Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)

Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - NGUYỄN THỊ HẠNH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 12 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO 12 1.1.1 Tình hình bệnh lao gới 12 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam 13 1.2 ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN LAO 14 1.2.1 Đặc điểm phân loại 14 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc 14 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 18 1.2.4 Hệ gen vi khuẩn lao 20 1.3 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO 28 1.3.1 Phƣơng pháp soi trực tiếp 28 1.3.2 Phƣơng pháp nuôi cấy 28 1.3.3 Sinh học phân tử chẩn đoán lao 29 1.3.4 Một số nghiên cứu tỷ lệ khuyết gen M.tuberculosis giới 31 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 32 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 32 2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Các hóa chất thiết bị 33 2.2.2 Các cặp mồi đƣợc sử dụng phát gen đích 35 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 29 2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 38 2.3.3 Các kĩ thuật sử dụng nghiên cứu 39 2.4 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 45 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN CÁC CHỦNG LAO Ở VIỆT NAM 46 3.1.1 Kết tách chiết DNA 46 3.1.2 Kết phát gen đích đặc trƣng vi khuẩn lao 48 3.1.3 Tỷ lệ khuyết trình tự gen đích Việt Nam 57 3.2 SO SÁNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN BA MIỀN BẮC TRUNG NAM TẠI VIỆT NAM 58 3.2.1 So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS6110 ba miền Bắc Trung Nam 58 3.2.2 So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS1081 chủng lao ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam 59 3.2.3 So sánh tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam 59 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 61 TÀI TIỆU THAM KHẢO 62 DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Các sinh phẩm hóa chất chất 34 2.2 Các máy thiết bị 35 2.3 Trình tự cặp mồi dùng nghiên cứu 36 2.4 Chu kì nhiệt cho phản ứng multiplex PCR 41 2.5 Thành phần phản ứng 41 2.6 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 42 2.7 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 43 2.8 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi 23S rDNA 43 3.1 Kết tách chiết DNA số chủng lao Bệnh viện Lao Bệnh phổi Trung Ƣơng 47 3.2 Kết tách chiết DNA số chủng lao Bệnh viện Đa khoa Trung Ƣơng Huế 47 3.3 Kết tách chiết DNA số chủng lao Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch 47 3.4 Kết phát gen đích đặc trƣng chủng lao miền Bắc 49 3.5 Kết phát gen đích miền Trung 54 3.6 Kết phát gen đích số chủng lao miền Nam 56 3.7 Kết kiểm tra tƣợng khuyết gen Việt Nam 57 3.8 Tỷ lệ khuyết gen IS6110 ba miền Bắc Trung Nam 58 3.9 Tỷ lệ khuyết gen IS1081 ba miền Bắc Trung Nam 59 3.10 Tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ba miền Bắc Trung Nam 60 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1.1 Trực khuẩn M tuberculosis 15 1.2 Trực khuẩn M tuberculosis sau nhuộm Ziehl – Nielsen 15 1.3 Thành tế bào Mycobacteria 18 1.4 Khuẩn lạc M tuberculosis môi trƣờng Lowenstein - Jensen 19 1.5 Hệ gen vi khuẩn lao 20 1.6 Cấu trúc IS 23 1.7 copy IS6110 hệ gen M tuberculosis 25 3.1 Kết phát gen đích đặc trƣng số chủng lao Miền Bắc 48 3.2 Kết phát gen đích chủng lao miền Trung 50 3.3 Kết phát khuyết gen IS6110 chủng lao miền Nam 50 3.4 Kết kiểm tra PCR đơn với mẫu nghi khuyết IS6110 miền Trung 51 3.5 Kết phát mẫu khuyết IS1081 miền Trung 52 3.6 Kết kiểm tra PCR với 1mẫu khuyết IS1081 miền Trung 52 3.7 Kết phát mẫu khuyết 23S rDNA miền Trung 