Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam

MỞ ĐẦU Theo thống kê tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao chiếm 1/3 dân số giới Hàng năm có thêm khoảng triệu người mắc lao có khoảng triệu người chết lao Với tốc độ lây truyền nhanh tỷ lệ tử vong cao vậy, bệnh lao xếp vào bệnh truyền nhiễm nguy hiểm Tuy nhiên theo ước tính tỷ lệ phát bệnh đạt 37% Như số bệnh nhân mắc lao không phát chữa trị kịp thời chiếm đến 63%, nguồn lây nhiễm khó kiểm soát Theo đánh giá WHO Việt Nam quốc gia phát triển có tỉ lệ nhiễm lao đứng thứ 12 số 22 nước có số bệnh nhân mắc lao cao giới (WHO 2004) Tính riêng khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3, sau Trung Quốc Philipine [2, 11, 74] Trước diễn biến nghiêm trọng đó, tổ chức Y tế Thế giới kêu gọi quốc gia giới quan tâm đặc biệt đến phòng chống kiểm soát bệnh lao Bệnh lao ngày trở nên nguy hiểm hơn, đặc biệt lao kháng đa thuốc gây tử vong lớn, cần thiết việc phát điều trị sớm Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn đoán nhanh xác Tuy nhiên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn Ở Việt Nam, phương pháp phổ biến nhuộm Ziehl- Neelsen Tuy nhiên phương pháp phát trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, để sót nhiều bệnh nhân kết âm tính giả Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao môi trường LowensteinJensen coi tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, nhiên phải đến tuần nuôi cấy cho kết Trên môi trường nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC đến tuần, khó đáp ứng yêu cầu giám sát kiểm soát bệnh lao [4, 19] Hiện nay, với phát triển công nghệ sinh học khắc phục nhược điểm Việc áp dụng công nghệ sinh học phân tử chẩn đoán lao rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống hai ngày Phương pháp có độ nhậy độ đặc hiệu cao, cho phép phân biệt xác loài có khả gây bệnh lao phát khả kháng thuốc thông qua gen đặc trưng Hiện nay, số sở nước áp dụng sinh học phân tử chẩn đoán lao chủ yếu sử dụng kít chẩn đoán cũ nhằm vào nhân đoạn IS6110, trình tự đặc trưng vi khuẩn lao [28, 34] Tuy nhiên, gần số nghiên cứu công bố tỷ lệ định chủng lao không chứa trình tự IS6110, đặc biệt chủng tìm thấy Ấn Độ Đông Nam Á có Việt Nam [34, 72] Vì dễ bỏ sót bệnh nhân có mang vi khuẩn lao khuyết IS6110 Do cần thiết kế loại primer để chẩn đoán lao Việt Nam cách hiệu xác Theo số nghiên cứu gần cho biết, đoạn gen IS6110 có số gen đích khác IS1081 23SrDNA có mặt tất chủng lao gây bệnh Do sử dụng lúc cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn IS6110, IS1081 23S rDNA thuận lợi việc phát M tuberculosis complex, tránh bỏ sót bệnh nhân [13] Xuất phát từ vấn đề đề xuất đề tài “Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh chủng vi khuẩn lao Việt Nam” nhằm chẩn đoán nhanh, xác vi khuẩn lao, góp phần kiểm soát nâng cao hiệu chẩn đoán lao Đề tài có hai mục tiêu sau: Tạo kit multiplex PCR với gen đích IS6110, IS1081 23SrDNA chẩn đoán vi khuẩn lao phù hợp với điều kiện Việt Nam Đánh giá hiệu kit panel mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi lao Chương TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1 Tình hình bệnh lao gới Lao bệnh truyền nhiễm mãn tính xuất từ lâu Hàng nghìn năm trôi qua, lây lan giết chết hàng triệu người, số người chết bệnh lao lớn AIDS sốt rét cộng lại Ngày nay, bệnh lao trở nên nghiêm trọng xuất chủng lao kháng đa thuốc, lao kháng thuốc phổ rộng lao đồng nhiễm HIV/AIDS Cùng với AIDS sốt rét, lao xếp vào ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm giới [2, 53] Do tính chất lây truyền qua tiếp xúc qua không khí bệnh cúm nên tốc độ lan truyền nhanh khả kiểm soát bệnh lao phức tạp Các kết thống kê lặp lại nhiều lần ước tính có khoảng 1/3 dân số giới (khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M tuberculosis 10% số phát triển thành bệnh thời điểm đời Mỗi năm có khoảng triệu bệnh nhân phát hiện, hàng năm giới có khoảng 49 triệu bệnh nhân lao lưu hành, số ngày gia tăng Bệnh lao giết chết 8000 người ngày, gần triệu người năm [73] Đáng báo động bệnh lao trở thành nguyên nhân hàng đầu giết hại nhiều thiếu niên người lớn, chủ yếu nhóm tuổi nguồn lao động xã hội (từ 20 tới 49 tuổi) [78] Số bệnh