Nghiên cứu astaxanthin trong các chủng vi tảo Haematococcus phân lập ở Việt. Ngày nay, các hợp chất có khả năng chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên đang là mối quan tâm hàng đầu đối với các nhà khoa học bởi những ứng dụng của chúng trong phòng trừ bệnh tật, chống lão hóa… Trong rất nhiều nguồn các chất chống oxy hóa, các carotenoid là một nhóm hợp chất quan trọng, tồn tại phổ biến trong các cơ thể thực vật. Sau β-caroten, lycopen và lutein là các carotenoid đã được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rất lâu và phổ biến, astaxanthin cũng là một mối quan tâm mới bởi nó được phát hiện có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn β-aroten, lycopen, lutein hay vitamin E. Astaxanthin có thể ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư, làm giảm cholesterol máu, bảo vệ da khỏi tia cực tím, ngăn ngừa sự lão hóa da, thoái hóa điểm vàng… [2]
Nghiên cứu astaxanthin trong các chủng vi tảo Haematococcus phân lập ở Việt Nam Nguyễn Thị Hường 1 , Nguyễn Văn Mùi 1 , Nguyễn Thị Hoài Hà 2 1 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN 2 Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam MỞ ĐẦU Ngày nay, các hợp chất có khả năng chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên đang là mối quan tâm hàng đầu đối với các nhà khoa học bởi những ứng dụng của chúng trong phòng trừ bệnh tật, chống lão hóa… Trong rất nhiều nguồn các chất chống oxy hóa, các carotenoid là một nhóm hợp chất quan trọng, tồn tại phổ biến trong các cơ thể thực vật. Sau β-caroten, lycopen và lutein là các carotenoid đã được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rất lâu và phổ biến, astaxanthin cũng là một mối quan tâm mới bởi nó được phát hiện có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn β-aroten, lycopen, lutein hay vitamin E. Astaxanthin có thể ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư, làm giảm cholesterol máu, bảo vệ da khỏi tia cực tím, ngăn ngừa sự lão hóa da, thoái hóa điểm vàng… [2] Astaxanthin là sắc tố có màu hồng đỏ, được phát hiện nhiều trong các hồi, tôm, hồng hạc, chim cút… đặc biệt là các chủng vi tảo thuộc chi Haematococcus. Haematococcus là một loại tảo lục phân bố phổ biến trên thế giới, sống trong môi trường khôn đòi hỏi dinh dưỡng cao, dễ dàng nuôi cấy. Và khi gặp điều kiện bất lợi, chúng có thể dễ dàng chuyển sang dạng bào tử nang để chống chọi với điều kiện khắc nhiệt, và đây cũng là giai đoạn tổng hợp nhiều astaxanthin [1,4]. Astaxanthin từ Haematococcus đã được thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ rất lâu, chúng được sử dụng làm chất phụ da tạo màu cho các sản phẩm nông nghiệp, làm thức ăn cho cá hồi và gia cầm… và ở Việt Nam astaxanthin cũng đã bắt đầu được quan tâm phục vụ cho đời sống, nông nghiệp cũng như sinh y dược. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 1. Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi tảo thuộc chi Haematococcus thu thập từ các vùng ngoại thành Hà Nội. Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tảo và Sinh học Môi trường, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2. Nguyên liệụ Các hóa chất có độ tinh khiết cao, thiết bị hiện đại, đồng bộ, đảm bảo cho tất cả các nghiên cứu hoàn toàn tin cậy. 3. Phƣơng pháp - Nuôi cấy thu sinh khối - Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi tảo chi Haematococcus + Phương pháp hình thái học + Xác định khả năng sinh trưởng + Phân tích thành phần các axit béo + Phương pháp định loài bằng sinh học phân tử - Chiết