53 3.8 Kết kiểm tra PCR với 1mẫu khuyết 23S rDNA miền Trung 54 3.9 Kết phát mẫu khuyết IS6110 chủng lao miền Nam 55 3.10 Kết kiểm tra PCR với mẫu khuyết IS6110 miền Nam 56 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1.AFB: Acid Fast Bacilli BCG: Bacille Calmette-Guérin (Trực khuẩn Calmette-Guérin) bp : Base pairs (cặp base) DNA: Deoxyribonucleic acid dNTPs: Deoxynucleotide triphophates DR: Direct Repeat (Đoạn lặp lại trực tiếp) EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acid GuSCN: Guanidinium thiocyanate IR: Inverted Repeat (Đoạn lặp lại ngƣợc chiều) 10 kDa: Kilo – Dalton 11 IS: Insertion Sequence (Trình tự chèn) 12 LAM: Lipoarabinomannan 13 MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube 14 MTBC: Mycobacteria tuberculosis complex 15.MOTT: Mycobacteria other than tuberculosis 16 OD: Optical Density (Mật độ quang học) 17 ORF: Open Reading Frame (Khung đọc mở) 18 PCR: Polymerase Chain Reaction 19 PCR-RFLP: Polymerase Chain Reacion – Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài đoạn giới hạn dựa PCR) 20 PE: Proline – Glutamine 21 PGL: Phenolic glycolipids 22 PGRS: Polymophic GC – rich Repetive Sequences (Trình tự lặp lại giàu G-C) 23 RNA: Ribonucleic acid 24 TB: Tuberculosis (Bệnh lao) 25 TBE: Tris – Boric Acid – EDTA 26 UV: Ultraviolet (tia tử ngoại) 27 WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) LỜI CẢM ƠN Lời xin bày lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS TS Nguyễn Thái Sơn, người truyền dạy trang bị kiến thức quý báu, cung cấp nhiều tài liệu tạo điều kiện thuận lợi hoàn thành tốt đề tài luận văn Trong suốt thời gian học thực đề tài luận văn Phòng Vi sinh vật mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y quan tâm giúp đỡ ân cần hướng dẫn tận tình thầy Nhân dịp lần xin gửi lời cảm ơn, lời chúc chân thành tới thầy gia đình Bên cạnh xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy, cô Bộ môn Vi sinh vật, Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Các thầy cô nhiệt thành trang bị kiến thức khoa học sống suốt thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y, đặc biệt thành viên Phòng Vi sinh vật mầm bệnh sinh học giúp đỡ tạo điều kiện tốt để học tập hoàn thành tốt luận văn Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên, khích lệ giúp đỡ tạo điều kiện tốt để học tập hoàn thành luận văn Mặc dù cố gắng để hoàn thành luận văn này, chắn không tránh khỏỉ sai xót, mong tận tình dẫn góp ý quý thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 22 tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Thị Hạnh ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội loài ngƣời ngày phát triển, với bùng nổ đại dịch mà bật lao, HIV sốt rét Theo thống kê tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao chiếm 1/3 dân số giới Mỗi năm theo ƣớc tính có khoảng triệu ngƣời mắc lao có khoảng triệu ngƣời chết lao, nhiên, tỷ lệ phát bệnh đạt 37% Nhƣ nhiều bệnh nhân mắc lao không đƣợc phát chữa trị kịp thời, nguồn lây nhiễm khó kiểm soát Việt Nam đứng thứ 12 tổng số 22 nƣớc có tỉ lệ nhiễm lao lớn Thế giới, khu vực Tây Thái Bình Dƣơng đứng thứ sau Trung Quốc Philippin [2, 10, 54] Ngày bệnh lao trở nên nguy hiểm tính kháng thuốc, đặc biệt lao kháng đa thuốc gây tử vong lớn, vậy, việc phát để điều trị sớm trở nên cần thiết Tuy nhiên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn Ở Việt Nam, phƣơng pháp nhuộm Ziehl - Neelsen đƣợc coi phổ biến Hạn chế phƣơng pháp có khả phát trƣờng hợp số lƣợng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, áp dụng phƣơng pháp để sót nhiều bệnh nhân Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn lao môi trƣờng Lowenstein-Jensen đƣợc coi tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, nhiên