Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)

Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam (luận văn thạc sĩ)

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN THỊ HẠNH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CÁC

CHỦNG VI KHUẨN LAO Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

2

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 9

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 12

1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO 12

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế gới 12

1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 13

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LAO 14

1.2.1 Đặc điểm phân loại 14

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc 14

1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 18

1.2.4 Hệ gen vi khuẩn lao 20

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO 28

1.3.1 Phương pháp soi trực tiếp 28

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy 28

1.3.3 Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao 29

1.3.4 Một số nghiên cứu về tỷ lệ khuyết gen của M.tuberculosis trên thế giới 31

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 32

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 32

2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Các hóa chất và thiết bị 33

2.2.2 Các cặp mồi được sử dụng trong phát hiện gen đích 35

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 29

2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 38

3

2.3.3 Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu 39

2.4 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 45

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN CÁC CHỦNG LAO Ở VIỆT NAM 46

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA 46

3.1.2 Kết quả phát hiện các gen đích đặc trưng của vi khuẩn lao 48

3.1.3 Tỷ lệ khuyết các trình tự gen đích ở Việt Nam 57

3.2 SO SÁNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN BA MIỀN BẮC TRUNG NAM TẠI VIỆT NAM 58

3.2.1 So sánh tỷ lệ khuyết các trình tự IS6110 trên ba miền Bắc Trung Nam 58 3.2.2 So sánh tỷ lệ khuyết trình tự IS1081 trên các chủng lao ở ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam 59

3.2.3 So sánh tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA trên ba miền Bắc Trung Nam Việt Nam 59

KẾT LUẬN 61

KIẾN NGHỊ 61

TÀI TIỆU THAM KHẢO 62

4

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

2.1 Các sinh phẩm hóa chất chất chính 34

2.2 Các máy và thiết bị chính 35

2.3 Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu 36

2.4 Chu kì nhiệt cho phản ứng multiplex PCR 41

2.5 Thành phần phản ứng 41

2.6 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 42

2.7 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 43

2.8 Thành phần cho phản ứng PCR với mồi 23S rDNA 43

3.1 Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung Ƣơng 47

3.2 Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Đa khoa Trung Ƣơng Huế 47

3.3 Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch 47

3.4 Kết quả phát hiện gen đích đặc trƣng ở các chủng lao miền Bắc 49

3.5 Kết quả phát hiện gen đích ở miền Trung 54

3.6 Kết quả phát hiện gen đích trên một số chủng lao miền Nam 56

3.7 Kết quả kiểm tra hiện tƣợng khuyết gen ở Việt Nam 57

3.8 Tỷ lệ khuyết gen IS6110 ở ba miền Bắc Trung Nam 58

3.9 Tỷ lệ khuyết gen IS1081 ở ba miền Bắc Trung Nam 59

3.10 Tỷ lệ khuyết gen 23S rDNA ở ba miền Bắc Trung Nam 60

5

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình Tên hình Trang

1.1 Trực khuẩn M tuberculosis 15

1.2 Trực khuẩn M tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen 15

1.3 Thành tế bào Mycobacteria 18

1.4 Khuẩn lạc M tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen 19

1.5 Hệ gen vi khuẩn lao 20

1.6 Cấu trúc của IS 23

1.7 6 bản copy của IS6110 trong hệ gen M tuberculosis 25

3.1 Kết quả phát hiện 3 gen đích đặc trưng trên một số chủng lao Miền Bắc 48

3.2 Kết quả phát hiện các gen đích trên các chủng lao ở miền Trung 50

3.3 Kết quả phát hiện khuyết gen IS6110 trên các chủng lao ở miền Nam 50

3.4 Kết quả kiểm tra bằng PCR đơn với 9 mẫu nghi khuyết IS6110 tại miền Trung 51

3.5 Kết quả phát hiện mẫu khuyết IS1081 ở miền Trung 52

3.6 Kết quả kiểm tra bằng PCR với 1mẫu khuyết IS1081 tại miền Trung 52

3.7 Kết quả phát hiện mẫu khuyết 23S rDNA ở miền Trung 53

3.8 Kết quả kiểm tra bằng PCR với 1mẫu khuyết 23S rDNA tại miền Trung 54 3.9 Kết quả phát hiện mẫu khuyết IS6110 ở các chủng lao miền Nam 55

3.10 Kết quả kiểm tra bằng PCR với 3 mẫu khuyết IS6110 tại miền Nam 56

6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1.AFB: Acid Fast Bacilli

2 BCG: Bacille Calmette-Guérin (Trực khuẩn Calmette-Guérin)

3 bp : Base pairs (cặp base)

4 DNA: Deoxyribonucleic acid

5 dNTPs: Deoxynucleotide triphophates

6 DR: Direct Repeat (Đoạn lặp lại trực tiếp)

7 EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acid

8 GuSCN: Guanidinium thiocyanate

9 IR: Inverted Repeat (Đoạn lặp lại ngƣợc chiều)

10 kDa: Kilo – Dalton

11 IS: Insertion Sequence (Trình tự chèn)

12 LAM: Lipoarabinomannan

13 MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube

14 MTBC: Mycobacteria tuberculosis complex

15.MOTT: Mycobacteria other than tuberculosis

16 OD: Optical Density (Mật độ quang học)

17 ORF: Open Reading Frame (Khung đọc mở)

18 PCR: Polymerase Chain Reaction

19 PCR-RFLP: Polymerase Chain Reacion – Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài các đoạn giới hạn dựa trên PCR)

20 PE: Proline – Glutamine

7

24 TB: Tuberculosis (Bệnh lao)

25 TBE: Tris – Boric Acid – EDTA

26 UV: Ultraviolet (tia tử ngoại)

27 WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

8

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS TS Nguyễn Thái Sơn, người đã truyền dạy trang bị kiến thức quý báu, cung cấp nhiều tài liệu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn này Trong suốt thời gian học cũng như thực hiện đề tài luận văn tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y tôi luôn được

sự quan tâm giúp đỡ ân cần và hướng dẫn tận tình của thầy Nhân dịp này một lần nữa tôi xin được gửi lời cảm ơn, lời chúc chân thành tới thầy cùng gia đình

Bên cạnh đó tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy, cô trong Bộ môn Vi sinh vật, Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên Các thầy cô đã nhiệt thành trang bị những kiến thức khoa học và cuộc sống trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học – Học viện Quân Y, đặc biệt là các thành viên tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn này

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập

và hoàn thành luận văn này

Mặc dù đã cố gắng hết mình để hoàn thành luận văn này, nhưng chắc chắn không tránh khỏỉ những sai xót, rất mong được sự tận tình chỉ dẫn và góp ý quý thầy cô

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 22 tháng 12 năm 2010 Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát Việt Nam hiện đứng thứ 12 trong tổng

số 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao lớn nhất trên Thế giới, trong khu vực Tây Thái Bình Dương đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin [2, 10, 54]

Ngày nay bệnh lao càng trở nên nguy hiểm hơn do tính kháng thuốc, đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, do vậy, việc phát hiện để điều trị sớm càng trở nên cần thiết Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất nhiều khó khăn Ở Việt Nam, phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen hiện nay vẫn được coi là phổ biến nhất Hạn chế của phương pháp này là chỉ có khả năng phát hiện trong trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, do vậy nếu chỉ áp dụng phương pháp này sẽ để sót nhiều bệnh nhân Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Lowenstein-Jensen được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, tuy nhiên phải mất 4 đến 8 tuần nuôi cấy mới cho kết quả Ngay cả trên môi trường nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC cũng mất đến 2 tuần, điều này khó đáp ứng được mục tiêu phát hiện nhanh để kiểm soát bệnh lao [4, 18]

Trước yêu cầu bức thiết đó đòi hỏi phải có một phương pháp chẩn đoán đáp ứng được hai yêu cầu nhanh và chính xác Ngày nay sự phát triển mạnh

10

mẽ của sinh học phân tử đã tạo ra một bước đột phá trong việc chẩn đoán lao Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán lao đã rút ngắn thời gian chẩn đoán từ vài tuần xuống còn hai ngày với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ngoài ra phương pháp này còn cho phép phân biệt chính xác các loài

có khả năng gây bệnh lao cũng như phát hiện khả năng kháng thuốc thông qua các gen đặc trưng Hiện nay, trên thế giới và một số cơ sở trong nước đang ứng dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen IS6110, đây là trình tự đặc trưng ở vi khuẩn lao

Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có những chủng lao ở Đông Nam Á trong đó có Việt Nam có một tỉ lệ nhất định khuyết các gen đích này, cụ thể là IS6110 có tỷ lệ khuyết từ 5% đến 8% [25, 30, 32 40] Một số nghiên cứu đề xuất chọn các gen đích khác là IS1081 và 23S rDNA thay cho gen đích IS6110 nhưng chúng ta chưa có một nghiên cứu rộng khắp các chủng lao ở Việt Nam để khẳng định rằng có hay không hiện tượng khuyết gen đích, và nếu có thì tỷ lệ đó là bao nhiêu Điều này rất quan trọng

vì khi khuyết gen đích thì phản ứng PCR nhằm vào gen đó không có giá trị chẩn đoán Nghiên cứu về các gen đích này đồng thời cũng góp phần xây dựng nên sự hoàn thiện trong việc xác định đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao

ở Việt Nam [13, 30]

Nhận thấy vấn đề này có vai trò quan trọng trong hướng phát triển sinh học phân tử trong việc chẩn đoán lao để có thể thiết kế các bộ kit PCR phù hợp với đặc điểm riêng của các chủng lao trong cả nước để tránh trường hợp

bỏ sót bệnh nhân

Từ những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác

định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam” Đề

tài tiến hành khảo sát trên số lượng lớn các chủng vi khuẩn lao được thu thập

ở ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam với hai mục tiêu sau:

12

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế gới

Lao là một bệnh truyền nhiễm và đã từng được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo về tình trạng khẩn cấp toàn cầu của căn bệnh này Hiện nay, bệnh lao đang được khuyến cáo là một trong ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS và sốt rét Hiện có tới hơn 2 tỷ người nhiễm lao chiếm gần 1/3 dân số thế giới, mỗi năm có khoảng 9 triệu bệnh nhân mới được phát hiện và trên 3 triệu người chết vì lao [2] Tình hình cũng diễn biến xấu hơn ở những nước đang phát triển, nơi chiếm 95% số người mắc lao Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân tử vong ở những nước này Khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 quốc gia có gánh nặng bênh tật cao Đặc biệt trong những năm gần đây tình hình lao đồng nhiễm với HIV – AIDS và lao kháng thuốc đang nổi lên như một vấn đề nhức nhối, đặc biệt là ở các nước kém và đang phát triển, điều này đòi hỏi sự vào cuộc của toàn xã hội Theo thống kê năm 2005 toàn thế giới có gần 8,8 triệu người mắc bệnh lao và đã dẫn tới 1,6 triệu người bị chết Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động Trong đó có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao [54, 69].Vào năm 2007, WHO ước tính khu vực Đông Nam Á

có số người nhiễm lao chiếm 34% trên toàn thế giới

Thông báo gần đây nhất năm 2007 của WHO cho biết bệnh lao bước đầu

đã ổn định và giảm đi ở cả 6 vùng trên thế giới Tuy nhiên số lượng các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng lên và tập trung ở các khu vực châu Phi,