nhân lao nước phát triển chiếm 95% tổng số bệnh nhân lao toàn giới Khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn giới tập trung vào 22 quốc gia có gánh nặng bệnh tật cao Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân gây tử vong nước Tính riêng Ấn Độ, hàng năm có khoảng 500.000 người chết bệnh này, tương đương tỷ lệ phút lại có người quốc gia chết lao [63, 73] Năm 2007, WHO ước tính khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao chiếm tới 34% toàn giới Còn cận Sahara châu Phi tỷ lệ cao gấp đôi so với Đông Nam Á, tỷ lệ nhiễm lao 343 ca 100.000 người dân Thông báo gần năm 2007 tổ chức y tế giới cho biết bệnh lao xác định bước đầu ổn định giảm vùng giới Tuy nhiên số lượng ca nhiễm toàn cầu tăng lên tập trung châu Phi, Đông Địa Trung Hải Đông Nam Á Tình hình cho thấy bệnh lao không giảm nguy hại loài người Hiện tỷ lệ điều trị lao thành công toàn cầu đạt 82%, nhiên nhiều bệnh nhân chưa phát không chữa trị, bệnh nhân tiếp tục lây cho cộng đồng Theo ước tính WHO tỷ lệ phát bệnh nhân đạt 37% tổng số người nhiễm lao [63] Sự gia tăng bệnh lao quy mô toàn cầu với mối liên quan với HIV xuất chủng kháng thuốc vấn nạn y tế cộng đồng Điều khiến cho bệnh lao trở nên khó khăn việc kiểm soát điều trị Đến năm 1993 WHO phải tuyên bố tình trạng khẩn cấp bệnh lao toàn cầu để kêu gọi quốc gia giới chung tay phòng chống lao [64] 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam Theo báo cáo vào năm 2006 chương trình chống lao quốc gia Việt Nam đứng thứ 12 số 22 quốc gia có số bệnh nhân lao cao giới Tại khu vực tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ sau Trung Quốc Philipine tổng số bệnh nhân lao lưu hành số bệnh nhân lao phát Bên cạnh gia tăng đáng lo ngại tình trạng lao kháng thuốc vấn đề cấp bách [2, 10, 53] Năm 1995, trước biến động xấu tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực bắt đầu phải đối mặt với thách thức bệnh lao kháng thuốc Lao/HIV, Nhà nước Bộ Y tế Việt nam định đưa Chương trình chống lao thành Chương trình y tế Quốc gia trọng điểm Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao Quốc Gia phát 532.703 bệnh nhân lao thể, tỷ lệ phát ước tính đạt 82% số bệnh nhân Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 10, 53] Theo WHO Việt Nam nước có gánh nặng bệnh lao cao toàn cầu với khoảng 44% dân số nhiễm lao Tỷ lệ lao mắc thể 173/100.000 dân, tỷ lệ lao phổi AFB (+) 77/100.000 dân, tỷ lệ mắc thể 225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong lao 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV bệnh nhân lao 5% [2], thực tế số liệu nhiễm lao cao số thống kê Vấn đề đồng nhiễm HIV lao không làm tăng số bệnh nhân lao mà làm giảm hiệu điều trị bệnh, tăng tỷ lệ tử vong Đó khó khăn, thách thức lớn công tác phòng chống lao quốc gia Đáng ngại tỷ lệ lao kháng thuốc Việt Nam ngày gia tăng, tỷ lệ lao kháng đa thuốc bệnh nhân lao 2,7% tỷ lệ lao kháng đa thuốc số bệnh nhân điều trị lại 19% Như vậy, ngày có gần 400 người mắc, có 178 người mắc lao phổi ho khạc vi khuẩn làm lây nhiễm cho cộng đồng 55 người chết bệnh lao Hiện nay, nguy nhiễm lao hàng năm nước ta ước tính 1,5% [2] Thực tế nay, tỷ lệ phát đạt khoảng 44% tỷ lệ chữa khỏi 81% [2] Những năm gần việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử PCR vào chẩn đoán lao bước đột phá mang lại nhiều kết khả quan Tuy kĩ thuật điểm chưa thực hoàn thiện cần có nghiên cứu bổ sung, cải tiến nhằm đem lại hiệu tối ưu 1.2 VI KHUẨN LAO 1.2.1 Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, Actinomycetales, phân Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [75] Tên khoa học vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium chia làm hai nhóm: + Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm: M tuberculosis, M bovis, M africanum, M Microti Trong M tuberculosis M bovis gây bệnh lao điển hình + Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm: M avium, M ortuitum, M.govdovac, M kansasii… Nhóm không gây bệnh lao [33, [58, 61] 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc 1.2.2 Cấu trúc hình thái Vi khuẩn lao phát Robert Koch khoảng 100 năm trước Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dầy 0,3 µm Nhuộm