Đề tài có các mục tiêu sau: Tạo kit multiplex PCR với 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23SrDNA chẩn đoán vi khuẩn lao phù hợp với điều kiện của Việt Nam; đánh giá hiệu quả của kit trên panel mẫu và trên các bệnh phẩm lâm sàng nghi lao.
MỞ ĐẦU Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và có khoảng 3 triệu người chết vì lao. Với tốc độ lây truyền nhanh và tỷ lệ tử vong cao như vậy, hiện nay bệnh lao được xếp vào một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất. Tuy nhiên theo ước tính tỷ lệ phát hiện bệnh chỉ đạt 37%. Như vậy số bệnh nhân mắc lao nhưng khơng được phát hiện và chữa trị kịp thời chiếm đến 63%, đây sẽ là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm sốt. Theo đánh giá của WHO Việt Nam là một quốc gia đang phát triển và có tỉ lệ nhiễm lao đứng thứ 12 trong số 22 nước có số bệnh nhân mắc lao cao nhất thế giới (WHO 2004). Tính riêng khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3, chỉ sau Trung Quốc và Philipine [2, 11, 74] Trước diễn biến nghiêm trọng đó, tổ chức Y tế Thế giới đã kêu gọi các quốc gia trên thế giới quan tâm đặc biệt đến phòng chống và kiểm sốt bệnh lao. Bệnh lao ngày càng trở nên nguy hiểm hơn, đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, vì vậy càng cần thiết trong việc phát hiện và điều trị sớm. Việc kiểm sốt bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn đốn nhanh và chính xác. Tuy nhiên việc chẩn đốn còn gặp rất nhiều khó khăn. Ở Việt Nam, phương pháp phổ biến nhuộm Ziehl Neelsen. Tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện ra trong trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, do vậy sẽ để sót nhiều bệnh nhân do kết quả âm tính giả. Phương pháp ni cấy vi khuẩn lao trên mơi trường LowensteinJensen được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đốn, tuy nhiên phải mất 4 đến 8 tuần ni cấy mới cho kết quả. Trên mơi trường ni cấy cải tiến MGIT, BACTEC cũng mất đến 2 tuần, do vậy rất khó đáp ứng u cầu giám sát và kiểm sốt bệnh lao [4, 19] Hiện nay, với sự phát triển của cơng nghệ sinh học chúng ta đã khắc phục được nhược điểm này. Việc áp dụng cơng nghệ sinh học phân tử trong chẩn đốn lao đã rút ngắn thời gian chẩn đốn xuống còn hai ngày. Phương pháp này có độ nhậy và độ đặc hiệu cao, cho phép phân biệt chính xác các lồi có khả năng gây bệnh lao cũng như phát hiện khả năng kháng thuốc thơng qua các gen đặc trưng. Hiện nay, một số cơ sở trong nước đã áp dụng sinh học phân tử trong chẩn đốn lao nhưng chủ yếu vẫn sử dụng các kít chẩn đốn cũ nhằm vào nhân đoạn IS6110, đây là trình tự đặc trưng của vi khuẩn lao [28, 34]. Tuy nhiên, gần đây một số nghiên cứu đã cơng bố tỷ lệ nhất định các chủng lao khơng chứa trình tự IS6110, đặc biệt là các chủng được tìm thấy ở Ấn Độ và Đơng Nam Á trong đó có Việt Nam [34, 72]. Vì vậy rất dễ bỏ sót các bệnh nhân có mang vi khuẩn lao khuyết IS6110. Do vậy cần thiết kế những loại primer mới để chẩn đốn lao ở Việt Nam một cách hiệu quả và chính xác. Theo một số nghiên cứu gần đây cho biết, ngồi đoạn gen IS6110 còn có một số gen đích khác như IS1081 và 23SrDNA có mặt tất cả các chủng lao gây bệnh. Do vậy khi sử dụng cùng lúc các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn IS6110, IS1081 và 23S rDNA sẽ rất thuận lợi trong việc phát hiện M. tuberculosis complex, tránh bỏ sót bệnh nhân [13] Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tơi đề xuất đề tài “ Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đốn nhanh các chủng vi khuẩn lao Việt Nam” nhằm chẩn đốn nhanh, chính xác vi khuẩn lao, góp phần kiểm sốt và nâng cao hiệu quả chẩn đốn lao. Đề tài có hai mục tiêu sau: Tạo kit multiplex PCR với 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23SrDNA chẩn đốn vi khuẩn lao phù hợp với điều kiện của Việt Nam Đánh giá hiệu quả của kit trên panel mẫu và trên các bệnh phẩm lâm sàng nghi lao. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế gới Lao là một bệnh truyền nhiễm mãn tính đã xuất hiện từ rất lâu. Hàng nghìn năm trơi qua, nó đã lây lan và giết chết hàng triệu người, số người chết vì bệnh lao còn lớn hơn cả do AIDS và sốt rét cộng lại Ngày nay, bệnh lao càng trở nên nghiêm trọng hơn do xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc, lao kháng thuốc phổ rộng và lao đồng nhiễm HIV/AIDS. Cùng với AIDS và sốt rét, lao đang được xếp vào một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất thế giới [2, 53]. Do tính chất có thể lây truyền qua tiếp xúc và qua khơng khí như các bệnh cúm nên tốc độ lan truyền rất nhanh và khả năng kiểm sốt bệnh lao rất phức tạp. Các kết quả thống kê lặp lại nhiều lần đã ước tính có khoảng 1/3 dân số thế giới (khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M. tuberculosis và 10% trong số đó sẽ phát triển thành bệnh tại một thời điểm nào đó trong đời Mỗi năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới được phát hiện, hiện tại hàng năm trên thế giới có khoảng trên 49 triệu bệnh nhân lao lưu hành, con số này đang ngày càng gia tăng. Bệnh lao giết chết 8000 người mỗi ngày, gần 3 triệu người mỗi năm [73]. Đáng báo động là hiện nay bệnh lao đã trở thành ngun nhân hàng đầu giết hại nhiều thanh thiếu niên và người lớn, chủ yếu là nhóm tuổi đang là nguồn lao động chính của xã hội (từ 20 tới 49 tuổi) [78] Số bệnh nhân lao những nước đang phát triển chiếm 95% trong tổng số bệnh nhân lao trên tồn thế giới. Khoảng 80% số bệnh nhân lao trên tồn thế giới tập trung vào 22 quốc gia có gánh nặng bệnh tật cao. Bệnh lao chiếm 25% ngun nhân gây tử vong ở các nước này. Tính riêng tại Ấn Độ, hàng năm có khoảng trên 500.000 người chết vì căn bệnh này, tương đương tỷ lệ cứ 1 phút lại có một người quốc gia này chết vì lao [63, 73]. Năm 2007, WHO ước tính rằng khu vực Đơng Nam Á có số người nhiễm lao chiếm tới 34% trên tồn thế giới. Còn ở cận Sahara châu Phi thì tỷ lệ này cao gấp đơi so với Đơng Nam Á, tỷ lệ nhiễm lao ở đây là 343 ca trên 100.000 người dân. Thơng báo gần đây nhất năm 2007 của tổ chức y tế thế giới cho biết bệnh lao được xác định bước đầu đã ổn định và giảm đi ở cả 6 vùng trên thế giới. Tuy nhiên số lượng các ca mới nhiễm trên tồn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở châu Phi, Đơng Địa Trung Hải và Đơng Nam Á Tình hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn khơng giảm nguy hại đối với lồi người. Hiện nay tỷ lệ điều trị lao thành cơng trên tồn cầu đạt 82%, tuy nhiên còn rất nhiều bệnh nhân chưa được phát hiện và khơng được chữa trị, những bệnh nhân này tiếp tục lây cho cộng đồng. Theo ước tính của WHO thì tỷ lệ phát hiện bệnh nhân mới chỉ đạt 37% trong tổng số người mới nhiễm lao [63]. Sự gia tăng của bệnh lao trên quy mơ tồn cầu cùng với mối liên quan với HIV và sự xuất hiện của chủng kháng thuốc đang là một vấn nạn về y tế cộng đồng. Điều này càng khiến cho bệnh lao trở nên khó khăn trong việc kiểm sốt và điều trị. Đến năm 1993 WHO phải tun bố tình trạng khẩn cấp về bệnh lao trên tồn cầu để kêu gọi các quốc gia trên thế giới chung tay phòng chống lao [64]. 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Theo báo cáo vào năm 2006 trong chương trình chống lao quốc gia thì Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 quốc gia có số bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Tại khu vực tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ 3 chỉ sau Trung Quốc và Philipine về tổng số bệnh nhân lao đang lưu hành và số bệnh nhân lao mới phát hiện. Bên cạnh sự gia tăng đáng lo ngại thì tình trạng lao kháng thuốc là một vấn đề cấp bách [2, 10, 53]. Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao tồn cầu, cơng tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình y tế Quốc gia trọng điểm. Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện ước tính đạt 82% số bệnh nhân. Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 10, 53]. Theo WHO thì Việt Nam là nước có gánh nặng bệnh lao cao trên tồn cầu với khoảng 44% dân số nhiễm lao. Tỷ lệ lao mới mắc các thể là 173/100.000 dân, tỷ lệ lao phổi AFB (+) mới là 77/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là 225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong do lao là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV trong các bệnh nhân lao mới là 5% [2], trên thực tế số liệu về nhiễm lao có thể cao hơn những con số thống kê ở trên. Vấn đề đồng nhiễm HIV và lao khơng chỉ làm tăng số bệnh nhân lao mà còn làm giảm hiệu quả điều trị bệnh, tăng tỷ lệ tử vong. Đó cũng chính là khó khăn, thách thức lớn đối với cơng tác phòng chống lao quốc gia. Đáng ngại là tỷ lệ lao kháng thuốc ở Việt Nam đang ngày càng gia tăng, tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân điều trị lại là 19%. Như vậy, mỗi ngày có gần 400 người mắc, trong đó có 178 người mắc lao phổi ho khạc ra vi khuẩn làm lây nhiễm cho cộng đồng và 55 người chết vì bệnh lao. Hiện nay, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% [2]. Thực tế hiện nay, tỷ lệ phát hiện chỉ đạt khoảng 44% và tỷ lệ chữa khỏi là 81% [2]. Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR vào chẩn đốn lao là một bước đột phá mang lại nhiều kết quả khả quan. Tuy vậy kĩ thuật này vẫn còn những điểm chưa thực sự hồn thiện và cần có những nghiên cứu bổ sung, cải tiến nhằm đem lại hiệu quả tối ưu. 1.2. VI KHUẨN LAO 1.2.1. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [75] Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm hai nhóm: + Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. Microti. Trong đó M. tuberculosis và M. bovis gây bệnh lao điển hình + Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm: M. avium, M. ortuitum, M.govdovac, M. kansasii… Nhóm này khơng gây bệnh lao [33, [58, 61] 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc 1.2.2. 1. Cấu trúc hình thái Vi khuẩn lao được phát hiện bởi Robert Koch khoảng 100 năm trước đây. Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 23 µm, dầy 0,3 µm. Nhuộm ZielNellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, khơng bị cồn và axit làm mất màu fucsin, do vậy chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilliAFB). Dựa vào đặc điểm này có thể giúp phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm bằng cách soi AFB. Một số giả thiết cho rằng mức kháng với axit là do độ dài của các chuỗi axit mycolic. Trực khuẩn lao duy trì tính kháng axit trong dịch huyền phù trong một khoảng thời gian rất dài ngay cả khi có tác dụng của nhiệt. Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, axit amin và các enzyme cofactor thiết yếu cho tế bào [3, 4, 5, 12] Hình 1.1. Trực khuẩn M. tuberculosis (http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html) Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen (http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html) 1.2.2.2. Cấu trúc thành tế bào Thành tế bào của Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc đặc biệt, chia thành 4 lớp: 1 Lipid ngoài 2 Axit mycolic 3 polysaccharides (arabinogalactan) 4 peptidoglycan 5 màng sinh chất 6 lipoarabinomannan (LAM) 7 phosphatidylinositol mannoside 8 Khung thành tế bào Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao (http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram) Lớp ngồi cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy vi khuẩn lao, phát triển trong tế bào có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống chịu các enzyme phân giải từ các lyzozyme của tế bào. Khi phát triển trong mơi trường ni cấy lỏng hoặc trong đại thực bào, M. tuberculosis tích lũy một capsule giả khơng bám. Thành phần của capsule này chứa protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid. Cấu trúc của capsule có thể bung ra bên trong các đại thực bào. Màng tế bào của vi khuẩn lao gây bệnh hầu như giống với màng của các Mycobacterium trong giống, bao gồm Mycobacterium khơng gây bệnh. Lớp tiếp theo được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các chất lipit phức tạp. Đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao, làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn, chống lại sự hủy diệt của đại thực bào và các tế bào miễn dịch [1]. Gắn với peptidoglican là một poysaccaharide phân nhánh và arabinogalactan, đầu ngồi của các phân tử này được este hóa với axit béo có khối lượng phân tử cao là axit mycolic Các axit mycolic được sắp xếp theo tính đặc hiệu lồi nên có thể xác định lồi Mycobacterium bằng sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng cao và sắc kí khí lỏng [57]. Các axit mycolic đặc hiệu của M. tuberculosis là alpha keto và mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon. Lớp ngồi thành tế bào có phân tử lipid tự phthiocerol dilycoserosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalosecontaining glycolipids và sulfolipids (SL). Xuyên qua toàn bộ lớp màng là những glycolipid phosphatidyl myoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM) được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngồi thành tế bào, LAM có tính đặc hiệu lồi Thành tế bào Mycobacterium chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này tham gia vào cấu trúc thành tế bào, các protein porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan trong nước thơng qua lớp axit mycolic [58, 67]. Lớp thứ ba gồm các peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử axit mycolic tạo nên bộ khung định hình cho vi khuẩn, đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng nhất định. Thành tế bào của Mycobacterium có cấu trúc phức tạp với thành phần hóa học nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết peptidoglycan thành tế bào M. tuberculosis là 70 đến 80% trong khi ở E. coli là 2030% [58]. Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các photpholipit. Các photpholipit gồm 2 nhóm, nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kị nước hướng ra phía ngồi vỏ [1]. Màng sinh chất giữ vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu giữa tế bào chất và mơi trường. Ngồi ra các protein của màng giữ các chức năng khác nhau như protein nhạy với nồng độ của các phân tử trong mơi trường , protein truyền tín hiệu đến bộ máy 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Trần Thị Thanh Hoa, Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2005), Sử dụng kết hợp hai phương pháp hố sinh và PCR để xác định đa kháng thuốc của M. tuberculosis, Hội nghị khoa học tồn quốc về cơng nghệ sinh học, Tháng 12/2005 Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của Mycobacterium tubeculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phổi , Luận án Tiến sỹ Y học Phan Thị Thu Hương, Đỗ Quỳnh Nga, Vũ Tân Trào (2005), “Phát hiện M. tuberculosis trong môi trường bệnh viện lao sử dụng kỹ thuật PCR”, Hội nghị khoa học tồn quốc về cơng nghệ sinh học. Tháng 12/2005 10 Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng và nghiên cứu Lao tại Việt Nam, Hội thảo về sinh học phân tử về bệnh lao, Đại học Quốc gia Hà Nội, Tháng 8/2007 11 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng, NXB Giáo dục 12 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị, NXB Giáo dục 13 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ cộng sự (2007), “Hồn thiện qui trình PCR đối với hai gen mới IS1081 và 23Sr ADN trong nâng cao hiệu quả chẩn đốn lao”, Tạp chí Y Dược Học Qn Sự , 32(2), p. 3137 80 14 Nguyễn Thái Sơn, Hồng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007), “Nghiên cứu tối ưu hố quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng trong chẩn đốn nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.2731 15 Quyền Đình Thi (2005), Cơng nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật 16 Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao và Bệnh phổi sau đại học, Học Viện Qn Y 17 Phạm Hùng Vân (2007), ”Các qui trình kỹ thuật sinh học phân tử thường được sử dụng trong chẩn đốn và nghiên cứu y sinh học”, www.nkbiotek.com.vn Tiếng Anh 18 Alcaide F., M A Benitez, J M Escriba, R Martin (2000), “Evaluation of the BACTEC MGIT 969 and thi MB/BacT systems for recovery of Mycobacteria from clinical specimens and for species identification by DNA AccuProbe”, Journal Clinical Microbiology. 38, 398401. 19 Andersen A.B., Thybo S., R GodfreyFaussett, Stoker N.G (1993), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum” Eur. Journal of Clinical Microbiology Infect Dis, 12 (12), 922927. 81 20 Ahuja G. K., Mohan K. K., Prasad K., Behari M. (1994), “Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation”, Tuber Lung Dis 75, 149152 21 Barouni A. S., Saridakis H. O., Vidotto M. C (2004), “Detection of Mycobacterium in clinical samples by multiprimer polymerase chain reaction”, Brazilian Journal of Microbiology 35, 2932. 22 Bhattacharya B. (2003), “Development of a new sensitive and efficient multiplex polymerase chain reaction (PCR) for identification and differentiation of defferent Mycobacteria species”, Tropical Medicine and International Health, 8 (2), 150157. 23 Bonnie B. Plikaytis, Jennifer L. Marden, Jack T. Crawford, Charles L Woodley, W Ray Butler, and Thomas M Shinnick (1994) “Multiplex PCR Assay Specific for the MultidrugResistant Strain W of Mycobacterium tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, 32 (6), 15421546. 24 Clarrridge JE III, Shawar RM, Shinnck TM, Plikaytis BB (1993), “Largescale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory”, Journal Clinical Microbiology, 31, 204156. 25 Cole S T. (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature, 393, 537 544. 26 Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence, IS1081, in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 1115. 82 27 Donald P. R., Victor T. C., Jordaan A. M., Schoeman J. F., Van Heldon P. D (1993), “Polymerase chain reaction in the diagnosis of tuberculous meningitis”, Scand J Infect Dis, 25, 613617. 28 Down J. A., Walters A. H., Dey M. S., Howard D. R., Little M. C., Keating W. E. (1996), “Sample processing method for Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent 5554503. 29 David H Persing (1993), “Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications”, American Society for Microbiology, 51 172. 30 Elnifro E. M (2000), “Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology”, Oct, 2000, p. 559570. 31 Espitia C (1999), “The PEPGRS glycinerich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectinbinding proteins”, Microbiology, 145, 3487–3495. 32 Forbes BA, Hicks KES (1993), “Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction”, Journal Clinical Microbiology 31: 168894. 33 Goyal (1996), “Rapid detection of multidrug – resistant tuberculosis”, Eur Respir, 1997, 10, p1120 – 1124 34 Gurpreet S. Sandhu , Bruce C. Kline, Glenn D. Roberts, Marcia E. Lewis (1998), “IS6110 based molecular detection of Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent 5731150 35 Henegariu O., N. A. Heerema, S. R. Dlouhy, G. H. Vance, P. H. Vogt (1997), “Multiplex PCR: Critical Parameters and StepbyStep Protocol”, BioTechniques 23, 504511. 83 36 Herrera EA, Perez O, Segovia M (1996), “Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex polymerase reaction”, Journal of Applied Bacteriology, 80, 596604. 37 Henegariu, O., P. Hirschmann, K. Kilian, S. Kirsch, C. Lengauer, R. Maiwald, K Mielke and P Vogt (1994) “Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis”, Andrologia, 26, 97 106. 