phải đến tuần nuôi cấy cho kết Ngay môi trƣờng nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC đến tuần, điều khó đáp ứng đƣợc mục tiêu phát nhanh để kiểm soát bệnh lao [4, 18] Trƣớc yêu cầu thiết đòi hỏi phải có phƣơng pháp chẩn đoán đáp ứng đƣợc hai yêu cầu nhanh xác Ngày phát triển mạnh mẽ sinh học phân tử tạo bƣớc đột phá việc chẩn đoán lao Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử chẩn đoán lao rút ngắn thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống hai ngày với độ nhạy độ đặc hiệu cao, phƣơng pháp cho phép phân biệt xác loài có khả gây bệnh lao nhƣ phát khả kháng thuốc thông qua gen đặc trƣng Hiện nay, giới số sở nƣớc ứng dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn gen IS6110, trình tự đặc trƣng vi khuẩn lao Tuy nhiên số nghiên cứu gần có chủng lao Đông Nam Á có Việt Nam có tỉ lệ định khuyết gen đích này, cụ thể IS6110 có tỷ lệ khuyết từ 5% đến 8% [25, 30, 32 40] Một số nghiên cứu đề xuất chọn gen đích khác IS1081 23S rDNA thay cho gen đích IS6110 nhƣng chƣa có nghiên cứu rộng khắp chủng lao Việt Nam để khẳng định có hay không tƣợng khuyết gen đích, có tỷ lệ Điều quan trọng khuyết gen đích phản ứng PCR nhằm vào gen giá trị chẩn đoán Nghiên cứu gen đích đồng thời góp phần xây dựng nên hoàn thiện việc xác định đặc điểm phân tử vi khuẩn lao Việt Nam [13, 30] Nhận thấy vấn đề có vai trò quan trọng hƣớng phát triển sinh học phân tử việc chẩn đoán lao để thiết kế kit PCR phù hợp với đặc điểm riêng chủng lao nƣớc để tránh trƣờng hợp bỏ sót bệnh nhân Từ vấn đề tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định số đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn lao Việt Nam” Đề tài tiến hành khảo sát số lƣợng lớn chủng vi khuẩn lao đƣợc thu thập ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam với hai mục tiêu sau: 10 3.1.2.3 Kết phát gen đích chủng lao miền Nam Chúng tiến hành kiểm tra 250 mẫu lao bệnh viện Phạm Ngọc Thạch phản ứng multiplex PCR Các chủng lao bệnh viện Phạm Ngọc Thạch đƣợc thu thập từ bệnh nhân khu vực miền Nam Việt Nam, kết khảo sát mẫu bệnh viện đại diện cho kết kảo sát miền Nam Việt Nam Kết multiplex PCR sau điện di cho thấy tất mẫu lên băng đặc trƣng cho IS1081 23S rDNA Phát có mẫu không xuất băng đặc trƣng cho IS6110 TB06-220, TB06-246, TB06- 247 Chúng tập trung mẫu gel Mẫu 1, 2, tương ứng với mẫu khuyết IS6110: TB06-220, TB06-246, TB06- 247 (-) (+) M M: marker 100bp (-): Chứng âm (+): Chứng dƣơng 300 249 118 300 IS1081 249 IS6110 118 23S rDNA Hình 3.9 Kết phát mẫu khuyết IS6110 chủng lao miền Nam Ba mẫu khuyết IS6110 đƣợc kiểm tra lại với PCR đơn mồi Kết sau điện di nhƣ sau: 55 Mẫu 1, 2, tương ứng với mẫu khuyết IS 6110 : TB06-220, TB06-246, TB06-247 M: marker 100bp (-) (+) M (-): chứng âm (+): chứng dƣơng 300 IS1081 249 IS6110 118 23S rDNA Hình 3.10 Kết kiểm tra PCR với mẫu khuyết IS6110 miền Nam Dựa vào hình ảnh điện di thấy mẫu DNA đƣợc kiểm tra lại không xuất băng đặc trƣng cho IS6110 Mẫu đối chứng âm không xuất băng nào, mẫu đối chứng dƣơng xuất băng đặc trƣng cho gen đích IS6110 Nhƣ kết luận kiểm tra 250 mẫu DNA chủng lao miền Nam có mẫu khuyết IS6110 Vậy kết phát gen đích miền Nam đƣợc thống kê bảng sau Bảng 3.6 Kết phát gen đích số chủng lao miền Nam Tổng số Tổng kết phát gen đích phản ứng mPCR Gen đích IS6110 Gen đích IS1081 Gen đích 23S rDNA mẫu Xuất Khuyết Xuất Khuyết Xuất Khuyết 250 247 (1,2%) 250 (0%) 250 (0%) Kết cho thấy khảo sát số lƣợng mẫu 250 bệnh viện Phạm Ngọc Thạch phát mẫu không xuất băng đặc trƣng cho gen đích IS6110, 247 mẫu lại xuất đủ băng đặc trƣng cho 56 gen đích IS6110, IS1081 23S rDNA Tỷ lệ khuyết gen chủng lao miền Nam đƣợc phát với IS6110, IS1081 23S rDNA lần lƣợt là: 