Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở việt nam

ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội loài người ngày phát triển, với bùng nổ đại dịch mà bật lao, HIV sốt rét Theo thống kê tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao chiếm 1/3 dân số giới Mỗi năm theo ước tính có khoảng triệu người mắc lao có khoảng triệu người chết lao, nhiên, tỷ lệ phát bệnh đạt 37% Như nhiều bệnh nhân mắc lao không phát chữa trị kịp thời, nguồn lây nhiễm khó kiểm soát Việt Nam đứng thứ 12 tổng số 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao lớn Thế giới, khu vực Tây Thái Bình Dương đứng thứ sau Trung Quốc Philippin [2, 10, 54] Ngày bệnh lao trở nên nguy hiểm tính kháng thuốc, đặc biệt lao kháng đa thuốc gây tử vong lớn, vậy, việc phát để điều trị sớm trở nên cần thiết Tuy nhiên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn Ở Việt Nam, phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen coi phổ biến Hạn chế phương pháp có khả phát trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, áp dụng phương pháp để sót nhiều bệnh nhân Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao môi trường Lowenstein-Jensen coi tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, nhiên phải đến tuần nuôi cấy cho kết Ngay môi trường nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC đến tuần, điều khó đáp ứng mục tiêu phát nhanh để kiểm soát bệnh lao [4, 18] Trước yêu cầu thiết đòi hỏi phải có phương pháp chẩn đoán đáp ứng hai yêu cầu nhanh xác Ngày phát triển mạnh mẽ sinh học phân tử tạo bước đột phá việc chẩn đoán lao Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử chẩn đoán lao rút ngắn thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống hai ngày với độ nhạy độ đặc hiệu cao, phương pháp cho phép phân biệt xác loài có khả gây bệnh lao phát khả kháng thuốc thông qua gen đặc trưng Hiện nay, giới số sở nước ứng dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn gen IS6110, trình tự đặc trưng vi khuẩn lao Tuy nhiên số nghiên cứu gần có chủng lao Đông Nam Á có Việt Nam có tỉ lệ định khuyết gen đích này, cụ thể IS6110 có tỷ lệ khuyết từ 5% đến 8% [25, 30, 32 40] Một số nghiên cứu đề xuất chọn gen đích khác IS1081 23S rDNA thay cho gen đích IS6110 chưa có nghiên cứu rộng khắp chủng lao Việt Nam để khẳng định có hay không tượng khuyết gen đích, có tỷ lệ Điều quan trọng khuyết gen đích phản ứng PCR nhằm vào gen giá trị chẩn đoán Nghiên cứu gen đích đồng thời góp phần xây dựng nên hoàn thiện việc xác định đặc điểm phân tử vi khuẩn lao Việt Nam [13, 30] Nhận thấy vấn đề có vai trò quan trọng hướng phát triển sinh học phân tử việc chẩn đoán lao để thiết kế kit PCR phù hợp với đặc điểm riêng chủng lao nước để tránh trường hợp bỏ sót bệnh nhân Từ vấn đề tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định số đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn lao Việt Nam” Đề tài tiến hành khảo sát số lượng lớn chủng vi khuẩn lao thu thập ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam với hai mục tiêu sau: Xác định tỷ lệ xuất trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 23S rDNA chủng vi khuẩn lao So sánh tỷ lệ xuất trình tự IS6110, IS1081 23S rDNA chủng lao ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam Chương TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1 Tình hình bệnh lao gới Lao bệnh truyền nhiễm Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo tình trạng khẩn cấp toàn cầu bệnh Hiện nay, bệnh lao khuyến cáo ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm giới với hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS sốt rét Hiện có tới tỷ người nhiễm lao chiếm gần 1/3 dân số giới, năm có khoảng triệu bệnh nhân phát triệu người chết lao [2] Tình hình diễn biến xấu nước phát triển, nơi chiếm 95% số người mắc lao Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân tử vong nước Khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 quốc gia có gánh nặng bênh tật cao Đặc biệt năm gần tình hình lao đồng nhiễm với HIV – AIDS lao kháng thuốc lên vấn đề nhức nhối, đặc biệt nước