Ziel-Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn axit làm màu fucsin, chúng gọi trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli-AFB) Dựa vào đặc điểm giúp phát vi khuẩn lao mẫu bệnh phẩm cách soi AFB Một số giả thiết cho mức kháng với axit độ dài chuỗi axit mycolic Trực khuẩn lao trì tính kháng axit dịch huyền phù khoảng thời gian dài có tác dụng nhiệt Trực khuẩn lao có khả thực tất chế cần thiết để tổng hợp vitamin, axit amin enzyme co-factor thiết yếu cho tế bào [3, 4, 5, 12] Hình 1.1 Trực khuẩn M tuberculosis (http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html) Hình 1.2 Trực khuẩn M tuberculosis sau nhuộm Ziehl – Nielsen (http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html) 1.2.2.2 Cấu trúc thành tế bào Thành tế bào Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc đặc biệt, chia thành lớp: 1- Lipid 2- Axit mycolic 3- polysaccharides (arabinogalactan) 4- peptidoglycan 5- màng sinh chất 6- lipoarabinomannan (LAM) 7- phosphatidylinositol mannoside 8- Khung thành tế bào Hình 1.3 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn lao (http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram) Lớp có cấu trúc peptidoglycolipid, lớp thấy vi khuẩn lao, phát triển tế bào có tác dụng tăng cường lớp áo giáp cho vi khuẩn nằm tế bào chống chịu enzyme phân giải từ lyzozyme tế bào Khi phát triển môi trường nuôi cấy lỏng đại thực bào, M tuberculosis tích lũy capsule giả không bám Thành phần capsule chứa protein, polysaccharide lượng nhỏ lipid Cấu trúc capsule bung bên đại thực bào Màng tế bào vi khuẩn lao gây bệnh giống với màng Mycobacterium giống, bao gồm Mycobacterium không gây bệnh Lớp tạo nên liên kết axit mycolic chất lipit phức tạp Đây lớp tạo nên độc tính vi khuẩn lao, làm tăng khả chống thấm nước thành vi khuẩn, chống lại hủy diệt đại thực bào tế bào miễn dịch [1] Gắn với peptidoglican poysaccaharide phân nhánh arabinogalactan, đầu phân tử este hóa với axit béo có khối lượng phân tử cao axit mycolic Các axit mycolic xếp theo tính đặc hiệu loài nên xác định loài Mycobacterium sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu cao sắc kí khí lỏng [57] Các axit mycolic đặc hiệu M tuberculosis alpha - keto mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 83 đến 90 carbon Lớp thành tế bào có phân tử lipid tự phthiocerol dilycoserosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids sulfolipids (SL) Xuyên qua toàn lớp màng glycolipid phosphatidyl- myoinositol mannosides, lipomannan (LM) lipoarabinomannan (LAM) đính vào màng sinh chất mở rộng bên thành tế bào, LAM có tính đặc hiệu loài Thành tế bào Mycobacterium chứa protein nằm rải rác, vài protein tham gia vào cấu trúc thành tế bào, protein porin hình thành kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực chất tan nước thông qua lớp axit mycolic [58, 67] Lớp thứ ba gồm peptidoglican liên kết với đường arabinose phân tử axit mycolic tạo nên khung định hình cho vi khuẩn, đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng định Thành tế bào Mycobacterium có cấu trúc phức tạp với thành phần hóa học nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết peptidoglycan thành tế bào M tuberculosis 70 đến 80% E coli 20-30% [58] Lớp cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu photpholipit Các photpholipit gồm nhóm, nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kị nước hướng phía vỏ [1] Màng sinh chất giữ vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu tế bào chất môi trường Ngoài protein màng giữ chức khác protein nhạy với nồng độ phân tử môi trường , protein truyền tín hiệu đến máy trao đổi chất máy di truyền nguyên sinh chất, enzyme liên quan đến trình trao đổi chất sinh lượng Các enzyme xuyên màng tổng hợp màng, tạo vách ngăn trình phân chia tế bào [3, 4, 12] M tuberculosis không phân loại Gram dương hay Gram âm chúng đặc tính hoá học này, thành tế bào có chứa peptidoglycan đặc điểm thành tế bào gắn với phân tử lipit protein hay polycharcaride nên M tuberculosis không xếp vào nhóm vi khuẩn Gram (+) Trên mẫu nhuộm Gram chúng không giữ lại tinh thể màu tím xuất nhuộm Gram Thành tế bào M tuberculosis không thẩm thấu aniline chất khác sử dụng nhuộm trừ chúng kết hợp