1,2%, 0%, 0% 3.1.3 Tỷ lệ khuyết trình tự gen đích Việt Nam Sau kiểm tra lại mẫu nghi khuyết lần chạy với phản ứng PCR có kết luận tỷ lệ khuyết gen đích Việt Nam Tổng số mẫu DNA kiểm tra ba miền 750 Tỷ lệ khuyết gen đích đƣợc thống kê bảng sau: Bảng 3.7 Kết kiểm tra tƣợng khuyết gen Việt Nam Tổng số mẫu Tổng kết phát gen đích phản ứng mPCR Gen đích IS6110 Xuất Khuyết 750 738 Gen đích IS1081 Xuất Khuyết 12 (1,6%) Gen đích 23S rDNA Xuất Khuyết 749 (0,133%) 749 (0,133%) Nhƣ qua kết kiểm tra 750 mẫu DNA tách từ chủng lao phƣơng pháp multiplex PCR PCR thu đƣợc kết tỷ lệ khuyết gen đích trình tự gen vi khuẩn lao nhƣ sau: Tỷ lệ khuyết IS6110 = (12/750)  100% = 1,6% Tỷ lệ khuyết IS1081 = (1/750)  100% = 0,133% Tỷ lệ khuyết 23S rDNA = (1/750)  100% = 0,133% Trong nghiên cứu này, phân tích tỷ lệ khuyết gen IS6110 đồng thời phân tích gen IS6110, IS1081, 23SrDNA để xác định xem trƣờng hợp khuyết gen đích IS6110 chọn gen thay để phù hợp với đặc điểm chủng lao Việt Nam Chúng nhận thấy tỷ lệ khuyết gen đích IS6110 chủng lao Việt Nam 1,6% Tỷ lệ 57 thấp so với nghiên cứu Trần Thị Thanh Hoa 5% [7], tƣơng đƣơng tác giả nƣớc công bố (theo Ernesto Liebana cộng -1996 có chủng 304 chủng M tubercolosis phân lập Việt Nam khuyết IS6110 chiếm 1,4% [30]) Tuy nhiên nghiên cứu Ernesto Liebana có 304 chủng nghiên cứu nƣớc công bố trƣớc khảo sát số lƣợng khoảng vài chục chủng nên số liệu chƣa sát thực tế Một số nghiên cứu khác giới gợi ý sử dụng IS1081 23S rDNA thay IS 6110 nhƣng kết nghiên cứu cho thấy sử dụng gen đích đơn độc phản ứng PCR tỷ lệ khuyết gen IS1081 0,133% 23SrDNA 0,133% Ngoài không phát chủng khuyết đồng thời gen đích Nghiên cứu thực số mẫu đủ lớn mặt dịch tễ học, thu thập từ miền Bắc-Trung-Nam, kết phản ánh sát thực tỷ lệ khuyết gen đích chủng vi khuẩn lao Việt Nam, thông số quan trọng cho nhà nghiên cứu sản xuất kit PCR chẩn đoán lao phù hợp 3.2 SO SÁNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN BA MIỀN BẮC TRUNG NAM TẠI VIỆT NAM 3.2.1 So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS6110 ba miền Bắc Trung Nam Dựa vào kết kiểm tra tỷ lệ khuyết trình tự IS6110 thống kê so sánh tỷ lệ ba miền nhằm phục vụ cho nghiên cứu liên quan đến chẩn đoán vùng miền Bảng 3.8 Tỷ lệ khuyết gen IS6110 ba miền Bắc Trung Nam Miền Tỷ lệ khuyết IS6110 % Bắc Trung Nam 0% 3% 1,2% 58 Nhƣ khảo sát ba miền nhận thấy miền Bắc chƣa có tƣợng khuyết gen đích IS6110 chủng vi khuẩn lao Tuy nhiên miền Trung miền Nam xuất chủng khuyết trình tự gen đích bảo thủ Đặc biệt miền Trung tỷ lệ khuyết gen IS6110 lên đến 3% Với tỷ lệ áp dụng PCR với mồi IS6110 chẩn đoán lao miền Trung miền Nam bỏ sót nhiều bệnh nhân 3.2.2 So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS1081 chủng lao ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam Dựa vào kết kiểm tra tỷ lệ khuyết trình tự IS1081 tiến hành thống kê so sánh tỷ lệ ba vùng miền Việt Nam Bảng 3.9 Tỷ lệ khuyết gen IS1081 ba miền Bắc Trung Nam Miền Tỷ lệ khuyết gen IS1081 % Bắc Trung Nam (0%) (0,33%) (0%) Kết thống kê cho thấy với chủng lao miền Bắc miền Nam tƣợng khuyết gen IS1081 Trong 300 chủng lao miền Trung có mẫu vi khuẩn lao khuyết IS1081 Qua kết có nhận xét việc sử dụng gen đích IS1081 chẩn đoán lao phân tử cần thiết tỷ lệ khuyết trình tự thấp 3.2.3 So sánh tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam Kết khảo sát cho thấy có chủng lao miền Trung có tƣợng khuyết 23S rDNA Tỷ lệ khuyết gen đích 23S rDNA 0,33% 59 Bảng 3.10 Tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ba miền Bắc Trung Nam Miền Tỷ lệ khuyết gen 23S Bắc Trung Nam (0%) (0,33%) (%) rDNA % 3.2.4 Đặc điểm khuyết gen vi khuẩn lao Việt Nam Với kết thu đƣợc tiến hành khảo sát ba miền Bắc Trung Nam nhận thấy chủng