13

Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á Tình hình trên cho thấy là bệnh lao vẫn

là mối nguy hại hàng đầu đối với loài người [54]

1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

Theo đánh giá của WHO, Việt Nam đứng hàng thứ 12 trong 22 nước có

số bệnh nhân lao cao nhất thế giới Tại khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ 3 sau Trung Quốc và Phillipin Tỷ lệ mắc bệnh lao tại Việt Nam cao hơn 1,6 lần so với ước tính của WHO, nghĩa là có khoảng 150.000 bệnh nhân lao các thể Theo WHO thì Việt Nam là nước có gánh nặng bệnh lao cao với khoảng 44% dân số nhiễm lao Trong đó tỷ lệ lao mới mắc các thể là 173/100.000 dân, tỷ lệ hiện mắc các thể là 225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong là 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV trong các bệnh

nhân lao mới là 5% [2]

Theo báo cáo của Chương trình Phòng chống lao quốc gia, hàng năm Việt Nam phát hiện và điều trị khoảng 100.000 bệnh nhân lao, trong đó 65% là lao phổi và tập trung ở các vùng đông dân cư và thành phố lớn Bệnh lao ở Việt Nam đang có xu hướng trẻ hóa, rất nhiều thanh niên và người trong độ tuổi lao động mắc lao Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao Quốc Gia đã phát hiện hơn 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện ước tính đạt 82% số bệnh nhân Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 9, 42] Đáng ngại là tỷ lệ lao kháng thuốc ở Việt Nam, tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới là 2,7% và tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân điều trị lại là 19% Nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước

ta ước tính là 1,5% [2]

Những năm gần đây việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR vào chẩn đoán lao đã mang lại nhiều kết quả khả quan, với các kĩ thuật trên đã rút ngắn thời gian chẩn đoán và cho độ chính xác cao Tuy vậy cần có các nghiên

14

cứu nhằm hiểu rõ hơn về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao nhằm hoàn thiện hơn kĩ thuật chẩn đoán lao bằng phương pháp phân tử

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LAO

1.2.1 Đặc điểm phân loại

Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ

Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, giống

Mycobacterium Vi khuẩn lao có tên khoa học là: Mycobacterium

tuberculosis [15]

Các chủng vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium được chia làm 2 nhóm

 Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm:

M tuberculosis, M bovis, M africanum, M microti Trong đó M tuberculosis và M bovis gây bệnh lao điển hình

 Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm:

M avium, M ortuitum, M govdovac, M kansasii Nhóm này không

fast bacilli-AFB) Đây là đặc điểm nổi bật của Mycobacteria có thể giúp phát

hiện vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm Trực khuẩn lao trong dịch huyền phù duy trì tính kháng axit trong khoảng thời gian rất dài kể cả khi chịu tác dụng của nhiệt Trực khuẩn lao có khả năng thực hiện tất cả các cơ chế cần

1.2.2.2 Cấu trúc thành tế bào

Cấu trúc thành tế bào của M tuberculosis chia thành 4 lớp, nhờ đó giúp

bảo vệ tế bào khỏi áp suất thẩm thấu, kiểm soát con đường hoà tan giữa tế bào chất và môi trường

Lớp trong cùng là cấu trúc màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các phospholipid Các phân tử phospholipid bao gồm hai nhóm, nhóm ưa nước hướng về bên trong và nhóm kị nước hướng về bên ngoài, quay ra phía vỏ [1] Màng sinh chất của mycobacteria điều hoà sự thẩm thấu giữa nguyên sinh chất và môi trường, màng chứa các protein có chức năng khác nhau như phân

tử nhạy với nồng độ của các phân tử trong môi trường, các protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian cho vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion Các enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia

tế bào, tập hợp và tiết một số protein ngoại bào, sao chép DNA [3, 4, 11]

16

Lớp tiếp theo là peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân

tử axit mycolic tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vỏ

vi khuẩn có độ cứng nhất định [1] Thành tế bào của Mycobacteria là cấu trúc

phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có một số thành phần hoá học và nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan ở thành tế bào

M tuberculosis là 70-80% trong khi ở E coli là 20-30% [45]

Lớp ngoài là lớp được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị huỷ diệt bởi đại thực bào

và các tế bào miễn dịch [1] Bám với peptidoglycan là một polysaccharide phân nhánh, arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được ester hoá với axit béo có khối lượng phân tử cao là axit mycolic Sự sắp xếp của các axit mycolic có tính đặc hiệu loài cho phép xác định loài mycobacteria bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí-lỏng Các axit

mycolic đặc hiệu M tuberculosis là alpha-keto và mythoxymycolate chứa 76

đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon Lớp ngoài của thành tế bào có các phân tử lipid tự do như phthiocerol dimycoserosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids (SL) Nằm ngang qua toàn bộ lớp màng là một số glycolipid như phosphatidyl-myoinositol mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM), được đính vào màng sinh chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào trong đó LAM có tính đặc hiệu loài Thành tế bào mycobacteria chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này có tác dụng cấu trúc thành tế bào, một số protein porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển tích cực các chất tan trong nước thông qua lớp axit mycolic Porin ở mycobacteria khác so với các

vi khuẩn Gram âm [44, 51]

17

Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn lao phát triển bên trong tế bào, nó có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi khuẩn nằm trong tế bào chống được các enzyme phân giải từ các lysozyme của tế bào [1] Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc

trong đại thực bào, M tuberculosis tích luỹ một capsule giả không bám Thành

phần của capsule chứa protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid Cấu thành của

capsule có thể bung ra trong in vivo bên trong các đại thực bào Màng tế bào của

vi khuẩn lao gây bệnh đa phần giống với màng của các mycobacteria trong cùng một giống bao gồm cả mycobacteria không gây bệnh

