Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua phú thọ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Bùi Nguyễn Hải Linh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỊT CHUA PHÚ THỌ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Bùi Nguyễn Hải Linh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỊT CHUA PHÚ THỌ Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60 42 01 03 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Trịnh Thành Trung Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài luận văn, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trịnh Thành Trung, Th.S Trần Thị Lệ Quyên toàn cán Viện VSVvà Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề luận văn tốt nghiệp Đồng thời, muốn gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Thị Thanh Hương quý thầy cô giảng dạy Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật động viện hỗ trợ tơi nhiều q trình thực Ngồi ra, cảm ơn người bạn, người ln sát cánh bên tơi lúc khó khăn giúp tơi vượt qua để hồn thành luận văn cách tốt Với lòng biết ơn sâu sắc, biết ơn ghi nhớ giúp đỡ quý báu Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Bùi Nguyễn Hải Linh MỤC LỤC MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN 1.1 Probiotic 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu định nghĩa probiotic 1.1.3 Vai trò probiotic 1.1.4 Cơ chế tác động chung probiotic 1.1.5 Các nhóm VSV có đặc tính probiotic thường gặp 1.2 Vi khuẩn lactic 10 1.2.1 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic 10 1.2.2 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic 11 1.3 Thực phẩm lên men 13 1.3.1 Định nghĩa loại thực phẩm lên men 13 1.3.2 Thực phẩm lên men từ thịt heo 14 1.4 Thịt chua Phú Thọ 15 II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 2.1 Nguyên liệu 18 2.2 Thiết bị hóa chất 18 2.3 Phương pháp 19 2.3.1 Xử lý mẫu thịt chua 19 2.3.2 Phân lập xác định số lượng vi khuẩn lactic 19 2.3.3 Hoạt hóa vi khuẩn lưu giữ điều kiện lạnh sâu 20 2.3.4 Giải trình tự gene 20 2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái 22 2.3.6 Phương pháp nghiên cứu đặc tính probiotic 23 2.3.6.1 Hoạt tính kháng khuẩn 23 2.3.6.2 Xác định kiểu lên men 24 2.3.6.3 Hoạt tính β-galactosidase 24 2.3.6.4 Khả chịu acid 24 2.3.6.5 Khả chịu muối mật 25 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic thịt chua Phú Thọ 26 3.2 Phân loại phân tích tần xuất bắt gặp vi khuẩn lactic thịt chua Phú Thọ 28 3.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic 28 3.2.2 Xây dựng phát sinh chủng loại 31 3.2.3 Phân tích tần xuất bắt gặp vi khuẩn lactic 32 3.3 Đặc tính probiotic 34 3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 34 3.3.2 Khả lên men 37 3.3.3 Hoạt tính β-galactosidase 39 3.3.4 Khả chịu acid muối mật 40 3.3.4.1 Khả chịu acid 41 3.3.4.2 Khả chịu muối mật 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT cs cộng ĐC đối chứng LAB Lactic Acid Bacteria VSV vi sinh vật DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Minh họa chế tác động probiotic Hình 1.2 Nguyên liệu quy trình sản xuất thịt chua Phú Thọ 16 Hình 2.1 Mẫu thịt chua Phú Thọ……………………………………………18 Hình 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic mẫu 12 (hình A), 14 (hình B), 19 (hình C) 20 (hình D)………………………………………………………28 Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự gene 16S rRNA lồi thuộc chi Lactobacillus 32 Hình 3.3 Tần suất xuất lồi vi khuẩn lactic thịt chua Phú Thọ 33 Hình 3.4 Khả kháng khuẩn số chủng LAB với chủng vi khuẩn kiểm định E faecalis 52788G (hình A), S aureus 2421Đ (hình B), K pneumoniae 1465G (hình C), A baumannii 56915Đ (hình D), P aeruginosa 47793Đ (hình E) E coli 2361G (hình F) 35 Hình 3.5 Khả kháng khuẩn chủng LAB với nhóm vi khuẩn “ESKAPE” 36 Hình 3.6 Số lượng chủng lồi kháng ức chế nhóm vi khuẩn “ESKAPE” 37 Hình 3.7 Khả lên men chủng vi khuẩn lactic 38 Hình 3.8 Số lượng chủng lồi có khả lên men đồng hình 38 Hình 3.9 Hoạt tính β-galactosidase chủng TPM 1302 (1), TPM 1303 (2), TPM 1304 (3), TPM 1308 (4), TPM 1309 (5), TPM 1503 (6) TPM 1504 (7) sau 24 39 Hình 3.10 Khả sinh β-galactosidase chủng LAB qua 24 48 40 Hình 3.11 Số lượng chủng lồi có khả sinh β-galactosidase sau 24 40 Hình 3.12 Số lượng chủng có khả chịu acid 43 Hình 3.13 Giá trị OD600 chủng có khả chịu