với phenol Màng tế bào vi khuẩn lao cấu trúc linh động thay đổi phát triển tồn môi trường khác Trong điều kiện thiếu oxi thành tế bào dầy lên Trong môi trường nuôi cấy axit nhẹ khoang đại thực bào biểu gen mã hóa cho porin dường điều hòa ngược Trong điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao tồn 3-4 tháng, điều kiện phòng thí nghiệm bảo quản nhiều năm Dưới ánh sáng trực tiếp mặt trời vi khuẩn lao bị tiêu diệt sau phút, ánh sáng tia cực tím vi khuẩn lao tồn từ 2-3 phút Ở nhiệt độ 42oC vi khuẩn lao ngừng phát triển, 80oC vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8] 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 1.2.3.1 Môi trường dạng khuẩn lạc Trực khuẩn lao vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc điều kiện kị khí Nhiệt độ thích hợp để mọc 37oC , nhiệt độ 37oC 42oC vi khuẩn lao không mọc Vi khuẩn lao không sinh trưởng môi trường thông thường mà phải nuôi môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng gồm trứng, khoai tây, citrat, glixerol, asparagin, xanh malachite Môi trường thường dùng môi trường Loewenstein đặc cải tiến Jensen 10 11 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền ứng dụng, NXB Giáo dục 12 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị, NXB Giáo dục 13 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ cộng (2007), “Hoàn thiện qui trình PCR hai gen IS1081 23Sr ADN nâng cao hiệu chẩn đoán lao”, Tạp chí Y Dược Học Quân Sự , 32(2), p 31-37 14 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007), “Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31 15 Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật 16 Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao Bệnh phổi sau đại học, Học Viện Quân Y 17 Phạm Hùng Vân (2007), ”Các qui trình kỹ thuật sinh học phân tử thường sử dụng chẩn đoán nghiên cứu y sinh học”, www.nk-biotek.com.vn Tiếng Anh 18 Alcaide F., M A Benitez, J M Escriba, R Martin (2000), “Evaluation of the BACTEC MGIT 969 and thi MB/BacT systems for recovery of Mycobacteria from clinical specimens and for species identification by DNA AccuProbe”, Journal Clinical Microbiology 38, 398-401 75 19 Andersen A.B., Thybo S., R Godfrey-Faussett, Stoker N.G (1993), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum” Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis, 12 (12), 922-927 20 Ahuja G K., Mohan K K., Prasad K., Behari M (1994), “Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation”, Tuber Lung Dis 75, 149-152 21 Barouni A S., Saridakis H O., Vidotto M C (2004), “Detection of Mycobacterium in clinical samples by multiprimer polymerase chain reaction”, Brazilian Journal of Microbiology 35, 29-32 22 Bhattacharya B (2003), “Development of a new sensitive and efficient multiplex polymerase chain reaction (PCR) for identification and differentiation of defferent Mycobacteria species”, Tropical Medicine and International Health, (2), 150-157 23 Bonnie B Plikaytis, Jennifer L Marden, Jack T Crawford, Charles L Woodley, W Ray Butler, and Thomas M Shinnick (1994) “Multiplex PCR Assay Specific for the Multidrug-Resistant Strain W of Mycobacterium tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, 32 (6), 1542-1546 24 Clarrridge JE III, Shawar RM, Shinnck TM, Plikaytis BB (1993), “Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory”, Journal Clinical Microbiology, 31, 2041-56 25 Cole S T (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature, 393, 537544 76 26 Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence, IS1081, in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 11-15 27 Donald P R., Victor T C., Jordaan A M., Schoeman J F., Van Heldon P D (1993), “Polymerase chain reaction in the diagnosis of tuberculous meningitis”, Scand J Infect Dis, 25, 613-617 28 Down J A., Walters A H., Dey M S., Howard D R., Little M C., Keating W E (1996), “Sample processing method for Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent 5554503 29 David H Persing (1993), “Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications”, American Society for Microbiology, 51172 30 Elnifro E M (2000), “Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology”, Oct, 