Màng tế bào của vi khuẩn lao là một cấu trúc linh động có thể thay đổi khi phát triển hoặc tồn tại trong các môi trường khác nhau Trong điều kiện thiếu oxy thành tế bào sẽ dày lên, sự biểu hiện của các gen mã hoá cho các porin dường như được điều hoà ngược trong các điều kiện môi trường nhất định như trong môi trường nuôi cấy axit nhẹ cũng như trong khoang đại thực bào Ngoài ra sự hình thành cấu trúc cord liên quan đến Trehalose 6, 6’-dimycolate là một glycolipid chứa hai phân tử axit mycolic bám lỏng lẻo ở lớp ngoài của thành tế bào Rất nhiều các hoạt tính sinh học liên quan đến khả năng gây bệnh, tính sinh độc tố và bảo vệ chống lại đáp ứng của tế bào chủ [3,

4, 11]

Ở điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại trong 3 đến 4 tháng Trong điều kiện phòng thí nghiệm vi khuẩn lao có thể được bảo quản trong nhiều năm Tuy nhiên dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp thì sau 5 phút vi khuẩn lao sẽ bị tiêu diệt Dưới ánh sáng của tia cực tím, vi khuẩn lao chỉ tồn tại được

2 đến 3 phút Ở nhiệt độ 42o

C vi khuẩn lao ngừng phát triển, ở nhiệt độ 80o C

vi khuẩn lao chết sau 10 phút [1, 8]

18

Hình 1.3 Thành tế bào Mycobacteria

[http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram.pn]

1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37oC Hầu như không mọc ở nhiệt

độ dưới 37o

C hoặc trên 42oC

Vi khuẩn lao phát triển trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng, chứa trứng, khoai tây, xitrat, glixerol, asparagin, xanh malachit Môi trường thường dùng là môi trường đặc Loewenstein được cải tiến bởi Jensen; (hoặc môi trường lỏng Sauton)

Trực khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, phải 4-6 tuần sau mới hình thành khuẩn lạc điển hình, dạng R

1- Lipid ngoài 2- Axit mycolic 3- polysaccharides (arabinogalactan) 4- peptidoglycan 5- màng sinh chất 6- lipoarabinomannan (LAM) 7- phosphatidylinositol

mannoside 8- Khung thành tế bào

Thời gian phân chia: Ở điều kiện phòng thí nghiệm, M tuberculosis cứ

12 đến 24 giờ phân chia một lần Tốc độ phân chia chậm này có thể do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh dƣỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome Harshey và Ramakrishnan đã xác định rằng sự tổng hợp RNA là một tác nhân chính liên quan đến thời gian sống dài của trực khuẩn Tỷ lệ RNA/DNA, tốc độ kéo dài chuỗi RNA chậm

hơn 10 lần so với E coli Hơn nữa, khi trực khuẩn chuyển từ trạng thái ổn

định sang pha phân chia thì RNA tổng số chỉ tăng lên hai lần Kết quả là tổng hợp protein bị chậm lại [45]

20

1.2.4 Hệ gen vi khuẩn lao

1.2.4.1 Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis

Hình 1.5 Hệ gen vi khuẩn lao

M tuberculosis H37Rv (Cole 1998a) chứa một trình tự gồm 4.411.529

bp, có đặc tính chứa nhiều Guanine và Cytosine (G+C 65,61%) không thay đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn bộ hệ gen, kiểm chứng cho giả thuyết là

không có các nhân tố chuyển gen theo phương ngang trong hệ gen M

tuberculosis [22, 29, 45]

Ở Mycobacteria có một nhóm gen với tỷ lệ G+C cao (>80%) mã hoá cho họ protein PE (Pro-Glu) hoặc PPE (Pro-Pro-Glu) Trình tự PE và PPE có

ở vùng đầu N và bảo thủ trong từng họ protein, chiều dài lần lượt xấp xỉ 110

và 180 amino axit Trong 172 gen thì có 104 gen mã hoá PE và 68 mã hoá

PPE chiếm hơn 4% các gen của M tuberculosis Các protein PE và PPE đóng

một vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên và sống sót của mycobacteria trong các môi trường khác nhau Họ PE được chia thành 3 phân họ, họ quan trọng nhất chứa các trình tự đa hình giàu G-C (PGRS) và có 61 thành viên Các protein được mã hoá bởi các gen 104 PE được chia nhỏ hơn thành 3 lớp, lớp thứ nhất chứa 29 protein chỉ với vùng PE, lớp thứ hai gồm 8 protein trong

đó vùng PE đi kèm với các trình tự đầu C độc lập, và lớp thứ ba gồm 67

21

protein tạo thành dưới họ PE-PGRS PGRS (polymorphic GC-rich repetitive sequences) là nhóm các protein có vùng PE bảo thủ và đầu C mở rộng với sự lặp lại nhiều lần Gly-Gly-Ala hoặc Gly-Gly-Asn Chức năng của các họ này vẫn chưa biết rõ nhưng có một số giả thuyết cho rằng một số protein này có

liên quan đến tính đa dạng kháng nguyên của M tuberculosis trong quá trình lây nhiễm [29, 45, 49] Các protein PE-PGRS đặc trưng cho M tuberculosis

có chức năng ức chế trình diện kháng nguyên thông qua phức hệ hoà hợp tổ chức (MHC) lớp I [45] Một số gen PE mã hoá cho các protein chỉ chứa vùng

110 axit amin được đi kèm gần với một gen mã hoá một protein PPE Trong một số trường hợp, cặp PE-PPE (Rv2431c-Rv2430c) biểu hiện cùng nhau và

có thể tạo thành một phức hệ [45, 46, 50]