phát triển, điều đòi hỏi vào toàn xã hội Theo thống kê năm 2005 toàn giới có gần 8,8 triệu người mắc bệnh lao dẫn tới 1,6 triệu người bị chết Khoảng 95% số bệnh nhân lao 98% số người chết lao nước có thu nhập vừa thấp, 75% số bệnh nhân lao nam nữ độ tuổi lao động Trong có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao [54, 69] Vào năm 2007, WHO ước tính khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao chiếm 34% toàn giới Thông báo gần năm 2007 WHO cho biết bệnh lao bước đầu ổn định giảm vùng giới Tuy nhiên số lượng ca nhiễm toàn cầu tăng lên tập trung khu vực châu Phi, Đông Địa Trung Hải Đông Nam Á Tình hình cho thấy bệnh lao mối nguy hại hàng đầu loài người [54] 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam Theo đánh giá WHO, Việt Nam đứng hàng thứ 12 22 nước có số bệnh nhân lao cao giới Tại khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ sau Trung Quốc Phillipin Tỷ lệ mắc bệnh lao Việt Nam cao 1,6 lần so với ước tính WHO, nghĩa có khoảng 150.000 bệnh nhân lao thể Theo WHO Việt Nam nước có gánh nặng bệnh lao cao với khoảng 44% dân số nhiễm lao Trong tỷ lệ lao mắc thể 173/100.000 dân, tỷ lệ mắc thể 225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV bệnh nhân lao 5% [2] Theo báo cáo Chương trình Phòng chống lao quốc gia, hàng năm Việt Nam phát điều trị khoảng 100.000 bệnh nhân lao, 65% lao phổi tập trung vùng đông dân cư thành phố lớn Bệnh lao Việt Nam có xu hướng trẻ hóa, nhiều niên người độ tuổi lao động mắc lao Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao Quốc Gia phát 532.703 bệnh nhân lao thể, tỷ lệ phát ước tính đạt 82% số bệnh nhân Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 9, 42] Đáng ngại tỷ lệ lao kháng thuốc Việt Nam, tỷ lệ lao kháng đa thuốc bệnh nhân lao 2,7% tỷ lệ lao kháng đa thuốc số bệnh nhân điều trị lại 19% Nguy nhiễm lao hàng năm nước ta ước tính 1,5% [2] Những năm gần việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử PCR vào chẩn đoán lao mang lại nhiều kết khả quan, với kĩ thuật rút ngắn thời gian chẩn đoán cho độ xác cao Tuy cần có nghiên cứu nhằm hiểu rõ đặc điểm phân tử vi khuẩn lao nhằm hoàn thiện kĩ thuật chẩn đoán lao phương pháp phân tử 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LAO 1.2.1 Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, Actinomycetales, phân Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium Vi khuẩn lao có tên khoa học là: Mycobacterium tuberculosis [15] Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium chia làm nhóm • Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm: M tuberculosis, M bovis, M africanum, M microti Trong M tuberculosis M bovis gây bệnh lao điển hình • Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm: M avium, M ortuitum, M govdovac, M kansasii Nhóm không gây bệnh lao 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc 1.2.2.1 Cấu trúc hình thái Vi khuẩn lao phát Robert Koch khoảng 100 năm trước Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dày 0,3 µm Khi nhuộm Ziel-Nellsen trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, không bị cồn axit làm màu fucsin, chúng gọi trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli-AFB) Đây đặc điểm bật Mycobacteria giúp phát vi khuẩn lao mẫu bệnh phẩm Trực khuẩn lao dịch huyền phù trì tính kháng axit khoảng thời gian dài kể chịu tác dụng nhiệt Trực khuẩn lao có khả thực tất chế cần thiết để tổng hợp vitamin, axit amin enzyme co-factor thiết yếu cho tế bào [3, 4, 5, 10] Hình 1.1 Trực khuẩn M tuberculosis Hình 1.2 Trực khuẩn M tuberculosis [55] sau nhuộm Ziehl – Nielsen [55] 1.2.2.2 Cấu trúc thành tế bào Cấu trúc thành tế bào M tuberculosis chia thành lớp, nhờ giúp bảo vệ tế bào khỏi áp suất thẩm thấu, kiểm soát đường hoà tan tế bào chất môi trường Lớp cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu phospholipid Các phân tử phospholipid bao gồm hai nhóm, nhóm ưa nước hướng bên nhóm kị nước hướng bên ngoài, quay phía vỏ [1] Màng sinh chất mycobacteria điều hoà thẩm thấu nguyên sinh chất môi trường, màng chứa protein có chức khác phân tử nhạy với nồng độ phân tử môi trường, protein truyền tín hiệu đến máy trao đổi chất di truyền nguyên sinh chất, enzyme liên quan đến trình trao đổi chất sinh lượng, chất mang làm trung gian cho vận chuyển chất dinh dưỡng ion Các enzyme xuyên màng tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn phân chia tế bào, tập hợp tiết số protein ngoại bào, chép DNA [3, 4, 11] Lớp peptidoglican liên kết với đường arabinose phân tử axit mycolic tạo nên khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ vi khuẩn có độ cứng định [1] Thành tế bào Mycobacteria cấu trúc phức tạp biết prokaryote, có số thành phần hoá học nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết peptidoglycan thành tế bào M tuberculosis 70-80% E coli 20-30% [45] Lớp lớp tạo nên liên kết axit mycolic lipid phức tạp, lớp tạo nên độc tính vi khuẩn lao có cấu trúc làm tăng khả chống thấm nước thành vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn lâu với môi trường bên ngoài, chống khả bị huỷ diệt đại thực bào tế bào miễn dịch [1] Bám với peptidoglycan polysaccharide phân nhánh, arabinogalactan, đầu phân tử ester hoá với axit béo có khối lượng phân tử cao axit mycolic Sự xếp axit mycolic có tính đặc hiệu loài cho phép xác định loài mycobacteria sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu cao, sắc ký khí-lỏng Các axit mycolic đặc hiệu M tuberculosis alpha-keto mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 83 đến 90 carbon Lớp thành tế bào có phân tử lipid tự phthiocerol dimycoserosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids sulfolipids (SL) Nằm ngang qua toàn lớp màng số glycolipid phosphatidylmyoinositol mannosides, lipomannan (LM) lipoarabinomannan (LAM), đính vào màng sinh chất mở rộng bên thành tế bào LAM có tính đặc hiệu loài Thành tế bào mycobacteria chứa protein nằm rải rác, vài protein có tác dụng cấu trúc thành tế bào, số protein porin hình thành kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực chất tan nước thông qua lớp axit mycolic Porin mycobacteria khác so với vi khuẩn Gram âm [44, 51] Lớp có cấu trúc peptidoglycolipid, lớp thấy vi khuẩn lao phát triển bên tế bào, có tác dụng tăng cường lớp áo giáp cho vi khuẩn nằm tế bào chống enzyme phân giải từ lysozyme tế bào [1] Khi phát triển môi trường nuôi cấy lỏng đại thực bào, M tuberculosis tích luỹ capsule giả không bám Thành phần capsule chứa protein, polysaccharide lượng nhỏ lipid Cấu thành capsule bung in vivo bên đại thực bào Màng tế bào vi khuẩn lao gây bệnh đa phần giống với màng mycobacteria giống bao gồm mycobacteria không gây bệnh Màng tế bào vi khuẩn lao cấu trúc linh động thay đổi phát triển tồn môi trường khác Trong điều kiện thiếu oxy thành tế bào dày lên, biểu gen mã hoá cho porin dường điều hoà ngược điều kiện môi trường định môi trường nuôi cấy axit nhẹ khoang đại thực bào Ngoài hình thành cấu trúc cord liên quan đến Trehalose 6, 6’dimycolate glycolipid chứa hai phân tử axit mycolic bám lỏng lẻo lớp thành tế bào Rất nhiều hoạt tính sinh học liên quan đến khả gây bệnh, tính sinh độc tố bảo vệ chống lại đáp ứng tế bào chủ [3, 4, 11] Ở điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao tồn đến tháng Trong điều kiện phòng thí nghiệm vi khuẩn lao bảo quản nhiều năm Tuy nhiên ánh sáng mặt trời trực tiếp sau phút vi khuẩn lao bị tiêu diệt Dưới ánh sáng tia cực tím, vi khuẩn lao tồn đến phút Ở nhiệt độ 42o C vi khuẩn lao ngừng phát triển, nhiệt độ 80o C vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8] 1- Lipid 2- Axit mycolic 3- polysaccharides (arabinogalactan) 4- peptidoglycan 5- màng sinh chất 6- lipoarabinomannan (LAM) 7- phosphatidylinositol mannoside 8- Khung thành tế bào Hình 1.3 Thành tế bào Mycobacteria [http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram.pn] 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy Trực khuẩn lao vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc điều kiện kị khí Nhiệt độ thích hợp để mọc 37oC Hầu không mọc nhiệt độ 37oC 42oC Vi khuẩn lao phát triển môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng, chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit Môi trường thường dùng môi trường đặc Loewenstein cải tiến Jensen; (hoặc môi trường lỏng Sauton) Trực khuẩn lao vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau hình thành khuẩn lạc điển hình, dạng R 10 KẾT LUẬN Tỷ lệ khuyết gen đích Việt Nam Tỷ lệ khuyết IS6110 = (12/750) × 100% = 1,6% Tỷ lệ khuyết IS1081 = (1/750) × 100% = 0,133% Tỷ lệ khuyết 23S rDNA = (1/750) × 100% =0,133% Tỷ lệ khuyết gen đích ba miền • Tỷ lệ khuyết gen đích miền Bắc Tỷ lệ mẫu không xuất IS6110 = (0/200) × 100% = 0% Tỷ lệ mẫu không xuất IS1081 = (0/200) × 100% = 0% Tỷ lệ mẫu không xuất 23S rDNA = (0/200) × 100% = 0% • Tỷ lệ khuyết gen đích miền Trung Tỷ lệ mẫu khuyết IS6110 = (9/300) × 100% = 3% Tỷ lệ mẫu khuyết IS1081 = (1/300) × 100% = 0,33% Tỷ lệ mẫu khuyết 23S rDNA = (1/300) × 100% = 0,33% • Tỷ lệ khuyết gen đích miền Nam Tỷ lệ mẫu khuyết IS6110 = (3/250) × 100% = 1,2% Tỷ lệ mẫu khuyết IS1081 = (0/250) × 100% = 0% Tỷ lệ mẫu khuyết 23S rDNA = (0/250) × 100% =0 % KIẾN NGHỊ Cần xây dựng kit chẩn đoán lao multiplex PCR với ba gen đích IS6110, IS1081 23S rDNA chẩn đoán lao Việt Nam để tránh bỏ sót bệnh nhân 53 TÀI TIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao, Luận án Tiến sỹ Sinh học Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2005), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005 Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Học viện quân y Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hoà (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Trần Thị Thanh Hoa, Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2005), Sử dụng kết hợp hai phương pháp hoá sinh PCR để xác định đa kháng thuốc M tuberculosis, Hội nghị khoa học toàn quốc công nghệ sinh học, Tháng 12/2005 Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập Viện lao Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ Y học Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng nghiên cứu Lao Việt Nam, Hội thảo sinh học phân tử bệnh lao, Đại học Quốc gia Hà Nội, Tháng 8/2007 10 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền ứng dụng, NXB Giáo dục 11 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị, NXB Giáo dục 54 12 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ cộng (2007), “Hoàn thiện qui trình PCR hai gen IS1081 23Sr ADN nâng cao hiệu chẩn đoán lao”, Tạp chí Y Dược Học Quân Sự , 32(2), p 31-37 13 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007), “Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31 14 Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật 15 Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao Bệnh phổi sau đại học, Học Viện Quân Y Tiếng Anh 16 Abbas Bahador, (2005) “Performance Assessment of IS1081-PCR for Direct Detection of Tuberculous Pleural Effusion:Compared to rpoBPCR”, Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 1(2): 142-145 17 Alcaide F., M A Benitez, J M Escriba, R Martin (2000), “Evaluation of the BACTEC MGIT 969 and thi MB/BacT systems for recovery of Mycobacteria from clinical specimens and for species identification by DNA AccuProbe”, J Clin Microbiol 38, 398-401 18 Andersen A.B., Thybo S., R Godfrey-Faussett, Stoker N.G (1993), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum” Eur J Clin Microbio! Infect Dis, 12 (12), 922-927 55 19 Ahuja G K., Mohan K K., Prasad K., Behari M (1994), “Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation”, Tuber Lung Dis 75, 149-152 20 Bhattacharya B et al (2003), “Development of a new sensitive and efficient multiplex polymerase chain reaction (PCR) for identification and differentiation of defferent Mycobacteria species”, Tropical Medicine and International Health, (2), 150-157 21 Clarrridge JE III, Shawar RM, Shinnck TM, Plikaytis BB (1993), “Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory”, J Clin Microbiol, 31, 2041-56 22 Cole S T et al (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature, 393, 537-544 23 Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence, IS1081, in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 