2000, p 559-570 31 Espitia C (1999), “The PE-PGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-binding proteins”, Microbiology, 145, 3487–3495 32 Forbes BA, Hicks KES (1993), “Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction”, Journal Clinical Microbiology 31: 1688-94 33 Goyal (1996), “Rapid detection of multidrug – resistant tuberculosis”, Eur Respir, 1997, 10, p1120 – 1124 34 Gurpreet S Sandhu, Bruce C Kline, Glenn D Roberts, Marcia E Lewis (1998), “IS6110 based molecular detection of Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent 5731150 77 35 Henegariu O., N A Heerema, S R Dlouhy, G H Vance, P H Vogt (1997), “Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol”, BioTechniques 23, 504-511 36 Herrera EA, Perez O, Segovia M (1996), “Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex polymerase reaction”, Journal of Applied Bacteriology, 80, 596-604 37 Henegariu, O., P Hirschmann, K Kilian, S Kirsch, C Lengauer, R Maiwald, K Mielke and P Vogt (1994) “Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis”, Andrologia, 26, 97106 38 Jaber M., A Rattan, A Verma, J Tyag F, R Kumar (1995), “A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis”, Tubercle and Lung Disease, 76, 578-581 39 Kamerbeek J (1997), “Simultaneous Detection and Strain Differentiation of Mycobacterium tuberculosis for Diagnosis and Epidemiology”, Journal of Clinical Microbiology, Apr 1997, 907-914 40 Katoch V M (2004), “Newer diagnost ic techniques for tuberculosis”, Indian J Med Res, 120, p 418-428 41 Kox L F F, Rheinthong D., Miranda A M., Udomsantisuk N., (1994), “A more reliable PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples”, Journal of Clinical Microbiology, 32, 672-678 42 Kubica GP, Dye WE, Cohn ML, Middlebrook C (1963), “Sputum degestion and decontamination with N-Acetyl-Lsysteine-sodium hydroxide for culture of bacteria”, American Review of Respiratory Diseases, 87, 775-779 78 43 Kulkarni S P , M A Jaleel, G V Kadival (2005), “Evaluation of an in-house-developed PCR for the diagnosis of tuberculous meningitis in Indian children”, Journal of Medical Microbiology, 54 369-373 44 Kurabachew M (2004), “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus-, group- and species-specific detection of Mycobacteria”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 49, 99-104 45 Kurabachew M., Sandaad R A., Engere, Bjorvatna B., (2003), “Sequence analysis in the 23S rDNA region of Mycobacterium tuberculosis and related species”, Journal of Microbiological Methods, 54, 373 - 380 46 Lazraq R, el Baghdadi J, Guesdon JL, Benslimane A (1999), “Evaluation of IS6110 as amplification target for direct tuberculosis diagnosis”, Pathologie Biologie, 47(8):790-6 47 Liedtke W., Opalka B., Zimmermann C W., Schmid E (2007), “Different Methods of Sample Preparation Influence Sensitivity of Mycobacterium tuberculosis and Borrelia burgdorferi PCR”, PCR Methods Appl, 3, 301-304 48 Lin J J., Ham H J., Hsu Y D (1995), “Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction assay of cerebrospinal fluid”, J Neuro, 242, 147-152 49 Margall N., Baselga E., Barnadas M.A., Moragas J.M., Rrats G (1996), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA by the polymerase chain reaction for rapid diagnosis of cutaneous tuberculosis”, British Journal of Dermatology, 135(2), 231-236 50 Mekonnen Kurabacchew (2004) “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus-, group- and species-specific detection of mycobacteria” Diagn Microbiol Infect Dis, 49(2), 99-104 79 51 Miorner H., Sjobring U., Nayak P., Chandramuki A (1995), “Diagnosis of tuberculous meningitis: a comparitive analysis of immunoassays, an immune complex assay and the polymerase chain reaction”, Tuber Lung Dis, 76, 381-386 52 Mishra A., Singhal A (2005) “Direct Detection and Identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis in Bovine Samples by a Novel Nested PCR assay Correlation with conventional Techniques”, Journal of Clinical Microbiology 53 Musser J M (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria : Molecular genetic insights”, Clinical Microbiology Reviews, (4), 496514 54 Mustafa