Trong hệ gen của H37Rv có ít gene với tỷ lệ G+C thấp (<50%) mã hoá cho các protein xuyên màng hoặc enzyme polyketide synthase Hơn 6% các gen đã được nghiên cứu mã hóa cho các enzyme của quá trình trao đổi axit béo Trong số này có khoảng 3% gen được dự đoán về chức năng trong oxy

hoá β của các axit béo, trong khi E coli chỉ có 50 enzyme liên quan đến chuyển hoá axit béo Phần lớn các enzyme ở M tuberculosis được cho là sử

dụng axit béo có thể liên quan đến khả năng gây bệnh phát triển trong mô của vật chủ nơi mà axit béo có thể là nguồn carbon chính [29, 45, 49]

Trong số 50 gen mã hoá cho các RNA chức năng thì chỉ có một operon RNA ribosome, operon này nằm ở vị trí cách 1,5 Mbp so với vị trí khởi đầu

sao mã (losus oriC) Đa số vi khuẩn có nhiều hơn một operon rrn định vị gần locus oriC để tăng quá trình sao mã Vi khuẩn lao chỉ có một operon rrn đơn

ở một vị trí tương đối xa so với oriC do đó gây ra kiểu hình phát triển chậm

Phát hiện hai thể tiền thực khuẩn trong genome, cả hai giống nhau về độ dài

và cách tổ chức Một là prophage PhiRv1 có trong hệ gen của M tuberculosis H37Rv phá vỡ trình tự lặp lại của họ 13E12 Hệ gen của M tuberculosis chứa

22

7 vị trí cho PhiRv1 chèn vào do đó các chủng có những vị trí biến đổi cao trong hệ gen Prophage thứ hai PhiRv2 ổn định hơn, ít biến đổi hơn giữa các

chủng Các gen mã hoá protein ở M tuberculosis H37Rv mã hoá cho 3.924

ORF (Open Reading Frame), sự khởi đầu khác ở codon GTG được sử dụng

trong 35% trường hợp so với 14% hoặc 9% trong Bacillus subtilis hoặc

Escherichia coli Từ trình tự hệ gen cho thấy M tuberculosis có khả năng

chuyển từ một con đường trao đổi chất này thành con đường trao đổi chất khác bao gồm cả hiếu khí và hô hấp kỵ khí Tính mềm dẻo này rất có lợi cho

sự sống sót trong các môi trường khác nhau bên trong cơ thể người cả trong trạng thái áp lực oxy cao trong phế nang và các điều kiện kỵ khí, vi kỵ khí

trong các nang lao Một đặc tính nữa của hệ gen M tuberculosis là có các gen

tổng hợp và phân huỷ hầu như tất cả các loại lipid như các axit béo và các

phân tử phức như axit mycolic M tuberculosis có các gen mã hoá cho 250

enzyme khác nhau liên quan đến trao đổi axit béo, so với 50 loại trong hệ gen

của E coli [35] Trong số các protein điều khiển, M tuberculosis có 13 yếu tố

sigma (protein liên quan đến tính đặc hiệu sao mã trên RNA polymerase) tương ứng 0,3% tổng số gen và 22 protein điều khiển khác bao gồm 13 nhân

tố điều khiển đáp ứng hai thành phần, tương ứng 0,6% tổng số Số lượng

tương ứng trong M tuberculosis là 125 gen được nghiên cứu cho các chức

năng vận chuyển, tương ứng 3% tổng số [50]

Trong hệ thống trao đổi chất DNA của M tuberculosis có một hệ thống

sửa chữa DNA rất hiệu quả, bộ máy sao chép có độ chính xác cao Hệ gen của

M tuberculosis không có hệ thống sửa chữa bắt cặp sai dựa trên mutS nhưng

được khắc phục bởi sự có mặt của gần 45 gene liên quan đến các cơ chế sửa

chữa DNA, bao gồm 3 bản copy của gen mutT Gen này mã hoá cho enzyme

chịu trách nhiệm loại bỏ các Guanine đã bị oxy hoá gây ra sự bắt cặp sai giữa các cặp base trong quá trình sao chép [22, 29, 45]

23

1.2.4.2 Các trình tự chèn

 Cấu tạo:

Một trong những đặc tính đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng nhất của M

tuberculosis là sự có mặt và phân bố của trình tự chèn (IS), trong đó đặc biệt

là trình tự IS6110 là một trình tự thuộc họ IS3 đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử vì sự thay đổi ở vị trí chèn và số lƣợng bản copy trong bộ gen Các trình tự chèn không có chức năng mã hoá mà chỉ liên

quan đến đặc tính biến đổi và di chuyển Chúng gồm các yếu tố cis, các trình

tự DNA hoạt động ở hai đầu và enzyme Tpase, enzyme này đƣợc mã hoá bởi một hoặc hai khung đọc mở và sử dụng hầu nhƣ toàn bộ độ dài của trình

tự chèn

Hình 1.6 Cấu trúc của IS

- IRL - left inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên trái

- IRR - right inverted repeat: Trình tự lặp lại ngược chiều bên phải

- Khung đọc mở mã hoá transposase bao gồm toàn bộ độ dài của IS và trình

24

 Các trình tự lặp lại đảo ngược ở hai đầu:

Trừ một vài trường hợp đáng chú ý (IS91, IS110 và họ IS200/605) đa số các trình tự chèn có các trình tự lặp lại ngược chiều ở hai đầu (IR-Inverted Repeat) khoảng 10 đến 40 bp IR được phân thành hai vùng chức năng, một định vị trong IR và liên quan đến chức năng gắn Tpase, vùng chức năng kia gồm 2 hoặc 3bp ở cuối liên quan đến sự phân cắt và các phản ứng chuyển chuỗi dẫn đến chuyển vị trí của các trình tự chèn Các promoter của IS thường định vị một phần bên trong trình tự IR về phía đầu gen Tpase, sự sắp xếp này

có thể cung cấp một cơ chế tự điều hoà sự tổng hợp Tpase bằng cách gắn Tpase Các vị trí gắn các protein đặc hiệu cũng được tìm thấy bên trong hoặc

