2001) Sterol and squalene content of a docosahexaenoic acid producing thraustochytrid: influence of culture age, temperature and dissolved oxygen Mar Biotechnol 3: 439-447 56 Li Q., Chen G.Q., Fan K.W., Lu F.P., Aki T., (2009) Screening and characterization of squalene-producing Thraustochytrids from Hong Kong mangroves Agric.Food Chem 57: 4267-4272 57 Liu Y., Xu X., Bi D., Wang X., Zhang X., Dai H., Chen S., Zhang W., (2009) Influence of squalene feeding on plasma leptin, testosterone & blood pressure in rats Indian J Med Res 129 (2): 150-153 58 López-Miranda J., Pérez-Jiménez F., Ros E et al., (2010) Olive oil and health: summary of the II international conference on olive oil and health consensus report, Jắn and Córdoba (Spain) 2008 Nutr Metab Cardiovasc Dis 20(4):284-294 59 Lu H.T., Jiang Y., Chen F., (2003) Preparative separation and purification of squalene from the microalga Thraustochytrium ATCC 26185 by high – speed counter – current chromatography Journal of Chromatography A 994 (1-2): 37-43 60 Luying Z., Xuecheng Z., Xueying R., and Qinghua, Z., (2008) Effects of culture conditions on growth and docosahexaenoic acid production from Schizochytrium limacinum J Ocean Univ Chin 7(1): 83–88 61 MacKenna R.M.B., Wheatley V.R., Wormall A., (1950) The composition of surface skin fat (sebum) from the human forearm J Invest Dermatol, 15:33-47 62 Moss S.T., (1986) Biology and phylogeny of the Labyrinthulales and Thraustochytriales, in Biology of marine fungi, edited by S T Moss, (Cambridge University, Cambridge):105-129 63 Nakazawa A., Kokubun Y., Matsuura H., Yonezawa N., Kose R., Yoshida M., Tanabe Y., Kusuda E., Thang D.V., Ueda M., Honda D., Mahakhant A., Kaya K., Watanabe M.M., (2013) TLC screening of thraustochytrid strains for squalene production J Appl Phycol DOI 10.1007/s 10811-01300880-x 64 Nakazawa A., Matsuura H., Kose R., Kato S., Honda D., Inouye I., Kaya K., Watanabe M.M., (2012) Optimization of culture of the thraustochytrid Aurantiochytrium sp Strain 18w-13a for squalene production Bioresource Technology 109:287-291 65 Navarro V., Zabala A., Gómez S., Portillo M., (2009) Metabolismo del colesterol: bases actualizadas Rev Esp Obes, 7(6): 360-384 66 Ohkuma T., Otagiri K., Tanaka S., Ikekawa T., (1983) Intensification of host’s immunity by squalene in sarcoma 180 bearing ICR mice J Pharmacobiodyn 6:148-151 67 O'Keefe J.H., Bell D.S., (2007) Postprandial hyperglycemia/hyperlipidemia (postprandial dysmetabolism) is a cardiovascular risk factor Am J Cardiol 100(5):899-904 68 Ortega R.M., (2006) Importance of functional foods in the Mediterranean diet Public Health Nutr (8A):1136-1140 69 Owen R.V., Giacosa A., Hull E.W., Haubner R., Wurtele G., Spiegelhalder B., Bartsch H., (2000) Olive oil consumption and health: the possible role of antioxidants Lancet Oncol 1:107–112 70 Passi S., De Pità O., Puddu P., Littarru G.P., (2002) Lipophilic antioxidants in human sebum and aging Free Radic Res 36: 471-477 71 Peyronel D., Artaud J., Latrides M.C., Rancurel P., Chevalier J.L., (1984) Fatty acid and squalene compositions of Mediterranean Centrophorus spp egg and liver oils in relation to age Lipids, 19 (9), 643±648 72 Posada L.R., Shi J., Kakuda Y., and Xue S.J., (2007) Extraction of tocotrienols from palm fatty acid distillates using molecular distillation Journal of Separation and Purification Technology, 57: 220-229 73 Pragst F., Auwärter V., Kiessling B., Dyes C., ( 2004) Wipe-test and patch-test for alcohol misuse based on the concentration ratio of fatty acid ethyl esters and squalene CFAEE/CSQ in skin surface lipids Forensic Sci Int, 143: 77-86 74 Richter E., Fichtl B., Schafer S.G., (1982) Effects of dietary paraffin, squalane and sucrose polyester on residue disposition and elimination of hexachlorobenzene in rats Chem Biol Interact 40: 335-344 75 Rhahukumar S., (1988) Schizochytrium mangrovei sp nov.: a thraustochytrid from mangroves in India Trans Brit Mycol Soc 90:627-631 76 Raghukumar S., (2002) Ecology of the marine protists, the labyrinthulomycetes (Thraustochytrids and Labyrinthulids) Eur J Protistol 38: 127–45 77 Richter E., Schafer S.G., (1982) Effect of squalane on hexachlorobenzene (HCB) concentrations in tissues of mice J Environ Sci Health 17:195-203 78 Robinson R., (1934) Structure of cholesterol J Soc Chem Ind 53:1062 79 Rothblat G.H., Martak D.S., and Kritchevsky D., (1962) A quantitative colorimetric assay for squalene Analytical Biochemistry 4: 52-56 80 Ryan E., Galvin K., Connor T.P., Maguire A.R., (2007) Phytsterol, squalene, tocopherol content and fatty acid profile of selected seeds, grains, and legumes Plant foods Hum Nutr 62: 85-91 81 Salvador M D., Aranda F., Go´mez-Alonso S., Fregapane G., (2003) Influence of extraction system, production year and area on Cornicabra virgin olive oil: a study of five crop seasons Food Chem 80:359-366 82 Schnetzler K A., and Breene W M., (1994) Food uses and amaranth product research: a comprehensive review In Amaranth: Biology, Chemistry, and Technology; Paredes-Lopez, O., Ed.; CRC Press: Boca Raton, FL 155-184 83 Senthilkumar S., Devaki T., Manohar B.M., Babu M.S., (2006) Effect of squalene oncyclophosphamide-induced toxicity Clin Chim Acta 364: 335-342 84 Smith T.J., Kim S., Lee M.J., Yang G.Y., Newmark H.L., Yang C.S., (1999) Inhibition of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NKK)induced lung tumorigenesis and DNA oxidation by dietary squalene Proc Am Assoc Cancer Res 40: 262 85 Sonntag N., (1979) Structure and composition of fat and oils In Bailey’s oil and fat products (ed Daniel Swern), New York, John Wiley and Sons pp, 1-99 86 Storelli M.M., Ceci E., Storelli A., Marcotrigiano G.O., (2003) Polychlorinated biphenyl, heavy metal and methylmercury residues in hammerhead sharks:contaminant status and assessment Mar Pollut Bull 46:1035-1039 87 Takao Y., Nagasaki K., Mise K., Okuno T., and Honda D., (2005) Isolation and Characterization of a Novel Single-Stranded RNA Virus Infectious to a (Thraustochytriaceae, Marine Fungoid Labyrinthulea) Protist, J Appl Schizochytrium And sp Environmental Microbiology 4516–4522 88 Tchen T.T., Bloch K., (1957) On the conversion of squalene to lanosterol in vitro J Biol Chem 226 (2): 921-930 th 89 Thurman H.V., (1988) Introductory Oceanography, Publishing Company, Columbus, OH, UsA Edn Merrill 90 Tsujimoto M., (1916) A highly unsaturated hydrocarbon in shark liver oil J Ind Eng Chem 8(10): 889-896 91 Turoczy N.J., Laurenson L.J., Allinson G., Nishikawa M., Lambert D.F., Smith C., Cottier J P., Irvine S.B., Stagnitti F., (2000) Obseration on metal concentration in three species of shark (Deania calcea, Centroscymmus crepdater, and Centroscymnus owstoni) from southeaster Australian water J Agric Food Chem 48: 4357-4364 92 Uchida H., Yamashita H., Kajikawa M., Ohyama K., Nakayachi O., Sugiyama R., -Yamato K.T., Muranaka T., Fukuzawa H., Takemura M., Ohyyama K., (2009) Cloning and characterization of a squalene synthase gene from a petroleum plant Euphorbia tirucalli L Planta 229: 1243-1252 93 Watanabe M.M., (2011) Hydrocarbon – producing algae: their potential as a th fossil-oil Abstract of the Asian Pacific Phycological Forum (APPF 2011): 94 Willett W.C., Sacks F., Trichopoulou A., Drescher G., Ferro-Luzzi A., Helsing E., Trichopoulos D., (1995) Mediterranean diet pyramid: a cultural model for healthy eating Am J Clin Nutr 1995, 61 (Suppl.6):1402S-1406S 95 Woodward R.B., Bloch K., (1953) The cyclization of squalene in cholesterol synthesis J Am Chem Soc 75:2023 96 Yue C.J., Jiang Y., (2009) Impact of methyl jasmonate on squalene biosynthesis in microalga Schizochytrium mangrovei Short communication Process Biochemistry 44 (8): 923-027 TÀI LIỆU TRANG WEB http://en.wikipedia.org/wiki/Squalene http://simple.wikipedia.org/wiki/Sebaceous_gland ... đề tài nghiên cứu ? ?Nghiên cứu sàng lọc squalene từ số chủng vi tảo biển phân lập Vi? ??t Nam? ?? nhằm cung cấp sở khoa học ban đầu hàm lượng squalene vi tảo biển Vi? ??t Nam, có phương pháp nghiên cứu phù... đồng từ nguồn tài nguyên thiên nhiên sẵn có nước có tảo, chúng tơi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu ? ?Nghiên cứu sàng lọc squalene từ số chủng vi tảo biển phân lập Vi? ??t Nam? ?? nhằm cung cấp sở... định squalene sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm số chủng tiềm cho vi? ??c nghiên cứu sâu theo định hướng sử dụng squalene làm thực phẩm chức dược phẩm tương lai Vi? ??t Nam Luận văn nghiên cứu có số