A.S., Abal A.T and Chugh T.D (1999), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex and non-tuberculous Mycobacteria by multiplex polymerase chain reactions”, Eastern Mediterranean Health Journal, 5(1), 61-70 55 Mustafa A S., Ahmed A., Abal A T., Chugh T D (1995), “Establishment and evaluation of a multiplex polymerase chain reaction for detection of Mycobacteria and specific identification of Mycobacteria tiberculosis complex”, Tubercle and Lung Disease, 76 336-343 56 Multi-Center Study Group (1992) Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction”, JAMA, 267, 26092615 57 Nguyen L N., Kox L F., Pham L D., Kuijper S., Kolk A H (1996), “The potential contribution of the polymerase chain reaction to the diagnosis of tuberculous meningitis”, Arch Neurol 53, 771-776 58 Palomino J C., S C Leão, V Ritacco (2007), Tuberculosis 2007 From basic science to patient care”, www.TuberculosisTextbook.com 80 59 Rattan A (2000), “PCR for diagnosis of tuberculosis: where are we now?”, Ind J Tub, No 47, 79-82 60 Scarpellini P (1997), “Detection of Rifampin Resistance by SingleStrand Conformation Polymorphism Analysis of cerebrospinal Fluid of Patients with Tuberculosis of the Central Nervous System”, Journal of Clinical Microbiology, Nov 1997, p 2802-2806 61 Schlossberg D (2006), “Tuberculosis and nontuberculous Mycobacteria l infections Fifth edition”, Medical Publishing Division 62 Seth P., Ahuja G K., Bhanu N V., Behari M., Bhowmilk S., Broor S., Dar L., Chakraborty M (1996), “Evaluation of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of clinically suspected tuberculous meningitis”, Tuber Lung Dis, 77, 353-357 63 Sechi L A (1997), “Detection of Micobacterium tuberculosis by PCR analysis of urine and other clinical samples from AIDS and non-HIVinfected patients”, Molecular and Cellular Probes, 11, 281-285 64 Sjobring ULF, M Mecklenburg, A B Andersen, H Miorner (1990), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, Oct 1990, 28 (10), 2200-2204 65 Smith I (2003), “Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence”, Journal of Clinical Microbiology, 16 (3), 463-496 66 Suffys P., Vanderborght P R., Santos P B et al (2001), “Inhibition of the Polymerase Chain Reaction by Sputum Samples from Tuberculosis Patients After Processing Using a Silica-guanidiniumthiocyanate DNA Isolation Procedure”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 96(8), 1137-1139 81 67 Tanaka I I., Anno I K (2003), “Comparison of a Multiplex PCR Assay with Mycolic Axits Analysis and conventional Methods for the Identification of Mycobacteria ”, Microbiol Immunol, 47(5), 307-312 68 Thierry D., A Brisson-Noel (1990), “Characterization of a Mycobacterium tuberculosis Insertion Sequence, IS6110, and Its Application in Diagnosis”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (12), 2668-2673 69 Thierry D., Cave M D., Eisenach K D et al (1990), “IS6110 an ISlike element of M tuberculosis complex”, Nucleic Axits Research, 18, 188-190 70 Tiwri R P (2006), “Modern approaches to a rapid diagnosis of tuberculosis: Promises and challenges ahead”, Tuberculosis No 87, p 193-201 71 Van Soolingen D, Hermans PWM, de Haas PEW, Soll DR, Van Embden JDA (1991), “Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains; evaluation of an insertion sequence dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, 29, 2578-2586 72 Verma A., Rattan A., Tyagi J S (2000), “Development of a 23S rRNA based PCR assay for the detection of Mycobacteria ”, Indian J Biochem Biophys, 31, 288-294 Website: 73 http://www.who.int/Fact sheet/ Fact sheet No104/2005 74 http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis 75 http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html 76 http://www.google.com.vn/imglandingmycobacteriumtuberculosis 77 http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html 78 http://www.benhhoc.com/index.php?do=viewarticle&artid=667 82 83 MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1 Tình hình bệnh lao gới 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam 1.2 VI KHUẨN LAO 1.2.1 Đặc điểm phân loại 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 10 1.2.4 Khả gây bệnh 