ở gần đầu IR, và đóng vai trò kích hoạt tính di chuyển hoặc biểu hiện Tpase

 Cấu trúc vùng Tpase:

Hoạt tính gắn vào các trình tự DNA đặc hiệu của các protein được quy định ở vùng đầu N trong khi vùng xúc tác thường được quy định ở vùng C Cấu trúc này tạo nên sự tương tác của phân tử protein mới sinh với các trình

tự đích trên IS

 Các đoạn lặp lại trực tiếp:

Đặc điểm khác của IS là có khả năng chèn, đa số tạo nên các trình tự DNA ngắn lặp lại trực tiếp (DR-Direct Repeat), độ dài của DR vào khoảng từ 2 đến 14bp, chèn vào chuỗi DNA tại các vị trí nhất định

 Chức năng của IS:

Một số trình tự chèn có tác dụng hoạt hoá sự biểu hiện của các gen lân cận, trong trường hợp di chuyển tạo nên vị trí thích hợp thì các promoter mới

có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gen bên cạnh

Thông qua biểu hiện và hoạt động của Tpase như cô lập các tín hiệu khởi

đầu dịch mã, thay đổi khung dịch mã, kết thúc dịch mã, tác động đến sao mã

và độ bền của Tpase [45]

25

 Trình tự IS6110

Trình tự IS6110 (IS – Insertion Sequence) được mô tả lần đầu tiên vào năm 1989 IS6110 có nhiều bản copy (4 đến 25 bản copy), số lượng bản copy IS6110 có trong hệ gen thay đổi và phụ thuộc vào loài và chủng

Genome của M tuberculosis gồm 44.411.529 cặp base với 4000 gen, trong

đó trình tự IS6110 tồn tại rải rác nhiều nơi, nó không có chức năng mã hóa

mà chỉ liên quan tới tính biến đổi và di truyền IS6110 là một trình tự chèn chứa 1355 bp và thuộc về họ IS3 của các trình tự chèn IS6110 đã được xác

định là có mặt trong các chủng M tuberculosis, và chỉ khác nhau ở một vài

nucleotid giữa các bản copy với nhau IS6110 có trình tự rất bảo thủ do đó

nó được chọn làm gen đích trong phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện

M tuberculosis [13] Từ lâu IS6110 đã được nghiên cứu và sử dụng rộng

rãi mặc dù trong trình tự genome của M tuberculosis hơn 30 yếu tố lặp lại

có giá trị nhận diện [52] Tuy nhiên một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ở một số vùng trên thế giới các chủng lao có rất ít hoặc thậm chí không có các trình tự IS6110 [24, 32]

Hình 1.7 6 bản copy của IS6110 trong hệ gen M tuberculosis

Sự thay đổi về số lượng bản copy này là nền tảng của tính đa hình và

thường được sử dụng trong fingerprinting M tuberculosis Những chủng chứa

26

ít bản copy IS6110 hơn thì giống nhau hơn trong các mô hình fingerprint so

với các chủng chứa nhiều bản copy Oligonucleotide có nguồn gốc từ trình tự

này được sử dụng cho phát hiện M tuberculosis trong các bệnh phẩm lâm

sàng bằng kỹ thuật PCR [36, 52] Nhiều tác giả đã chứng minh giá trị quan trọng trong dịch tễ của trình tự IS6110 khi nghiên cứu về sự ổn định, tính đa hình và số lượng bản sao của nó Ở một số vùng số lượng bản copy IS6110 thấp (<5 copy) chiếm 25% số chủng, thậm chí có một số chủng không có IS6110 [19, 52] Một số nghiên cứu tiến hành trên các chủng lao có nguồn gốc từ Châu Phi và Châu Âu cho thấy sự hiện diện của 5 đến 10 bản copy của IS6110 Năm 1993 Das và cộng sự khi nghiên cứu các chủng có nguồn gốc từ Hồng Kông lại thấy các chủng lao này có số lượng bản sao lớn hơn [24] Tác giả Dick Van Soolingen và cộng sự công bố rằng nhiều chủng lao ở Đông Nam Á và khoảng 30% các chủng ở Ấn Độ chỉ chứa một bản sao của IS 6110 [25] Năm 1993 Lilly K W Yeun và cộng sự khi nghiên cứu 41 chủng lao từ bệnh nhân có gốc Việt Nam đã phát hiện 5 chủng chỉ có duy nhất một bản sao của IS6110 và 4 chủng trong số đó không chứa các trình tự IS6110 [40] Fomukong và cộng sự cũng nghiên cứu và thấy rằng một số chủng từ Malaysia, Tanzania vad Oman cũng có duy nhất một bản sao của IS6110 [32]

 IS1081

Theo Collins và Stephens năm 1991, IS1081 là một trình tự chèn có độ dài

1324 bp có ở M tuberculosis complex IS1081 có từ 5 đến 6 bản copy trong

hệ gen IS1081 có các tận cùng lặp lại ngược chiều và chứa khung đọc mở lớn (ORF) [23] IS1081 có độ đa hình thấp hơn so với IS6110 bởi IS1081 có hoạt tính di chuyển yếu Số lượng bản copy cũng thấp hơn IS6110, do đó có những hạn chế trong việc sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học Nó cũng không

được sử dụng thường xuyên để phân biệt B bovis - BCG với các thành viên khác thuộc M tuberculosis complex [19] Tuy nhiên, IS1081 cũng rất hữu ích