38 Jaber M., A. Rattan, A. Verma, J. Tyag F, R. Kumar (1995), “A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis”, Tubercle and Lung Disease, 76, 578581 . 39 Kamerbeek J (1997), “Simultaneous Detection and Strain Differentiation of Mycobacterium tuberculosis for Diagnosis and Epidemiology”, Journal of Clinical Microbiology, Apr. 1997, 907914 40 Katoch V. M. (2004), “Newer diagnost ic techniques for tuberculosis”, Indian J Med Res, 120, p. 418428. 41 Kox L F F, Rheinthong D., Miranda A M., Udomsantisuk N., (1994), “A more reliable PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples”, Journal of Clinical Microbiology, 32, 672678. 42 Kubica GP, Dye WE, Cohn ML, Middlebrook C (1963), “Sputum degestion and decontamination with NAcetylLsysteinesodium hydroxide for culture of bacteria”, American Review of Respiratory Diseases, 87, 775779. 84 43 Kulkarni S. P. , M. A. Jaleel, G. V. Kadival (2005), “Evaluation of an inhousedeveloped PCR for the diagnosis of tuberculous meningitis in Indian children”, Journal of Medical Microbiology, 54. 369373. 44 Kurabachew M. (2004), “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus, group and speciesspecific detection of Mycobacteria”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 49, 99104. 45 Kurabachew M., Sandaad R A., Engere, Bjorvatna B., (2003), “Sequence analysis in the 23S rDNA region of Mycobacterium tuberculosis and related species”, Journal of Microbiological Methods, 54, 373 380. 46 Lazraq R , el Baghdadi J, Guesdon JL, Benslimane A (1999), “Evaluation of IS6110 as amplification target for direct tuberculosis diagnosis”, Pathologie Biologie, 47(8):7906 47 Liedtke W., Opalka B., Zimmermann C W., Schmid E (2007), “Different Methods of Sample Preparation Influence Sensitivity of Mycobacterium tuberculosis and Borrelia burgdorferi PCR”, PCR Methods Appl, 3, 301304. 48 Lin J. J., Ham H. J., Hsu Y. D. (1995), “Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction assay of cerebrospinal fluid”, J Neuro, 242, 147152. 49 Margall N., Baselga E., Barnadas M.A., Moragas J.M., Rrats G. (1996), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA by the polymerase chain reaction for rapid diagnosis of cutaneous tuberculosis”, British Journal of Dermatology, 135(2), 231236. 85 50 Mekonnen Kurabacchew (2004) “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus, group and speciesspecific detection of mycobacteria”. Diagn. Microbiol. Infect. Dis, 49(2), 99104 51 Miorner H., Sjobring U., Nayak P., Chandramuki A (1995), “Diagnosis of tuberculous meningitis: a comparitive analysis of 3 immunoassays, an immune complex assay and the polymerase chain reaction”, Tuber Lung Dis, 76, 381386. 52 Mishra A., Singhal A (2005) “Direct Detection and Identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis in Bovine Samples by a Novel Nested PCR assay Correlation with conventional Techniques”, Journal of Clinical Microbiology 53 Musser J. M. (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria : Molecular genetic insights”, Clinical Microbiology Reviews, 8 (4), 496 514. 54 Mustafa A.S., Abal A.T and Chugh T.D (1999), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous Mycobacteria by multiplex polymerase chain reactions”, Eastern Mediterranean Health Journal, 5(1), 6170. 55 Mustafa A S., Ahmed A., Abal A T., Chugh T D (1995), “Establishment and evaluation of a multiplex polymerase chain reaction for detection of Mycobacteria and specific identification of Mycobacteria tiberculosis complex”, Tubercle and Lung Disease, 76. 336343. 56 MultiCenter Study Group. (1992) Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction”, JAMA, 267, 2609 2615. 