xuất sắc tố + Xác định hàm lượng sắc tố trên máy quang phổ - Các phương pháp sắc kí + sắc kí lớp mỏng silicagel + sắc kí lỏng cao áp KẾT QUẢ 1. Tuyển chọn các chủng vi tảo Haematococcus Có sự tuyển chọn các chủng vi tảo Haematococcus dựa vào đặc tính dễ bị cảm ứng theo cường độ ánh sáng dẫn đến nhanh chóng tạo bào tử nang từ đó dẫn đến tăng cường tổng hợp astaxanthin. Các chủng được cấy gạt trên môi trường có Bol3M. Nguồn sáng được chiếu với đèn huỳnh quang với cường độ 90μE/m 2 .s. Sau 5 ngày nuôi cấy quan sát sự chuyển màu của các khẩn lạc chúng tôi tuyển chọn được 5 loại cảm ứng với điều kiện tốt nhất. H1 H4 H7 H3 H8 Hình 1. Kết quả nuôi tuyển chọn các chủng có khả năng tổng hợp astaxanthin Chúng tôi tiến hành nuôi nhân 5 chủng trên trong điều kiện môi trường Bol3M. Sau 7 ngày kiểm tra tốc độ sinh trưởng bằng trọng lượng khô của tế bào. Cả 5 chủng đều có khả năng tổng hợp astaxanthin đạt từ 0,002-0,0046 mg/100ml. Đặc biệt là 2 chủng H1 và H7 tổng hợp astaxanthin với hàm lượng cao nhất là 0,0042 và 0,0046 mg/100ml, tiếp tục được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 1. Hàm lƣợng astaxanthin của các chủng phân lập STT Kí hiệu chủng Nguồn phân lập Hàm lượng astaxanthin mg/100ml OD 475 Sinh khối khô (mg/100ml) 1 H1 Ao nuôi vịt 0,0046 48,0 2 H7 Thân cây 0,0042 46,2 3 H3 Đầm vịt 0,0023 43,2 4 H4 Thành chậu hoa 0,0027 42,3 5 H8 Ống nước nuôi chim 0,0021 45,5 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 H1 H7 H3 H4 H8 C¸c chñng Sinh khèi kh« (mg/100ml) 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05 Hµm l-îng astaxanthin (mg/100ml) Sinh khèi kh« Hµm l-îng astaxanthin Hình 2. Sinh khối khô và hàm lƣợng astaxanthin của 5 chủng vi tảo tuyển chọn đƣợc 2. Kết quả sắc kí Bảng 2. Hàm lƣợng astaxanthin trong 2 chủng H1 và H7 STT Tên chủng Sinh khối khô (mg) Hàm lượng astaxanthin ( 0 / 00 ) 1 H1 200 0.143 2 H7 200 0.027 1 2 3 Hình 3. Sắc kí bản mỏng hai chủng H7 và H1 Hình 4 sắc kí đồ astaxanthin chuẩn 1-chủng H7, 2-chủng H1, 3-astaxanthin chuẩn H1 Haematococcus pluvialis Haematococcus lacustris 100 Brachiomonas submarina 100 Chlorogonium euchlorum Chlorogonium capillatum Chlorogonium elongatum 67 67 100 Chlamydomonas dysosmos Chlamydomonas humicola Polytoma mirum Polytoma ellipticum 100 100 Dunaliella salina 99 Chlamydomonas tetragama 59 95 0.005 Kết quả ở hình 3 cho thấy chủng H1 và H7 đều xuất hiện băng tương đồng với băng astaxanthin chuẩn. Chúng tôi tiếp tục tiến hành phân tích hàm lượng astaxanthin trên sắc kí lỏng cao áp. Trên sắc kí đồ chúng tôi thấy rằng ở chủng H1 và H7 đều có pic gần bằng thời gian lưu của astaxanthin chuẩn. Từ bảng 2 chúng tôi thấy rằng chủng H1 có hàm lượng astaxanthin cao hơn hẳn chủng H7 do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học trên chủng H1 Hình 5A. Sắc kí đồ astaxanthin của chủng H1, 5B. astaxanthin của chủng H7 3. Đặc điểm sinh học của chủng H1 3.1. Phân loại chủng H1 theo hệ thống sinh học phân tử Hình 6. cây phả hệ của chủng H1 dựa trên phân tích, giải trình tự ANDr 18s và các loài có quan hệ họ hàng gần Để định danh chính xác chủng H1 thuộc loài nào trong chi Haematococcus chúng tôi tiến hành giải trình tự ANDr 18s bằng cặp mồi ITS1 và ITS4 trên hình 6 là cây phả hệ của chủng H1. Từ hình 6 ta nhận thấy H1 có độ tương đồng đạt 100% so với loài Haematococcus pluvialis có kí hiệu AF 159369 do vậy chúng ta có thể khẳng định được chủng H1 do chúng tôi tuyển chọn được thuộc loài Haematococcus pluvialis. Đây là loài không có độc tính được sử dụng để tổng hợp astaxanthin