vi khuẩn lao miền Bắc tƣợng khuyết gen đích Tuy nhiên miền Trung có tƣợng khuyết với ba trình tự IS6110, IS1081 23S rDNA Trong tƣợng khuyết gen IS6110 xảy với tỷ lệ nhiều (3%) Đặc biệt với tƣợng khuyết hai trình tự IS1081 23S rDNA tƣợng gặp, cần phải nghiên cứu thêm hai mẫu vi khuẩn lao Đối với mẫu lao miền Nam có tƣợng khuyết IS6110 với tỷ lệ 1,2% Hiện theo số tác giả đề nghị dùng trình tự IS1081, 23S rDNA thay cho trình tự IS6110 chẩn đoán lao Nhƣng trình tự IS1081 23S rDNA có số copy phát chúng có tỷ khuyết nên tốt phải xây dựng kit chẩn đoán với gen đích đồng thời Ngay với kết không phát thấy tỷ lệ khuyết gen đích đặc trƣng chủng vi khuẩn lao miền Bắc, điều nghĩa bệnh nhân mắc lao miền Bắc bị nhiễm vi khuẩn lao có đầy đủ ba trình tự đặc trƣng quốc gia việc giao lƣu dễ dàng, bệnh nhân tự lựa chọn nơi thăm khám điều trị cho mình, nên chủng khuyết gen theo bệnh nhân thâm nhập vào miền Bắc Vì việc thiết kế kit chẩn lao với ba gen đích IS6110, IS1081 23S rDNA điều cần thiết 60 KẾT LUẬN Tỷ lệ khuyết gen đích Việt Nam Tỷ lệ khuyết IS6110 = (12/750)  100% = 1,6% Tỷ lệ khuyết IS1081 = (1/750)  100% = 0,133% Tỷ lệ khuyết 23S rDNA = (1/750)  100% =0,133% Tỷ lệ khuyết gen đích ba miền  Tỷ lệ khuyết gen đích miền Bắc Tỷ lệ mẫu không xuất IS6110 = (0/200)  100% = 0% Tỷ lệ mẫu không xuất IS1081 = (0/200)  100% = 0% Tỷ lệ mẫu không xuất 23S rDNA = (0/200)  100% = 0%  Tỷ lệ khuyết gen đích miền Trung Tỷ lệ mẫu khuyết IS6110 = (9/300)  100% = 3% Tỷ lệ mẫu khuyết IS1081 = (1/300)  100% = 0,33% Tỷ lệ mẫu khuyết 23S rDNA = (1/300)  100% = 0,33%  Tỷ lệ khuyết gen đích miền Nam Tỷ lệ mẫu khuyết IS6110 = (3/250)  100% = 1,2% Tỷ lệ mẫu khuyết IS1081 = (0/250)  100% = 0% Tỷ lệ mẫu khuyết 23S rDNA = (0/250)  100% =0 % KIẾN NGHỊ Cần xây dựng kit chẩn đoán lao multiplex PCR với ba gen đích IS6110, IS1081 23S rDNA chẩn đoán lao Việt Nam để tránh bỏ sót bệnh nhân 61 TÀI TIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao, Luận án Tiến sỹ Sinh học Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2005), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005 Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Học viện quân y Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hoà (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Trần Thị Thanh Hoa, Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2005), Sử dụng kết hợp hai phương pháp hoá sinh PCR để xác định đa kháng thuốc M tuberculosis, Hội nghị khoa học toàn quốc công nghệ sinh học, Tháng 12/2005 Nguyễn Văn Hƣng (2001), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập Viện lao Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ Y học Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng nghiên cứu Lao Việt Nam, Hội thảo sinh học phân tử bệnh lao, Đại học Quốc gia Hà Nội, Tháng 8/2007 10 Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền ứng dụng, NXB Giáo dục 11 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị, NXB Giáo dục 62 12 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ cộng (2007), “Hoàn thiện qui trình PCR hai gen IS1081 23Sr ADN nâng cao hiệu chẩn đoán lao”, Tạp chí Y Dược Học Quân Sự , 32(2), p 31-37 13 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007), “Nghiên cứu tối ƣu hoá quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31 14 Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật 15 Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao Bệnh phổi sau đại học, Học Viện Quân Y Tiếng Anh 16 Abbas Bahador, (2005) “Performance Assessment of IS1081-PCR for Direct Detection of Tuberculous Pleural Effusion:Compared to rpoBPCR”, Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 1(2): 142-145 17 Alcaide F., M A Benitez, J