27

cho các thao tác di truyền và phát triển các xét nghiệm chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao dựa trên phản ứng PCR [21, 31] Một nghiên cứu cho thấy khi sử dụng trình tự IS1081 trong PCR để chẩn đoán lao đã cho kết quả về độ nhạy đạt 84,6% [16]

1.2.4.3 Gen 23S rDNA

Các trình tự rRNA được sử dụng như một dụng cụ để xác định sự phân

kỳ trong tiến hoá, phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp phân loại cổ điển Trong DNA vi khuẩn thì locus di truyền rRNA bao gồm các vùng 16S, 23S và 5S rRNA, giữa các vùng này là vùng đệm (internally transcribed spacer - ITS) DNA trong vùng 16S-23S có sự thay đổi lớn về độ dài và trình tự, sự thay đổi này rất có ích cho việc phân biệt loài ở prokaryotes Gần đây phương pháp PCR-RFLP được sử dụng rất có hiệu quả trong việc phân biệt các chủng ở prokaryotes [21, 36] Gen 23S rDNA là một trình tự có kích thước lớn, tính đa hình cao và thường xuyên hơn so với các vùng 16S rDNA và 5S rDNA Trong nghiên cứu gần đây chỉ có đoạn trong vùng 5V của 23S rDNA được giải trình tự để phân tích so sánh Trình tự 23S

rDNA ở M tuberculosis khác với các loài đã phát hiện ở 7 vị trí, đây là các vị

trí thích hợp cho việc thiết kế các primer và probe Vùng 5V của 23S rDNA

có thể dùng làm gen đích cho phát hiện nhanh và xác định mycobacteria ít nhất ở mức độ loài Sự khác nhau đáng kể giữa các loài không phải mycobacteria và mycobacteria có ý nghĩa trong lâm sàng cho thấy giá trị tiềm năng của vùng này trong chẩn đoán

Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự (2004) gen đích 23S rDNA có mặt ở tất cả các chủng lao gây bệnh do đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu

khuếch đại vùng gen đích 23S rDNA là một thuận lợi cho việc phát hiện M

tuberculosis complex trong những trường hợp không có trình tự IS6110 ở một

số chủng M tuberculosis complex 23S rDNA cũng có thể sử dụng để phân

28

biệt M tuberculosis và M bovis và cũng được sử dụng để phân biệt các chủng

lao gây bệnh trong các mycobacteria [41]

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO

1.3.1 Phương pháp soi trực tiếp

Phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn lao trước đây thường dựa vào thao tác nhuộm Ziehl-Neelsen sau đó soi trực tiếp trên kính hiển vi Đây là một phương pháp phát hiện nhanh chỉ trong 30 phút đến 1 giờ, khá đơn giản

và có chi phí thấp nhưng nồng độ vi khuẩn phải đạt 104

khuẩn/1ml nên độ nhạy thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao Người ta đã cải tiến phương pháp này bằng kĩ thuật li tâm và cô đặc để làm tăng độ nhạy của chẩn đoán Ở các nước phát triển họ sử dụng kính hiển vi huỳnh quang nhằm nâng cao độ nhạy và rút ngắn thời gian chẩn đoán so với các phương pháp truyền thống dựa trên cơ sở của phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen Phương pháp này có ưu điểm là cho kết quả nhanh và không đòi hỏi quá khắt khe về kỹ thuật do đó làm giảm những lỗi nhỏ trong quá trình làm thí nghiệm Nhược điểm của phương pháp là giá thành của các hóa chất, thiết bị dùng cho thí nghiệm rất đắt đó là vấn đề lớn đối với các nước nghèo và có thu nhập thấp

Những năm gần đây phương pháp nhuộm diacetate đánh dấu huỳnh quang được sử dụng nhằm đánh giá sự có mặt cũng như khả năng tồn tại của

vi khuẩn trong các mẫu đờm Phương pháp này được đề xuất để phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn lao đã qua điều trị nhưng chưa thành công do giá thành cao [27, 34]

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy vi khuẩn lao trước đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn trong chẩn đoán phát hiện trong phòng thí nghiệm Đây là phương pháp được thực

Ngoài ra còn một số phương pháp chẩn đoán khác cũng được đề cập tới như phương pháp γ-interferon (IFN-γ) [17, 18] và phương pháp BacT/Alert 3D Những phương pháp này đều có những ưu nhược điểm nhất định và điều

cơ bản nhất là giá thành, thời gian cũng như độ chính xác của từng phương pháp là những vấn đề cần phải xem xét Chính vì vậy các phương pháp này không thường xuyên được sử dụng trong chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao

1.3.3 Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao

1.3.3.1 Kĩ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát minh vào năm

1985 bởi nhà hóa sinh người Mỹ Kary Mullis và được hoàn thiện hơn bởi Saiki và cộng sự Nguyên lý của kĩ thuật này đã được Khorana và đồng nghiệp mô tả từ trước đó Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu nhờ vào các gen đích tương ứng với các DNA này và các thành phần cần thiết của phản ứng PCR Kỹ thuật này đã được áp dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán các mầm bệnh [4, 12, 13, 14, 15, 20, 28]

Những nghiên cứu ở cấp độ phân tử về vi khuẩn lao cho thấy các yếu tố

DNA lặp lại trong M tuberculosis có liên quan với sự đa dạng DNA trong

nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao Sự đa dạng này cho phép các nhà nghiên cứu phân biệt được các chủng lao khác nhau Vì vậy các yếu tố này rất quan trọng