86 57 Nguyen L. N., Kox L. F., Pham L. D., Kuijper S., Kolk A. H. (1996), “The potential contribution of the polymerase chain reaction to the diagnosis of tuberculous meningitis”, Arch Neurol 53, 771776. 58 Palomino J C., S C Leão, V Ritacco (2007), Tuberculosis 2007 From basic science to patient care”, www.TuberculosisTextbook.com 59 Rattan A (2000), “PCR for diagnosis of tuberculosis: where are we now?”, Ind J Tub, No. 47, 7982. 60 Scarpellini P (1997), “Detection of Rifampin Resistance by Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of cerebrospinal Fluid of Patients with Tuberculosis of the Central Nervous System”, Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1997, p. 28022806. 61 Schlossberg D. (2006), “Tuberculosis and nontuberculous Mycobacteria l infections. Fifth edition”, Medical Publishing Division. 62 Seth P., Ahuja G. K., Bhanu N. V., Behari M., Bhowmilk S., Broor S., Dar L., Chakraborty M (1996), “Evaluation of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of clinically suspected tuberculous meningitis”, Tuber Lung Dis, 77, 353357. 63 Sechi L. A. (1997), “Detection of Micobacterium tuberculosis by PCR analysis of urine and other clinical samples from AIDS and nonHIV infected patients”, Molecular and Cellular Probes, 11, 281285. 64 Sjobring ULF, M. Mecklenburg, A. B. Andersen, H. Miorner (1990), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, Oct. 1990, 28 (10), 22002204. 65 Smith I (2003), “Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence”, Journal of Clinical Microbiology, 16 (3), 463496. 87 66 Suffys P., Vanderborght P. R., Santos P. B. et al (2001), “Inhibition of the Polymerase Chain Reaction by Sputum Samples from Tuberculosis Patients After Processing Using a Silicaguanidiniumthiocyanate DNA Isolation Procedure”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 96(8), 11371139. 67 Tanaka I. I., Anno I. K. (2003), “Comparison of a Multiplex PCR Assay with Mycolic Axits Analysis and conventional Methods for the Identification of Mycobacteria ”, Microbiol. Immunol, 47(5), 307312. 68 Thierry D., A BrissonNoel (1990), “Characterization of a Mycobacterium tuberculosis Insertion Sequence, IS6110, and Its Application in Diagnosis”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (12), 26682673. 69 Thierry D., Cave M. D., Eisenach K. D. et al. (1990), “IS6110 an IS like element of M. tuberculosis complex”, Nucleic Axits Research, 18, 188190. 70 Tiwri R P (2006), “Modern approaches to a rapid diagnosis of tuberculosis: Promises and challenges ahead”, Tuberculosis No. 87, p. 193201 71 Van Soolingen D, Hermans PWM, de Haas PEW, Soll DR, Van Embden JDA (1991), “Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains; evaluation of an insertion sequence dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, 29, 25782586. 72 Verma A., Rattan A., Tyagi J. S. (2000), “Development of a 23S rRNA based PCR assay for the detection of Mycobacteria ”, Indian J Biochem Biophys, 31, 288294. Website: 88 73 http://www.who.int/Fact sheet/ Fact sheet No104/2005. 74 http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis 75 http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html 76 http://www.google.com.vn/imglandingmycobacteriumtuberculosis 77 http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html 78 http://www.benhhoc.com/index.php?do=viewarticle&artid=667 89 MỤC LỤC TỔNG QUAN 3 1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO 3 1.2. VI KHUẨN LAO 6 1.2.1. Đặc điểm phân loại 6 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc 7 1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy 12 1.2.3.1. Môi trường và dạng khuẩn lạc 12 1.2.4. Khả năng gây bệnh 13 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO 23 1.3.1. Phương pháp soi trực tiếp 23 1.3.2. Phương pháp nuôi cấy 23 1.3.3. Phương pháp phát hiện kháng nguyên kháng thể 24 1.3.4. Phương pháp γinterferon 26 1.3.5. Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao 27 1.3.6. Các nghiên cứu về chẩn đoán phân tử vi khuẩn lao ở Việt Nam và tạo kit PCR về chẩn đoán 30 CHƯƠNG 2 32 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 32 2.1.1. Các chủng vi khuẩn lao 32 2.1.2. Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng 32 2.2.VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 32 2.3.2. Tách chiết DNA 37 2.3.3. Kĩ thuật PCR và multiplex PCR 40 2.3.4. Kỹ thuật điện di 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 4 Lời cảm ơn! Lời cảm ơn đầu tiên tơi xin trân trọng gửi tới PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn, người Thầy đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn này. Tơi xin gửi tới thầy lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc! Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị Phòng Vi sinh Vật và các Mầm bệnh Sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học Qn sự Học viện Qn Y. Cảm ơn vì sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong q trình tơi thực hiện đề tài tại đây Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cơ trong Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho chúng tơi trong q trình học tập tại trường. Cuối cùng, tơi muốn nói lời cảm ơn sâu sắc đến Gia đình tơi và bạn bè đã ln động viên giúp đỡ để tơi có thể hồn thành khóa học và thực hiện tốt luận văn này! Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 12 năm 2010 H ọc viên Nguyễn Thị Thanh Mai DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AFB Acid Fast Bacilli BCG Bacille CalmetteGuérin (Trực khuẩn CalmetteGuérin ) Bp Base pairs (Cặp base) BSA Bovine Serum Albumin DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates DR Direct Repeat (Đoạn lặp lại trực tiếp) EDTA Ethylene Diamine Tetra Acid ELISA EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay 10 GuSCN Guanidinium thiocyanate 11 IR Inverted Repeat (Đoạn lặp lại ngược chiều) 12 kDa kiloDalton 13 IS Insertion Sequence (Trình tự chèn) 14 LAM Lipoarabinomannan 15 MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube 16 MOTT Mycobacteria other than tuberculosis 17 MTBC Mycobacteria tuberculosis complex 18 M. t Mycobacterium tuberculosis 19 OD Optical Density (Mật độ quang học) 20 ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở) 21 PBS Phosphat Buffer Saline 22 PCR Polymerase Chain Reaction 23 PCR RFLP Polymerase Chain Reaction Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài các đoạn giới hạn dựa trên PCR) 24 PE ProlineGlutamine 25 PDIM Phthiocerol dilycoserosates 26 PGL Phenolic glycolipids 27 RFLP 28 PGRS 29 PPD Purified Protein Derivative 30 PPDS Purified Protein Derivative Standard 31 PPE ProlineProlineGlutamine 32 RNA Ribonucleic acid 33 SDS Sodium dodecyl sulfate (NaDS C12H25 Na O 4S) 34 SL Sulfolipids 35 TB Tuberculosis (vi khuẩn lao) 36 TBE Tris Boric Acid EDTA 37 UV Ultraviolet (tử ngoại) 38 XDRTB Xtensively drugresistant tuberculosis (Lao kháng đa thuốc mở rộng) 39 WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài các đoạn giới hạn) Polymorphic GCrich Repetitive Sequences (Trình tự lặp lại giầu GC) ... tài “ Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đốn nhanh các chủng vi khuẩn lao Vi t Nam nhằm chẩn đốn nhanh, chính xác vi khuẩn lao, góp phần kiểm sốt và nâng cao hiệu quả chẩn đốn lao. Đề tài có hai mục tiêu sau:... và Đơng Nam Á trong đó có Vi t Nam [34, 72]. Vì vậy rất dễ bỏ sót các bệnh nhân có mang vi khuẩn lao khuyết IS6110. Do vậy cần thiết kế những loại primer mới để chẩn đốn lao ở Vi t Nam một cách hiệu quả và chính xác. ... đặc hiệu của RNA ribosome 16S thơng qua sự sao chép của vùng gen đó ở một điểm đẳng nhiệt 42oC [10, 12, 16]. Tuy nhiên sản phẩm khuếch đại là RNA dễ bị phân huỷ hơn so với DNA 1.3.6. Các nghiên cứu về chẩn đốn phân tử vi khuẩn lao ở Vi t Nam và tạo kit PCR về chẩn đốn