Đang tải... (xem toàn văn)
Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CARBAMAZEPINE VÀ CHẤT CHUYỂN HOÁ CHÍNH CỦA NĨ BẰNG UHPLC-MS/MS TRONG HUYẾT THANH Ở NGƯỜI ĐỘNG KINH Wei Jiang, Tianyi Xia, Yunlei Yun, Mingming Li, Feng Zhang, Shouhong Gao, Wansheng Chen Từ khóa: Động kinh, Carbamazepine, trao đổi chất, UHPLC-MS/MS, huyết “UHPLC-MS/MS method for simultaneous determination of carbamazepine and its seven major metabolites in serum of epileptic patients” CBZ điều trị thể động kinh Phản ứng có hại mối quan tâm hàng đầu việc sử dụng thuốc hợp lý hiệu lâm sàng Nghiên cứu xây dựng xác định đồng thời Carbamazepine chất chuyển hóa UHPLC-MS/MS Mang tính ứng dụng cao cho việc theo dõi nồng độ trị liệu (TDM) CBZ chất chuyển hóa bệnh nhân động kinh nghiên cứu độc tính để cá thể hóa sử dụng thuốc lâm sang Khách quan hiệu Volume 1108, 15 February 2019, Pages 1724 Ngày nhận: 11-09-2017 Ngày sửa đổi: 09-11-2018 Ngày chấp thuận: 09-11-2018 GIỚI THIỆU Iminostilbene AI CBZ Myeloperoxidase Oxy hóa AO ĐẶT VẤN ĐỀ TÌNH HÌNH - Trên lâm sàng: Việc theo dõi nồng độ CBZ thực phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực (FPIA) - Sắc ký lỏng (LC) có ưu so với FPIA hạn chế kết dương tính giả - Các nghiên cứu trước CBZ chưa có đầy đủ chất chuyển hóa, đối tượng đa số người khỏe mạnh - Chưa biết đầy đủ chế gây độc CBZ chất chuyển hóa ĐIỂM NỔI BẬT CỦA NGHIÊN CỨU - Xác định đồng thời CBZ chất chuyển hóa - Thời gian thực nhanh: phút so với 50 phút HPLC - Nghiên cứu 95 bệnh nhân bị động kinh PHƯƠNG PHÁP HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ - Chất chuẩn CBZ phenacetin (độ tinh khiết 99%)-Viện kiểm soát thực phẩm dược phẩm quốc gia (Bắc Kinh, Trung Quốc) CBZEP, IM AI cung cấp SIGMA-ALDRICH (St Louis, MO, USA) CBZ-DiOH, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ AO cung cấp Toronto Research Chemicals Inc (Toronto Canada) Methanol acetonitril loại phân tích mua từ Cơng ty Merck (Darmstadt, Đức) Axit formic cung cấp Tedia Company Inc (Fairfield, Hoa Kỳ) Nước siêu tinh khiết sản xuất Milli-Q Reagent Water System (Millipore, MA, USA) Các đĩa lắng protein 96 giếng Ostro lấy từ công ty Waters (Waters, Zellik, Bỉ) PHENACETINE CHẤT CHUẨN NỘI: - Cấu trúc tính chất hóa lý tương tự hợp chất phân tích - Hiệu ứng nền, độ hồi phục, phản ứng ion hóa đặc tính sắc ký chứng minh tương tự hợp chất phân tích PHƯƠNG PHÁP HĨA CHẤT VÀ THUỐC THỬ Carbamazepine Arcidine Acridone Carbamazepine10,11-epoxide Iminostilbene 10,11-dihydro-10,11-transdihy-droxy-carbamazepine 2-hydroxycarbamazepine 3-hydroxycarbamazepine PHƯƠNG PHÁP THIẾT BỊ Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu Agilent 1200 ghép khối phổ đầu dò tứ cực Agilent 6460 Đầu dò khối phổ ba tứ cực PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU KIỆN SĂC KÝ Carbamazepine Phương pháp Pha động: rửa giải theo gradient Cột Nhiệt độ buồng Tốc độ dòng UHPLC 15%A→30%A 0-3.0 phút 30%A→95%A 3.0-5.0 phút Agilent Eclipse XDB-C18 column (1.8μm, 2.1mm×50 mm) 25 °C 0.3 ml/phút Detector MS Thể tích tiêm μl Thời gian sắc ký A: Acetonitrile B: Acid formic 0.1% phút PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU KIỆN KHỐI PHỔ Loại đầu dò Khối phổ ba tứ cực Kiểu quét Ion dương (+) Kỹ thuật ghi phổ MRM (Multiple Reaction Monitoring) Nguồn ion