30

và cần thiết trong các nghiên cứu dịch tễ học bệnh lao, như nghiên cứu sự lây truyền trong cộng đồng, sự bùng nổ dịch và đặc biệt là đường lây của các chủng kháng thuốc Có hai dạng yếu tố DNA lặp lại đó là: yếu tố IS 6110, yếu

tố này có khả năng di chuyển, đoạn gen đích này có chiều dài 1300 cặp base Ngoài ra còn có yếu tố khác là yếu tố lặp lại trực tiếp DR (Direct Repeat) Yếu tố IS6110 là yếu tố được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu dịch tễ học vì có trong nhiều chủng vi khuẩn lao khác nhau Tuy nhiên một số nghiên

cứu gần đây chỉ ra rằng một số chủng M tuberculosis không chứa trình tự

IS6110, như các chủng phân lập được từ Đông Nam Châu Á và Ấn Độ Theo

Ernesto Liebana và cs (1996) thì có tới 4 chủng trong 304 chủng M

tuberculosis phân lập ở Việt Nam không có trình tự IS6110 do đó có thể gây

ra hiện tượng âm tính giả [30] Các nghiên cứu cũng đã phát hiện trình tự IS

1081 có ở tất cả các chủng M tuberculosis nghiên cứu và không tìm thấy ở

các loài thuộc họ Mycobacteria khác, do đó có thể dùng cả IS 1081 cho phản

ứng PCR và Multiplex PCR để phát hiện M tuberculosis đặc biệt là các

chủng ở Đông Nam Á [23] Ngoài ra gen 23S rDNA là đoạn gen mã hoá cho tiểu phần 23S của ribosome cũng được các tác giả gợi ý sử dụng trong việc phát hiện và xác định sự có mặt của vi khuẩn lao [39]

31

có giá trị trong chẩn đoán xác định virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng, ngoài ra kỹ thuật này còn để phân tích các sinh vật chuyển gen, phân tích microsatelite và xác định kiểu gen Đặc biệt, phản ứng multiplex PCR rất hữu

ích cho việc phát hiện trực tiếp M tuberculosis từ các mẫu lâm sàng Với các

kết quả nghiên cứu về tính khuyết gen ở một số chủng lao trên thế giới đã đƣợc công bố thì việc tiến hành multiplex PCR càng trở nên cần thiết

1.3.4 Một số nghiên cứu về tỷ lệ khuyết gen của M.tuberculosis trên thế giới

Trên thế giới đã có một số tác giả nghiên cứu về hiện tƣợng khuyết gen

và số lƣợng bản copy của gen IS6110 ở M tuberculosis Một số nghiên cứu

tiến hành trên các chủng lao có nguồn gốc từ Châu Phi và Châu Âu cho thấy

sự hiện diện của 5 đến 15 bản copy của IS6110 Tác giả Van Soolingen và cộng sự (1991) công bố rằng nhiều chủng ở Đông Nam Á và khoảng 30% các chủng ở Ấn Độ chỉ chứa một bản sao của IS6110 [53] Năm 1993 Lilly K W Yeun và cộng sự khi nghiên cứu 41 chủng lao từ các bệnh nhân có gốc Việt Nam đã thấy 5 chủng chỉ có duy nhất một bản sao của IS6110 và 4 chủng trong số đó không chứa các trình tự IS6110 [40] Một số chủng từ Malaysia, Tanzania và Oman cũng có duy nhất một bản sao của IS6110 [32] Das và cộng sự (1993) đã công bố trong một nghiên cứu khoảng 40% các chủng từ Madras không có hoặc chỉ có duy nhất một bản sao của IS6110 [24], Ở các chủng lao chỉ có duy nhất một bản sao hoặc không có bản sao nào cho gen IS6110 thì việc sử dụng trình tự gen đích này trong việc phát hiện vi khuẩn lao sẽ không mang lại kết quả chính xác Đến nay, ở Việt Nam chƣa có một nghiên cứu chính thức nào về hiện tƣợng khuyết gen với số lƣợng mẫu lớn trên cả 3 miền Bắc Trung Nam để có đƣợc đánh giá tổng quát về hiện tƣợng

khuyết gen trong M tuberculosis ở Việt Nam

32

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các mẫu chủng vi khuẩn lao M

Tuberculosis được thu thập từ 3 bệnh viện ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam

Việt Nam

Miền Bắc: Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TƯ – Kí hiệu chủng TB02

Miền Trung: Bệnh viện Đa Khoa TW Huế - Kí hiệu chủng TB05

Miền Nam: Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch – Kí hiệu chủng TB06

Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường Lowenstein rồi tách chiết thu DNA sử dụng trong quá trình nghiên cứu

2.1.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu được tính theo công thức tính cỡ mẫu theo khuyến cáo của WHO cho các nghiên cứu dịch tễ học [54]

n = Z 2 1-/2 P (1-P)/ d 2

Trong đó :

Z1-  /2 = 1,96 (với độ tin cậy = 95%)

P : Tỉ lệ ước đoán trong quần thể (tỷ lệ ước đoán khuyết gen đích IS6110 ở Việt Nam là 5 % theo các nghiên cứu trong nước công bố)

d : Độ dao động của tỉ lệ phát hiện không quá 5% so với tỷ lệ thực

n : Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được

Căn cứ công thức trên, chọn d = 2% thì cỡ mẫu tối thiểu cần đạt là n =

456, thực tế đã thu thập 750 chủng vi khuẩn lao ở cả 3 miền

33

Cách lấy mẫu: Thu thập ngẫu nhiên chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trong khoản thời gian thuộc giai đoạn 2007-2010 tại các điểm nghiên cứu

2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị đƣợc sử dụng tại phòng thí nghiệm

Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh

Y Dƣợc – Học viện Quân Y

2.2.1 Các hóa chất và thiết bị

Các hóa chất và thiết bị chính phục vụ cho nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 2.1 và 2.2

34

Bảng 2.1 Các sinh phẩm hóa chất chất chính

Tên hóa chất Hãng sản xuất

1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA

Protease K Sigma (Mỹ)

Các dung môi hữu cơ Gibco BRL Life technology

Phenol/Chloroform/Isomyl Wako (Japan)