M Escriba, R Martin (2000), “Evaluation of the BACTEC MGIT 969 and thi MB/BacT systems for recovery of Mycobacteria from clinical specimens and for species identification by DNA AccuProbe”, J Clin Microbiol 38, 398-401 18 Andersen A.B., Thybo S., R Godfrey-Faussett, Stoker N.G (1993), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum” Eur J Clin Microbio! Infect Dis, 12 (12), 922-927 63 19 Ahuja G K., Mohan K K., Prasad K., Behari M (1994), “Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation”, Tuber Lung Dis 75, 149-152 20 Bhattacharya B et al (2003), “Development of a new sensitive and efficient multiplex polymerase chain reaction (PCR) for identification and differentiation of defferent Mycobacteria species”, Tropical Medicine and International Health, (2), 150-157 21 Clarrridge JE III, Shawar RM, Shinnck TM, Plikaytis BB (1993), “Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory”, J Clin Microbiol, 31, 2041-56 22 Cole S T et al (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature, 393, 537-544 23 Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence, IS1081, in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 11-15 24 Das R H., Chander M A (1995), “A rapid and gentle method for the isolation of genomic DNA from mycobacteria”, Nucl Acids Res.21: 2529-2530 25 Dick Van Soolingen, Lishi Qian et al (1995), “Predominance of a single Genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia”, Journal of clinical Microbiology, p 3234 – 3238 26 Down J A., Walters A H., Dey M S., Howard D R., Little M C., Keating W E (1996), “Sample processing method for Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent 5554503 27 David H Persing et al (1993), “Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications”, American Society for Microbiology, 51-172 64 28 Elnifro E M et al (2000), “Multiplex PCR: Optimization and Application in Diagnostic Virology”, Oct, 2000, p 559-570 29 Espitia C et al (1999), “The PE-PGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-binding proteins”, Microbiology, 145, 3487–3495 30 Ernesto Liebana et el (1996), “Assessment of Genetic Markers for Species Differentiation within the Mycobacteria tuberculosis complex”, Vol 34, No 4, p933-938 31 Forbes BA, Hicks KES (1993), “Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction”, J Microbiol 31: 1688-94 32 Fomukong NG, Tang TH et al (1994), “Insertion sequence typing of Mycobacterium tuberculosis: characterization of a widespread subtype with a single copy of IS6110”, Tuber Lung Dis, 75: 435 -440 33 Goyal et al (1996), “Rapid detection of multidrug – resistant tuberculosis”, Eur Respir, 1997, 10, p1120 – 1124 34 Henegariu O., N A Heerema, S R Dlouhy, G H Vance, P H Vogt (1997), “Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol”, BioTechniques 23, 504-511 35 Henegariu, O., P Hirschmann, K Kilian, S Kirsch, C Lengauer, R Maiwald, K Mielke and P Vogt (1994) “Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis”, Andrologia, 26, 97106 36 Kamerbeek J et al (1997), “Simultaneous Detection and Strain Differentiation of Mycobacterium tuberculosis for Diagnosis and Epidemiology”, Journal of Clinical Microbiology, Apr 1997, 907-914 65 37 Kubica GP, Dye WE, Cohn ML, Middlebrook C (1963), “Sputum degestion and decontamination with N-Acetyl-Lsysteine-sodium hydroxide for culture of bacteria”, American Review of Respiratory Diseases, 87, 775-779 38 Kurabachew M et al (2004), “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus-, group- and species-specific detection of Mycobacteria”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 49, 99-104 39 Kurabachew M., Sandaad R A., Engere, Bjorvatna