11-15 24 Das R H., Chander M A (1995), “A rapid and gentle method for the isolation of genomic DNA from mycobacteria”, Nucl Acids Res.21: 2529-2530 25 Dick Van Soolingen, Lishi Qian et al (1995), “Predominance of a single Genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia”, Journal of clinical Microbiology, p 3234 – 3238 26 Down J A., Walters A H., Dey M S., Howard D R., Little M C., Keating W E (1996), “Sample processing method for Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent 5554503 27 David H Persing et al (1993), “Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications”, American Society for Microbiology, 51-172 56 28 Elnifro E M et al (2000), “Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology”, Oct, 2000, p 559-570 29 Espitia C et al (1999), “The PE-PGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-binding proteins”, Microbiology, 145, 3487–3495 30 Ernesto Liebana et el (1996), “Assessment of Genetic Markers for Species Differentiation within the Mycobacteria tuberculosis complex”, Vol 34, No 4, p933-938 31 Forbes BA, Hicks KES (1993), “Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction”, J Microbiol 31: 1688-94 32 Fomukong NG, Tang TH et al (1994), “Insertion sequence typing of Mycobacterium tuberculosis: characterization of a widespread subtype with a single copy of IS6110”, Tuber Lung Dis, 75: 435 -440 33 Goyal et al (1996), “Rapid detection of multidrug – resistant tuberculosis”, Eur Respir, 1997, 10, p1120 – 1124 34 Henegariu O., N A Heerema, S R Dlouhy, G H Vance, P H Vogt (1997), “Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol”, BioTechniques 23, 504-511 35 Henegariu, O., P Hirschmann, K Kilian, S Kirsch, C Lengauer, R Maiwald, K Mielke and P Vogt (1994) “Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis”, Andrologia, 26, 97106 36 Kamerbeek J et al (1997), “Simultaneous Detection and Strain Differentiation of Mycobacterium tuberculosis for Diagnosis and Epidemiology”, Journal of Clinical Microbiology, Apr 1997, 907-914 57 37 Kubica GP, Dye WE, Cohn ML, Middlebrook C (1963), “Sputum degestion and decontamination with N-Acetyl-Lsysteine-sodium hydroxide for culture of bacteria”, American Review of Respiratory Diseases, 87, 775-779 38 Kurabachew M et al (2004), “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus-, group- and species-specific detection of Mycobacteria”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 49, 99-104 39 Kurabachew M., Sandaad R A., Engere, Bjorvatna B., (2003), “Sequence analysis in the 23S rDNA region of Mycobacterium tuberculosis and related species”, Journal of Microbiological Methods, 54, 373 - 380 40 Lilly K W Yuen et al (1993), “Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains from Vietnames patients by southern Blot Hybridization”, Journal of clinical Microbiology, p 1615-1618 41 Mekonnen Kurabacchew et al (2004) “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus-, group- and species-specific detection of mycobacteria” Diagn Microbiol Infect Dis, 49(2), 99-104 42 Musser J M (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria : Molecular genetic insights”, Clinical Microbiology Reviews, (4), 496-514 43 Mustafa A.S., Abal A.T and Chugh T.D (1999), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex and non-tuberculous Mycobacteria by multiplex polymerase chain reactions”, Eastern Mediterranean Health Journal, 5(1), 61-70 44 Nguyen L N., Kox L F., Pham L D., Kuijper S., Kolk A H (1996), “The potential contribution of the polymerase chain reaction to the diagnosis of tuberculous meningitis”, Arch Neurol 53, 771-776 45 Palomino J C., S C Leão, V Ritacco (2007), Tuberculosis 2007 From basic science to patient care”, www.TuberculosisTextbook.com 58 46 Schlossberg D (2006), “Tuberculosis and nontuberculous Mycobacteria l infections Fifth edition”, Medical Publishing Division 47 Seth P., Ahuja G K., Bhanu N V., Behari M., Bhowmilk S., Broor S., Dar L., Chakraborty M (1996), “Evaluation of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of clinically suspected tuberculous meningitis”, Tuber Lung Dis, 77, 353-357 48 Sechi L A et al (1997), “Detection of Micobacterium tuberculosis by PCR analysis of urine and other clinical samples from AIDS and nonHIV-infected patients”, Molecular and Cellular Probes, 11, 281-285 49 Sjobring ULF, M Mecklenburg, A B Andersen, H Miorner (1990), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, Oct 1990, 28 (10), 2200-2204 50 Smith I (2003), “Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence”, Journal of Clinical Microbiology, 16 (3), 463-496 51 Tanaka I I., Anno I K et al (2003), “Comparison of a Multiplex PCR Assay with Mycolic Axits Analysis and conventional Methods for the Identification of Mycobacteria ”, Microbiol Immunol, 47(5), 307-312 52 Thierry D., A Brisson-Noel et al (1990), “Characterization of a Mycobacterium tuberculosis Insertion Sequence, IS6110, and Its Application in Diagnosis”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (12), 2668-2673 53 Van Soolingen D, Hermans PWM, de Haas PEW, Soll DR, Van Embden JDA (1991), “Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains; evaluation of an insertion sequence dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, 29, 2578-2586 59 54 Sample size determination in health studies, World Health Organization, Geneva, 1991, pp – 16 Website: 55 www.who.int/Fact 56 http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis 60 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1 Tình hình bệnh lao gới 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LAO 1.2.1 Đặc điểm phân loại 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 10 1.2.4 Hệ gen vi khuẩn lao 12 1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO 20 1.3.1 Phương pháp soi trực tiếp 20 1.3.2 Phương pháp nuôi cấy 20 1.3.3 Sinh học phân tử chẩn đoán lao 21 1.3.4 Một số nghiên cứu tỷ lệ khuyết gen M.tuberculosis giới 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 24 2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Các hóa chất thiết bị 25 2.2.2 Các cặp mồi sử dụng phát gen đích 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 29 2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 30 2.3.3 Các kĩ thuật sử dụng nghiên cứu 31 2.4 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN CÁC CHỦNG LAO Ở VIỆT NAM 38 3.1.1 Kết tách chiết DNA 38 3.1.2 Kết phát gen đích đặc trưng vi khuẩn lao 40 3.1.3 Tỷ lệ khuyết trình tự gen đích Việt Nam 49 3.2 SO SÁNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN BA MIỀN BẮC TRUNG NAM TẠI VIỆT NAM 50 3.2.1 So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS6110 ba miền Bắc Trung Nam 50 3.2.2 So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS1081 chủng lao ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam 51 3.2.3 So sánh tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam 51 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 53 TÀI TIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Các sinh phẩm hóa chất chất 26 2.2 Các máy thiết bị 27 2.3 Trình tự cặp mồi dùng nghiên cứu 28 2.4 Chu kì nhiệt cho phản ứng multiplex PCR 33 2.5 Thành phần phản ứng 33 2.6 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 34 2.7 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 35 2.8 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi 23S rDNA 35 3.1 Kết tách chiết DNA số chủng lao Bệnh viện Lao Bệnh phổi Trung Ương 39 3.2 Kết tách chiết DNA số chủng lao Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Huế 39 3.3 Kết tách chiết DNA số chủng lao Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch 39 3.4 Kết phát gen đích đặc trưng chủng lao miền Bắc 41 3.5 Kết phát gen đích miền Trung 46 3.6 Kết phát gen đích số chủng lao miền Nam 48 3.7 Kết kiểm tra tượng khuyết gen Việt Nam 49 3.8 Tỷ lệ khuyết gen IS6110 ba miền Bắc Trung Nam 50 3.9 Tỷ lệ khuyết gen IS1081 ba miền Bắc Trung Nam 51 3.10 Tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ba miền Bắc Trung Nam 52 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.1 Trực khuẩn M tuberculosis 1.2 Trực khuẩn M tuberculosis