trên quy mô thương mại trên thế giới. 3.2. Thành phần axit béo chứa trong chủng H1 Bảng 3 cho ta thấy thành phần axit béo của chủng H1 có chứa axit linoleic có hàm lượng là 5,62 mg/l, và omega 6 có hàm lượng 29,34 mg/l. Đây là những axit béo rất quan trọng giúp các sinh vật tiêu hóa thức ăn dễ dàng. Bảng 3. Thành phân axit béo của chủng H1 STT Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng (mg/100ml) 1 Myristic acid (C 15 H 30 O 2 ) (C14:0) 2,39 2 Palmitoleic acid (C 17 H 32 O 2 ) (C16:1) 0,58 3 Palmitic acid (C 17 H 34 O 2 ) C16:0) 34,48 4 Linoleic acid (C 19 H 34 O 2 ) (C18:3n3) 5,62 5 Linoleic acid (C18:2n6) 29,34 6 Oleic acid (C18:1n9) 58,67 7 Stearic acid (C 19 H 38 O 2 ) (C18:0) 10,68 8 EPA (C20:5n3) KPH 9 Arachidic acid (C20:0) KPH 10 DHA (C22:6n3) KPH 11 Benhenic acid (C22:0) KPH KẾT LUẬN - Qua các bước tuyển chọn chúng tôi đã thu được 5 chủng Haematococcus kí hiệu là H1, H3, H4, H7, H8 có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin. - Trong 2 chủng H1 và H7 có khả năng dinh trưởng nhanh thì chủng H1 cho hàm lượng astaxanthin cao hơn 0,143‰/0,027‰. - Bằng phương pháp phân tích giải trình tự ADNr 18s chủng H1 đã được xác định thuộc loài Haematococcus pluvialis. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Boussiba, S. and A. Vonshak, Astaxanthin accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis, Plant Cell Physiol, New York, 32, 1991, pp. 1077-1082. 2 Guerin, M., Huntley, M.E. and Olaizola, M, Haematococcus astaxanthin applications for human health and nutrition. Trends Biotechnol, 21, 2003, pp. 210-216. 3 Kobayashi M, T. Okada, Protective role of astaxanthin against UV and irradiation in the green alga Haematococcus pluvialis, Biotechnology letters, 22, 2000, pp. 177-181. 4 Renstrom B., G. Borch, O. Skulberg, and S. Liaaen-Jensen, Optical purity of (3S, 3'S)- astaxanthin from Haematococcus pluvialis, Phychem, 20, 1981, pp. 2561-2564. SUMMARY Determining the astaxanthin content in Haematococcus isolated in Vietnam Nguyen Thi Huong 1 , Nguyen Van Mui 1 , Nguyen Thi Hoai Ha 2 1 Department of Biology, Hanoi University of Science, VNU, 1 institute of Microbiology and Biotechnology Astaxanthin, a naturally occurring carotenoid pigment, is known as a powerful biological antioxidant. Recently, it has been used for application in fish aquaculture, pharmaceutical and cosmetic industries. And in Vietnam, it is paid more attention, especial in fish aquaculture and pharmaceutical. Haematococcus pluvialis the richest natural source of astaxanthin is used widely all over the world. So in this report, we isolated Haematococcus in Vietnamto stady its astaxanthin content and bioactivities We got five strains Haematococcus H1, H3, H4, H7, H8 that can synthesize astaxanthin H1 and H7 are best strain with well growth ability and astaxanthin content of H1 is higher that of H7 (0,143‰/0,027‰). And H1 is one the strain of Haematococcus pluvialis. . Nghiên cứu astaxanthin trong các chủng vi tảo Haematococcus phân lập ở Vi t Nam Nguyễn Thị Hường 1 , Nguyễn Văn Mùi 1 , Nguyễn Thị Hoài. phát hiện nhiều trong các hồi, tôm, hồng hạc, chim cút… đặc biệt là các chủng vi tảo thuộc chi Haematococcus. Haematococcus là một loại tảo lục phân bố phổ biến trên thế giới, sống trong môi trường. cầm… và ở Vi t Nam astaxanthin cũng đã bắt đầu được quan tâm phục vụ cho đời sống, nông nghiệp cũng như sinh y dược. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 1. Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi tảo thuộc