B., (2003), “Sequence analysis in the 23S rDNA region of Mycobacterium tuberculosis and related species”, Journal of Microbiological Methods, 54, 373 - 380 40 Lilly K W Yuen et al (1993), “Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains from Vietnames patients by southern Blot Hybridization”, Journal of clinical Microbiology, p 1615-1618 41 Mekonnen Kurabacchew et al (2004) “A multiplex polymerase chain reaction assay for genus-, group- and species-specific detection of mycobacteria” Diagn Microbiol Infect Dis, 49(2), 99-104 42 Musser J M (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria : Molecular genetic insights”, Clinical Microbiology Reviews, (4), 496-514 43 Mustafa A.S., Abal A.T and Chugh T.D (1999), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex and non-tuberculous Mycobacteria by multiplex polymerase chain reactions”, Eastern Mediterranean Health Journal, 5(1), 61-70 44 Nguyen L N., Kox L F., Pham L D., Kuijper S., Kolk A H (1996), “The potential contribution of the polymerase chain reaction to the diagnosis of tuberculous meningitis”, Arch Neurol 53, 771-776 45 Palomino J C., S C Leão, V Ritacco (2007), Tuberculosis 2007 From basic science to patient care”, www.TuberculosisTextbook.com 66 46 Schlossberg D (2006), “Tuberculosis and nontuberculous Mycobacteria l infections Fifth edition”, Medical Publishing Division 47 Seth P., Ahuja G K., Bhanu N V., Behari M., Bhowmilk S., Broor S., Dar L., Chakraborty M (1996), “Evaluation of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of clinically suspected tuberculous meningitis”, Tuber Lung Dis, 77, 353-357 48 Sechi L A et al (1997), “Detection of Micobacterium tuberculosis by PCR analysis of urine and other clinical samples from AIDS and nonHIV-infected patients”, Molecular and Cellular Probes, 11, 281-285 49 Sjobring ULF, M Mecklenburg, A B Andersen, H Miorner (1990), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, Oct 1990, 28 (10), 2200-2204 50 Smith I (2003), “Mycobacterium tuberculosis Pathogenesis and Molecular Determinants of Virulence”, Journal of Clinical Microbiology, 16 (3), 463-496 51 Tanaka I I., Anno I K et al (2003), “Comparison of a Multiplex PCR Assay with Mycolic Axits Analysis and conventional Methods for the Identification of Mycobacteria ”, Microbiol Immunol, 47(5), 307-312 52 Thierry D., A Brisson-Noel et al (1990), “Characterization of a Mycobacterium tuberculosis Insertion Sequence, IS6110, and Its Application in Diagnosis”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (12), 2668-2673 53 Van Soolingen D, Hermans PWM, de Haas PEW, Soll DR, Van Embden JDA (1991), “Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains; evaluation of an insertion sequence dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, 29, 2578-2586 67 54 Sample size determination in health studies, World Health Organization, Geneva, 1991, pp – 16 Website: 55 www.who.int/Fact 56 http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis 68 [...]... lƣợng bản sao của nó Ở một số vùng số lƣợng bản copy IS6110 thấp ( ... vi c xác định đặc điểm phân tử vi khuẩn lao Vi t Nam [13, 30] Nhận thấy vấn đề có vai trò quan trọng hƣớng phát triển sinh học phân tử vi c chẩn đoán lao để thiết kế kit PCR phù hợp với đặc điểm. .. riêng chủng lao nƣớc để tránh trƣờng hợp bỏ sót bệnh nhân Từ vấn đề tiến hành đề tài nghiên cứu: Xác định số đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn lao Vi t Nam Đề tài tiến hành khảo sát số lƣợng lớn chủng. .. xác cao Tuy cần có nghiên 13 cứu nhằm hiểu rõ đặc điểm phân tử vi khuẩn lao nhằm hoàn thiện kĩ thuật chẩn đoán lao phƣơng pháp phân tử 1.2 ĐẠI CƢƠNG VỀ VI KHUẨN LAO 1.2.1 Đặc điểm phân loại Vi