acid 44 Hình 3.14 Số lượng chủng có khả chịu muối mật 45 Hình 3.15 Giá trị OD600 chủng có khả chịu muối mật 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Giá trị pH thông số vi sinh sản phẩm thịt chua Phú Thọ 27 Bảng 3.2 Phân loại loài vi khuẩn lactic thịt chua Phú Thọ 30 49 - chủng có khả chịu acid thấp chủng TPM 1301 TPM 1902 thuộc loài L plantarum subsp plantarum; chủng TPM 1702, TPM 1802 TPM 1803 thuộc loài L pentosus - chủng có khả chịu nồng độ muối mật 0,3% chủng TPM 1301, TPM 1901 TPM 1902 thuộc loài L plantarum subsp plantarum; chủng TPM 1702, TPM 1802 TPM 1803 thuộc loài L pentosus - chủng có khả chịu acid muối mật TPM 1301, TPM 1702, TPM 1802, TPM 1803 TPM 1902 Kiến nghị Tiến hành thử nghiệm khả bám dính vào tế bào biểu mơ ruột chủng có khả chịu acid muối mật Lựa chọn chủng thử nghiệm lên men thịt chua cho (i) lên men ổn định (ii) chất lượng ổn định 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Analie Lourens - Hattingh, Bennie C Viljoen (2001)Yogurt as probiotic carrier food, International Dairy Journal 11 (2001) 1–17 Carr FJ, Chill D & Maida N (2002) The lactic acid bacteria: a literature survey Crit Rev Microbiol28: 281-370 Chang, J H., Shim, Y Y., Cha, S K., and Chee, K M (2009),“Probiotic characteristics of lactic acid bacteria isolated from kimchi”,Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072 Chao SH, Tomii Y, Watanabe K & Tsai YC (2008) Diversity of lactic acid bacteria in fermented brines used to make stinky tofu Int J Food Microbiol123: 134-141 Chao SH, Wu RJ, Watanabe K & Tsai YC (2009) Diversity of lactic acid bacteria in suan-tsai and fu-tsai, traditional fermented mustard products of Taiwan Int J Food Microbiol135: 203-210 Chen YS, Wu HC, Li YH, Leong KH, Pua XH, Weng MK & Yanagida F (2012) Diversity of lactic acid bacteria in sian-sianzih (fermented clams), a traditional fermented food in Taiwan J Sci Food Agric92: 321-327 Chen YS, Wu HC, Lo HY, et al (2012) Isolation and characterisation of lactic acid bacteria from jiang-gua (fermented cucumbers), a traditional fermented food in Taiwan J Sci Food Agric92: 2069-2075 Dai Z, Li Y, Wu J & Zhao Q (2013) Diversity of lactic acid bacteria during fermentation of a traditional Chinese fish product, Chouguiyu (stinky mandarinfish) J Food Sci78: M1778-1783 Danilovic B, Jokovic N, Petrovic L, Veljovic K, Tolinacki M & Savic D (2011) The characterisation of lactic acid bacteria during the fermentation of an artisan Serbian sausage (Petrovska Klobasa) Meat Sci88: 668-674 51 10.Doan NT, Van Hoorde K, Cnockaert M, De Brandt E, Aerts M, Le Thanh B & Vandamme P (2012) Validation of MALDI-TOF MS for rapid classification and identification of lactic acid bacteria, with a focus on isolates from traditional fermented foods in Northern Vietnam Lett Appl Microbiol55: 265-273 11.Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals” J Appl Bacteriol, 66, pp 65-78 12.Fuller R (1992), “History and development of probiotics”, In: R Fuller (Ed.) Probiotics: The Scientific Basis pp 1-8 Chapman & Hall, London 13.Garcia Fontan MC, Lorenzo JM, Parada A, Franco I & Carballo J (2007) Microbiological characteristics of "androlla", a Spanish traditional pork sausage Food Microbiol24: 52-58 14.Joint FAO/WHO Expert Consultation,Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria Report, 2001 15.Havenaar, R., Huis in’t Veld, J.H.J Probiotics: a general view In: Wood,B.J.B (ed) The lactic acid bacteria in health and disease The lactic acid bacteria, Vol Chapman and Hall, New York, 1992: 209-224 16.Kwon TW (1994) The role of fermentation technology for the world food supply In Lactic Acid Fermentation of Non-Dairy Food and Beverages Seoul, South.Korea: Ham Lim Won 17.Klingberg TD, Axelsson L, Naterstad K, Elsser D & Budde BB (2005) Identification of potential probiotic starter cultures for Scandinavian-type fermented sausages Int J Food Microbiol105: 419-431 18.Kopermsub P & Yunchalard S (2010) Identification of lactic acid bacteria associated with the production of plaa-som, a traditional fermented fish product of Thailand Int J Food Microbiol138: 200-204 52 19.Lan WT, Chen YS & Yanagida F (2009) Isolation and characterization of lactic acid bacteria from Yan-dong-gua (fermented wax gourd), a traditional