12 1.2.5 Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao 13 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO 20 1.3.1 Phương pháp soi trực tiếp 20 1.3.2 Phương pháp nuôi cấy 21 1.3.3 Phương pháp phát kháng nguyên kháng thể 22 1.3.4 Phương pháp γ-interferon …………………………………………….23 1.3.5 Sinh học phân tử chẩn đoán lao 24 1.3.6 Các nghiên cứu chẩn đoán phân tử vi khuẩn lao Việt Nam tạo kit PCR chẩn đoán lao……………………………………………………27 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Các chủng vi khuẩn lao 29 2.1.2 Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng 29 2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Các hóa chất thiết bị 30 2.2.2 Các cặp mồi sử dụng PCR multiplex PCR 32 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 33 2.3.2 Tách chiết DNA 34 2.3.3 Kĩ thuật PCR multiplex PCR 36 2.3.4 Phương pháp điện di 38 2.3.5 Tạo kit multiplex PCR ứng dụng chẩn đoán lao 39 2.3.6 Kiểm tra áp dụng kit multiplex PCR 41 2.4 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 42 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 3.1 KẾT QUẢ TẠO KIT MULTIPLEX PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN LAO 43 3.1.1 Tách chiết DNA 43 3.1.2 Tạo panel 45 3.1.3 Kết tối ưu qui trình multiplex PCR với gen đích IS6110, IS1081 23S rDNA 49 3.1.4 Tạo master mix 58 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KIT MULTIPLEX PCR 58 3.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu ngưỡng phát kit mPCR panel mẫu 58 3.2.2 Đánh giá hiệu chẩn đoán kit mPCR mẫu bệnh phẩm lâm sàng 66 3.2.3 Kiểm tra độ ổn định master mix 68 KẾT LUẬN 73 KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 Lời cảm ơn! Lời cảm ơn xin trân trọng gửi tới PGS TS Nguyễn Thái Sơn, người Thầy tận tình hướng dẫn bảo tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực luận văn Tôi xin gửi tới thầy lòng kính trọng biết ơn sâu sắc! Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị Phòng Vi sinh Vật Mầm bệnh Sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh - Y - Dược học Quân - Học viện Quân Y Cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình anh chị trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho trình học tập trường Cuối cùng, muốn nói lời cảm ơn sâu sắc đến Gia đình bạn bè động viên giúp đỡ để hoàn thành khóa học thực tốt luận văn này! Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Thị Thanh Mai DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AFB Acid Fast Bacilli BCG Bacille Calmette-Guérin (Trực khuẩn Calmette-Guérin ) Bp Base pairs (Cặp base) BSA Bovine Serum Albumin DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates DR Direct Repeat (Đoạn lặp lại trực tiếp) EDTA Ethylene Diamine Tetra Acid ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 10 GuSCN Guanidinium thiocyanate 11 IR Inverted Repeat (Đoạn lặp lại ngược chiều) 12 kDa kilo-Dalton 13 IS Insertion Sequence (Trình tự chèn) 14 LAM Lipoarabinomannan 15 MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube 16 MOTT Mycobacteria other than tuberculosis 17 MTBC Mycobacteria tuberculosis complex 18 M t Mycobacterium tuberculosis 19 OD Optical Density (Mật độ quang học) 20 ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở) 21 PBS Phosphat Buffer Saline 22 PCR Polymerase Chain Reaction 23 PCRRFLP Polymerase Chain Reaction - Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài đoạn giới hạn dựa PCR) 24 PE Proline-Glutamine 25 PDIM Phthiocerol dilycoserosates 26 PGL Phenolic glycolipids 27 RFLP 28 PGRS 29 PPD Purified Protein Derivative 30 PPD-S Purified Protein Derivative Standard 31 PPE Proline-Proline-Glutamine 32 RNA Ribonucleic acid 33 SDS Sodium dodecyl sulfate (NaDS - C12H25NaO4S) 34 SL Sulfolipids 35 TB Tuberculosis (vi khuẩn lao) 36 TBE Tris - Boric Acid - EDTA 37 UV Ultraviolet (tử ngoại) 38 XDR-TB Xtensively drug-resistant tuberculosis (Lao kháng đa thuốc mở rộng) 39 WHO World Health Organization (Tổ chức y tế giới) Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài đoạn giới hạn) Polymorphic GC-rich Repetitive Sequences (Trình tự lặp lại giầu G-C) [...]