sau nhuộm Ziehl – Nielsen 1.3 Thành tế bào Mycobacteria 10 1.4 Khuẩn lạc M tuberculosis môi trường Lowenstein - Jensen 11 1.5 Hệ gen vi khuẩn lao 12 1.6 Cấu trúc IS 15 1.7 copy IS6110 hệ gen M tuberculosis 17 3.1 Kết phát gen đích đặc trưng số chủng lao Miền Bắc 40 3.2 Kết phát gen đích chủng lao miền Trung 42 3.3 Kết phát khuyết gen IS6110 chủng lao miền Nam 42 3.4 Kết kiểm tra PCR đơn với mẫu nghi khuyết IS6110 miền Trung 43 3.5 Kết phát mẫu khuyết IS1081 miền Trung 44 3.6 Kết kiểm tra PCR với 1mẫu khuyết IS1081 miền Trung 44 3.7 Kết phát mẫu khuyết 23S rDNA miền Trung 45 3.8 Kết kiểm tra PCR với 1mẫu khuyết 23S rDNA miền Trung 46 3.9 Kết phát mẫu khuyết IS6110 chủng lao miền Nam 47 3.10 Kết kiểm tra PCR với mẫu khuyết IS6110 miền Nam 48 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1.AFB: Acid Fast Bacilli BCG: Bacille Calmette-Guérin (Trực khuẩn Calmette-Guérin) bp : Base pairs (cặp base) DNA: Deoxyribonucleic acid dNTPs: Deoxynucleotide triphophates DR: Direct Repeat (Đoạn lặp lại trực tiếp) EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acid GuSCN: Guanidinium thiocyanate IR: Inverted Repeat (Đoạn lặp lại ngược chiều) 10 kDa: Kilo – Dalton 11 IS: Insertion Sequence (Trình tự chèn) 12 LAM: Lipoarabinomannan 13 MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube 14 MTBC: Mycobacteria tuberculosis complex 15.MOTT: Mycobacteria other than tuberculosis 16 OD: Optical Density (Mật độ quang học) 17 ORF: Open Reading Frame (Khung đọc mở) 18 PCR: Polymerase Chain Reaction 19 PCR-RFLP: Polymerase Chain Reacion – Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài đoạn giới hạn dựa PCR) 20 PE: Proline – Glutamine 21 PGL: Phenolic glycolipids 22 PGRS: Polymophic GC – rich Repetive Sequences (Trình tự lặp lại giàu G-C) 23 RNA: Ribonucleic acid 24 TB: Tuberculosis (Bệnh lao) 25 TBE: Tris – Boric Acid – EDTA 26 UV: Ultraviolet (tia tử ngoại) 27 WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) LỜI CẢM ƠN Lời xin bày lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS TS Nguyễn Thái Sơn, người truyền dạy trang bị kiến thức quý báu, cung cấp nhiều tài liệu tạo điều kiện thuận lợi hoàn thành tốt đề tài luận văn Trong suốt thời gian học thực đề tài luận văn Phòng Vi sinh vật mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y quan tâm giúp đỡ ân cần hướng dẫn tận tình thầy Nhân dịp lần xin gửi lời cảm ơn, lời chúc chân thành tới thầy gia đình Bên cạnh xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy, cô Bộ môn Vi sinh vật, Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Các thầy cô nhiệt thành trang bị kiến thức khoa học sống suốt thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y, đặc biệt thành viên Phòng Vi sinh vật mầm bệnh sinh học giúp đỡ tạo điều kiện tốt để học tập hoàn thành tốt luận văn Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên, khích lệ giúp đỡ tạo điều kiện tốt để học tập hoàn thành luận văn Mặc dù cố gắng để hoàn thành luận văn này, chắn không tránh khỏỉ sai xót, mong tận tình dẫn góp ý quý thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 22 tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Thị Hạnh [...]... gen ở vi khuẩn lao ở Vi t Nam Thống kê kết quả khuyết những gen đặc trưng như IS6110, IS1081 và 23S rDNA ở vi khuẩn lao ở Vi t Nam 29 2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu Vi khuẩn lao Tách DNA Kiểm tra lại bằng PCR Multiplex PCR đồng đơn mồi với mẫu khuyết thời 3 gen đích gen Xác định tỷ lệ khuyết So sánh tỷ lệ khuyết gen ở của từng gen đích ba miền Bắc – Trung – Nam Đặc điểm khuyết gen ở các chủng lao ở Vi t Nam. .. với quần thể nghiên cứu là chủng vi khuẩn lao phân lập trên cả 3 miền của Vi t Nam và thông số nghiên cứu là tỷ lệ xuất hiện các gen đích đặc trưng phục vụ cho chẩn đoán của quần thể chủng vi khuẩn lao ở Vi t Nam 2.3.1.1 Kiểm tra tỷ lệ khuyết IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc Trung Nam bằng phản ứng multiplex PCR Các chủng lao của ba miền Bắc Trung Nam được tách DNA và chạy... lượng bản sao của nó Ở một số vùng số lượng bản copy IS6110 thấp (