fermented food in Taiwan J Biosci Bioeng108: 484-487 20.Lars Axelsson, Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology, in: Lactic Acid Bacteria , Microbiological and Functional Aspects, 3rdedition, Seppo Salminen, Atte von Wright, Arthur Ouwehand, Marcel Dekker, Inc, New York, USA, 2004, 1-67 21.Lee H & Kim HY (2011) Lantibiotics, class I bacteriocins from the genus Bacillus J Microbiol Biotechnol21: 229-235 22.Nguyen DT, Van Hoorde K, Cnockaert M, De Brandt E, Aerts M, Binh Thanh L & Vandamme P (2013) A description of the lactic acid bacteria microbiota associated with the production of traditional fermented vegetables in Vietnam Int J Food Microbiol163: 19-27 23.Nguyen HT, Elegado FB, Librojo-Basilio NT, Mabesa RC & Dizon EI (2010) Isolation and characterisation of selected lactic acid bacteria for improved processing of Nem chua, a traditional fermented meat from Vietnam Benef Microbes1: 67-74 24.Nguyen Thi Lam Doan , Hoang Thi Van, Nguyen Thi Thanh Thuy, Nguyen Hoang Anh (2016) Isolation and selection of lactic acid bacteria from Vietnamese fermented pork meat product with antimicrobilal activity and characterization of bacteriocin Vietnam J Agri Sci 2016, Vol 14, No 7: 1089-1099 25.Salminen S, Wright AV & Ouwehand A (2004) Lactic Acid Bacteria Microbiology and Functional Aspects, 3rd edition New York: Marcel Dekker 26.Solomons NW (2002) Fermentation, fermented foods and lactose intolerance Eur J Clin Nutr56(4) : S50-55 53 27.Tamang JP & Fleet GH (2009) Yeasts Diversity in Fermented Foods and Beverages In Yeast Biotechnology: Diversity and Applications, Springer 28.Tamang JP, Tamang B, Schillinger U, Guigas C & Holzapfel WH (2009) Functional properties of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented vegetables of the Himalayas Int J Food Microbiol135: 28-33 29.Tamang JP, Kailasapathy K (2010) Fermented food and beverages of the World CRC press, Taylor and Francis Group 30.Tamang JP (2010) Himalayan fermented foods: microbiology, nutrition and ethnic values CRC press, Taylor and Francis Group 31.Parvezl S., Malik2 K.A , Kang3 S Ah and H.-Y Kim,Probiotics and their fermented food products are beneficial for health, Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072 32.Schillinger U (1996), “Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods”, Trend in food Science and Technology, 64, pp 158-164 54 PHỤ LỤC Một số môi trƣờng đƣợc sử dụng - Môi trường MRS (g/L) Glucose 20,0 g Thạch 15,0 g CaCO3 5,0 g Cao thịt 10,0 g Cao nấm men 5,0 g Pepton 10,0 g K2HPO4 2,0 g CH3COONa 5,0 g C6H17N3O7 2,0 g MgSO4.7H2O 0,58 g MnSO4.7H2O 0,28 g Tween 80 mL H2O 1000 mL pH - Môi trường NA (g/L) Cao thịt 3,0 g Pepton 5,0 g Thạch 15,0 g H2O 1000 mL pH 55 - Môi trường MH (g/L) Cao thịt Acid hydrolysate of casein Tinh bột 2,0 g 17,5 g 1,5 g Thạch 15,0 g H2O 1000 mL pH - Môi trường LB (g/L) Cao nấm men 5,0 g Pepton 10,0 g NaCl 10,0 g Thạch 15,0 g H2O 1000 mL pH Một số hình ảnh trình tự gene 16S rDNAcủa chủng LAB nghi ngờ lồi a, Chủng TPM 1209 - Hình thái: Sau ngày nuôi môi trường MRS nhiệt độ 30oC, khuẩn lạc ba chủng nhơ cao, có dạng hình trịn lan theo vết que cấy, mép trơn nhẵn, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng sữa, kích thước 1,0 - 2,5 mm, không tiết sắc tố môi trường Tế bào sau ngày nuôi cấy môi trường MRS nhiệt độ 30oC, tế bào bắt màu Gram dương, hình que, kích thước (0,51 - 0.64) × (0,68 - 0,86) µm (Hình 4.1) 56 Hình 4.1 Khuẩn lạc tế bào chủng chủng TPM 1209 (thanh bar kích thước µm) - Trình tự gene 16S rDNA CTCAGGACGAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTG CTGATGATTGAAGCTTGCTTCATGAATCAGATTTGAGTGAGTGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAA GTGCTAATACCGCATAACAACTACTTTCACATGATCGTAGCTTGAAAGATGGC TCTGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAT AGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATT GGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC CACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTC GGATCGTAAAACTCTGTTGTTGAAGAAGAACATGCGTGAGAGTAACTGTTCAC GTACTGACGGTATTCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAATG TAGGCGGTTTATTAAGTTTGAAGTGAAAGCCCTCGGCTCAACCGAGGAAGTGC TTCGAAAACTGGTAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTA GCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCT GGTCTGTAACTGACGCTGAGATTCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCG CCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCG CAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT GTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACCATG AAAAGCTTAGAGATAAGTCTTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCAT GGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC 57 AACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGG TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAACGTGTTGCGAACTCGCGAG GGCAAGCAAATCACTTAAAACCGATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCG CCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAAT ACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACAC CCAAAGCCGGTGGGGTAACCCTTCGGGGAGC Mức độ tương đồng rDNA 16S so với chủng chuẩn Lactobacillus heilongjiangensis S4-3 98,88% b, Chủng TPM 1408 - Hình thái Sau ngày ni mơi trường MRS nhiệt độ 30oC, khuẩn lạc chủng TPM 1408 nhơ cao, có dạng hình trịn, mép xù xì, bề mặt gồ ghề, màu trắng sữa, kích thước 0,5 - 1,5 mm, không tiết sắc tố môi trường Tế bào sau ngày nuôi cấy môi trường MRS nhiệt độ 30oC, tế bào bắt màu Gram dương, hình que, kích thước (0,49 - 0,63) × (1,45 - 2,11) µm (Hình 4.2) Hình 4.2 Khuẩn lạc tế bào chủng chủng TPM 1408 (thanh bar kích thước µm) - Trình tự gene 16S rDNA ACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACCAAACTGATG ATTGAAGCTTGCTTCATGATTCAGACCTTGGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA 58 CACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAAGTGCTAA TACCGCATAACAACATTTATCTCATGATTTATGTTTAAAAGATGGTTCTGCTAT CTCTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATAGCTCACC AAGGCGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTG AGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATG GACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGT AAAACTCTGTTGTTGAAGAAGAACATATGTGAGAGTAACTGTTCACGTACTGA CGGTATTCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAATGTAGGCGG TTCATTAAGTTTGAAGTGAAAGCCCTCGGCTCAACCGAGGAAGTGCTTCGAAA ACTGGTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTG GAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTG TAACTGACGCTGAGATTCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTG GTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTC AGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGT TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACCATGAAAAGCT TAGAGATAAGTCTTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT ATTATCAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGATAA ACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGC TACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAACGTGTCTGCGAACTCGCGAGGGCAA GCAAATCACTTAAAACCGATCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGC ATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAA GCCGGTGGGGTAACCCTTCGGGGAGCTAGCCGT Mức độ tương đồng rDNA 16S so với chủng chuẩn Lactobacillus kimchii MT-1077 98,50% 59 c, Chủng TPM 1905 - Hình thái Sau ngày nuôi môi trường MRS nhiệt độ 30oC, khuẩn lạc chủng TPM 1905 lồi, có dạng hình trịn, mép trơn nhẵn, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng sữa, kích thước 0,5 - 1,0 mm, không tiết sắc tố môi trường Tế bào sau ngày nuôi cấy môi trường MRS nhiệt độ 30oC, tế bào bắt màu Gram dương, hình que, kớch thc (0,75 - 0,88) ì (0,84 - 1,03) àm (Hình 4.3) Hình 4.3 Khuẩn lạc tế bào chủng chủng TPM 1905(thanh bar kích thước µm) - Trình tự gene 16S rDNA TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACC AAACCATTGATTGGAGCTTGCTCCTTGATTTGGACCTTGGTGAGTGGCGGACG GGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAAAGTGGGGGATAACATCTGGAAA CAGGTGCTAATACCGCATAACAACTACTTTCACATGATCGTAGCTTGAAAGAT GGCTCTGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGT AACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCA CATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT CTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGG TTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTGAAGAAGAACATGCGTGAGAGTAACTG TTCACGTACTGACGGTATTCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGA 60 GAATGTAGGCGGTTTATTAAGTTTGAAGTGAAAGCCCTCGGCTCAACCGAGGA AGTGCTTCGAAAACTGGTAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCAT GTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGG CTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGATTCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGG TTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC GATCGCAAGATTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGG AGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATA CCATGAAAAGCTTAGAGATAAGTCTTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGG TGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTG CCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAACGTGCTGCGAACTCG CGAGGGTAAGCAAATCACTTAAAACCGATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAA CTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGT GAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTA ACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCCTTCGGGGAGCTAGCCGTC Mức độ tương đồng rDNA 16S so với chủng chuẩn Lactobacillus crustorum LMG 23699 98,63% d, Chủng TPM 2005 - Hình thái Sau ngày nuôi môi trường MRS nhiệt độ 30oC, khuẩn lạc nhơ cao, có dạng hình trịn lan theo vết que cấy, mép trơn nhẵn, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng sữa, kích thước 1,0 - 2,5 mm, khơng tiết sắc tố môi trường Tế bào sau ngày nuôi cấy môi trường MRS nhiệt độ 30oC, tế bào bắt màu Gram dương, hình que, kích thc (0,54 - 0,71) ì (0,61 - 0,87) àm (Hỡnh 4.4) 61 Hình 4.4 Khuẩn lạc tế bào chủng chủng TPM 2005 ((thanh bar kích thước µm) - Trình tự gene 16S rDNA CTCAGGACGAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTG CTGATGATTGAAGCTTGCTTCATGAATCAGATTTGAGTGAGTGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAA GTGCTAATACCGCATAACAACTACTTTCACATGATCGTAGCTTGAAAGATGGC TCTGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAT AGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATT GGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC CACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTC GGATCGTAAAACTCTGTTGTTGAAGAAGAACATGCGTGAGAGTAACTGTTCAC GTACTGACGGTATTCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAATG TAGGCGGTTTATTAAGTTTGAAGTGAAAGCCCTCGGCTCAACCGAGGAAGTGC TTCGAAAACTGGTAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTA GCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCT GGTCTGTAACTGACGCTGAGATTCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCG CCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCG CAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT GTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACCATG AAAAGCTTAGAGATAAGTCTTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCAT GGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC 62 AACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGG TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAACGTGTTGCGAACTCGCGAG GGCAAGCAAATCACTTAAAACCGATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCG CCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAAT ACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACAC CCAAAGCCGGTGGGGTAACCCTTCGGGGAGCTAACCGTC Mức độ tương đồng rDNA 16S so với chủng chuẩn Lactobacillus heilongjiangensis S4-3 98.88% Một số hình ảnh thu đƣợc q trình làm thí nghiệm đặc tính probiotic a, Khả lên men ĐC (1) (2) Hình 4.5 Khả lên men chủng TPM 1201 (1), chủng TPM 1310 (2) ống đối chứng b, Khả chịu acid 63 ĐC (1) (2) (3) (4) (5) (6) Hình 4.6 Khả chịu acid pH = (1), pH = (2), pH = (3), pH = (4), pH = (5), pH = (6) chủng L pentosus TPM 1803 ống đối chứng c, Khả chịu muối mật ĐC (1) (2) (3) (4) (5) Hình 4.7 Khả chịu muối mật nồng độ muối mật 0% (1), muối mật 0,1% (2), muối mật 0,3% (3), muối mật 0,5% (4), muối mật 0,8% (5) chủng L pentosus TPM 1803 ống đối chứng ... đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần đặc tính probiotic vi khuẩn lactic phân l? ??p từ thịt chua Phú Thọ? ?? với mục tiêu: - Nghiên cứu thành phần vi khuẩn lactic tham gia vào q trình hình thành chất l? ?ợng.. .VI? ??N HÀN L? ?M KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM VI? ??N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Bùi Nguyễn Hải Linh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN L? ??P TỪ THỊT CHUA. .. phẩm thịt chua Phú Thọ - Nghiên cứu đặc tính probiotic vi khuẩn lactic phân l? ??p từ thịt chua 18 II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu Vào tháng năm 2016, tiến hành l? ??y mẫu thịt chua