... huỷ hơn so với DNA 1.3.6 Các nghiên cứu về chẩn đoán phân tử vi khuẩn lao ở Vi t Nam và tạo kit PCR về chẩn đoán Ở Vi t Nam hiện nay phương pháp để phát hiện lao chủ yếu vẫn là nhuộm Ziehl - Neelsen và nuôi cấy trên môi trường Lowenstein Một số cơ sở trong nước đã áp dụng sinh học phân tử vào trong chẩn đoán lao, các cơ sở này mới chỉ sử dụng các kít chẩn đoán của công ty Nam Khoa nhằm vào nhân đoạn... và 23S rDNA trong nâng cao hiệu quả chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao [13, 14] 28 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Các chủng vi khuẩn lao Các chủng vi khuẩn gây bệnh lao (M tuberculosis complex) được thu thập từ các bệnh vi n Phạm Ngọc Thạch, Bệnh Vi n Đa Khoa TW Huế, Bệnh vi n Lao và Bệnh phổi TW Các chủng vi khuẩn ngoài lao (Mycobacterium other than tuberculosis... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu Tạo mPCR Chủng với 3 gen đích vi khuẩn MTBC và Bệnh phẩm MOTT Panel DNA chủng Tối ưu hóa DNA vi khuẩn phản ứng mPCR bệnh phẩm Đánh giá độ ổn Đánh giá hiệu quả định kit mPCR chẩn đoán trên bệnh phẩm lâm sàng Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và ngưỡng phát hiện Sơ đồ nghiên cứu 33 2.3.2 Tách chiết DNA 2.3.2.1 Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn lao Vi khuẩn được... Hoàng Văn Tổng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu, áp dụng các quy trình multiplex PCR khuyếch đại nhiều gen đích đặc trưng cho vi khuẩn lao vào chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao Với nghiên cứu này các tác giả đã tiến hành hoàn thiện quy trình PCR cho hai gen đích mới là IS 1081 và 23S rDNA dùng để chẩn đoán lao, và tiến hành nghiên cứu tối ưu hoá quy trình multiplex PCR đồng thời cho cả 3 gen đích IS1081,... biệt là các chủng phân lập được từ Đông Nam Á và Ấn Độ Các nghiên cứu cũng đã phát hiện trình tự IS1081 có ở tất cả các chủng M tuberculosis đã nghiên cứu và không tìm thấy ở các loài thuộc họ Mycobacterium khác Do đó IS1081 được đưa vào cho phản ứng PCR và multiplex PCR để phát hiện M tuberculosis đặc biệt là các chủng ở Đông Nam Á Ngoài ra còn có gen 23S rDNA và 16S rDNA là đoạn gen mã hóa cho các tiểu... Mycobacterium, phát hiện tính kháng thuốc và nghiên cứu dịch tễ học vi khuẩn lao Để chẩn đoán lao trình tự đích được sử dụng thường xuyên nhất là IS6110, đây là trình tự có ở hầu hết các chủng M tuberculosis 24 complex Ngoài ra người ta còn sử dụng các trình tự đích khác để chẩn đoán như IS1081, 23S rDNA, 16S rDNA Những nghiên cứu gần đây về các yếu tố DNA lặp lại trong vi khuẩn lao M tuberculosis có liên quan... Anh (2001) và Nguyễn Văn Hưng (2001) nghiên cứu về đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao và khả năng đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao [1, 8] Đã có nhiều tác giả trong nước tiến hành nghiên cứu về multiplex PCR như tác giả Phạm Hùng Vân (2006) và (2007), các nghiên cứu này tập trung vào các mầm bệnhkhác không phải vi khuẩn lao [17] Năm 2007 tại Học Vi n Quân Y các tác giả Nguyễn Thái Sơn, Hoàng... mẫu bệnh phẩm và soi dưới kính hiển vi có thể thu được kết quả trong vòng vài giờ Tuy nhiên số lượng vi khuẩn phải có từ 103 đến 104 vi khuẩn trên 1ml bệnh phẩm trở lên Chương trình chống lao quốc gia qui định đọc kết quả như sau: - 0 vi khuẩn / 300 vi trường: âm tính - 1-299 vi khuẩn / 300 vi trường = (+) - 1-10 vi khuẩn / 1 vi trường = ( ++ ) - > 10 vi khuẩn / 1 vi trường = ( +++ ) 20 Phương pháp... trong các nghiên cứu dịch tễ học vì nó có ở nhiều chủng vi khuẩn lao khác nhau Kĩ thuật PCR đã được chứng minh là công cụ hữu ích trong chẩn đoán nhanh các bệnh truyền nhiễm Một số xét nghiệm bằng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu loài cho phép phát hiện một loài hoặc một số loài Mycobacterium nhất định và nó cũng hữu ích trong vi c phát hiện và xác định các loài thuộc họ Mycobacterium 1.3.4.2 Kĩ thuật multiplex. .. là một trình tự đặc trưng ở vi khuẩn lao Nhiều tác giả đã nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR như tác giả Trần Thị Thanh Hoa và cộng sự (2005) đã sử dụng kết hợp phương pháp hoá sinh và PCR để xác định đa kháng thuốc của vi khuẩn lao [7] Tác giả Phan Thị Thu Hương và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn lao trong 27 môi trường bệnh vi n lao [9] Các tác giả Đặng Đức Anh