hóa ESI (Ion hóa tia điện) Nhiệt độ khí mang 375°C Lưu lượng khí mang 10 lít/phút Áp suất phun 40 psi PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU KIỆN KHỐI PHỔ Chất Khối lượng Ion mẹ Ion sản phẩm Mảnh vỡ CE Phân tích Phân tử (m/z) (m/z) (V) (V) CBZ 236.1 237.1 194.0 124 17 AI 179.0 180.0 151.0 176 42 IM 193.1 194.1 179.0 148 34 AO 195.0 196.0 167.1 146 40 CBZ-EP 236.0 237.0 181.1 100 24 CBZ-DiOH 270.0 271.0 180.1 100 26 2-OH-CBZ 252.0 253.0 210.1 140 14 3-OH-CBZ 252.0 253.0 210.1 140 14 Phenacetin 179.0 180.0 110.1 80 22 10 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG DƯỚI (LLOQ) VÀ ĐƯỜNG TUYẾN TÍNH Yêu cầu Kết Tỉ số S/N ≥10 >10 Độ 80-120% 80-120% Độ xác ±20% ±15% - Đường tuyến tính thu cách vẽ tỷ lệ diện tích cực đại chất phân tích / chất chuẩn nội so với nồng độ chất phân tích huyết thanh, hệ số tương quan ≥0.99 17 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG DƯỚI (LLOQ) VÀ ĐƯỜNG TUYẾN TÍNH Phạm vi tuyết tính Chất phân tích Hệ số tương quan Phương trình hồi quy tuyến tính (ng/mL) (r) CBZ 50.0-5000.0 y=7.889x+3.398 0.9994 AI 10.0-1000.0 y=2.919x-0.1328 0.9948 IM 100.0-10000.0 y=0.1509x+0.08330 0.9985 AO 0.2-20.0 y=25.68x-0.003500 0.9941 CBZ-EP 50.0-5000.0 y=0.1919x+0.04500 0.9970 CBZ-DiOH 100.0-10000.0 y=0.6286+0.09480 0.9982 2-OH-CBZ 10.0-1000.0 y=0.8065x+0.1141 0.9949 3-OH-CBZ 10.0-1000.0 y=0.8846x+0.01860 0.9998 Với RE chấp nhận khoảng ± 20% 18 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN TỶ LỆ THU HỒI VÀ HIỆU ỨNG NỀN Target compound Nominal concentration (ng/mL) Extraction recovery Mean±S.D.% R.S.D% Matrix effect Mean±S.D.% R.S.D% 100 88.33±3.620 4.1 101.4±4.380 4.3 CBZ 500 83.70±1.750 2.1 103.8±3.990 3.9 2000 84.70±2.380 2.8 99.53±7.920 8.0 0.5 81.90±2.450 3.0 98.57±5.110 5.2 AI 77.03±7.310 9.5 105.4±6.060 5.8 10 74.70±2.380 3.2 99.87±9.470 9.5 20 83.30±5.260 6.3 100.5±4.780 4.8 IM 100 86.97±3.540 4.1 100.7±5.100 5.1 500 91.20±3.360 3.7 101.5±4.650 4.6 200 92.17±3.270 3.6 99.87±4.100 4.1 AO 1000 86.03±3.310 3.9 104.7±5.750 5.5 5000 86.30±9.190 11 100.1±10.06 10 100 92.33±2.630 2.9 101.2±3.590 3.6 19 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN TỶ LỆ THU HỒI (HIỆU SUẤT CHIẾT) VÀ HIỆU ỨNG NỀN Target compound Nominal concentration (ng/mL) Extraction recovery Mean±S.D.% R.S.D% Matrix effect Mean±S.D.% R.S.D% 100 92.33±2.630 2.9 101.2±3.590 3.6 CBZ-EP 500 91.40±3.380 3.7 103.9±6.000 5.8 2000 90.53±3.760 4.2 97.57±7.360 7.6 200 88.10±3.580 4.1 88.50±1.930 2.2 CBZ-DiOH 1000 89.73±5.120 5.7 98.63±5.590 5.7 5000 87.13±3.930 4.5 100.1±6.430 6.4 20 84.33±5.000 5.9 105.4±6.230 5.9 2-OH-CBZ 100 89.70±1.670 1.9 101.8±3.100 3.1 500 86.20±7.450 8.6 101.0±7.060 7.0 20 93.40±2.630 2.8 92.37±4.380 4.7 3-OH-CBZ 100 88.70±4.520 5.1 91.20±3.030 3.3 500 87.90±3.860 4.4 95.20±10.10 11 Phenacetin 1000 85.92±7.640 8.9 98.72±4.320 4.4 20 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN TỶ LỆ THU HỒI VÀ HIỆU ỨNG NỀN - Xác định tỷ lệ thu hồi hiệu ứng cách so sánh đáp ứng chất phân tích chiết từ mẫu thử tự tạo mức nồng độ (thấp, trung bình cao) với đáp ứng mẫu chuẩn đối chiếu khơng chiết (mẫu đối chiếu có nồng độ pha dung môi dịch sinh học thu sau xử lý, có độ phục hồi 100%) Tỷ lệ thu hồi chất chiết phải ổn định xác - Hiệu ứng chất phân tích IS mức nồng độ chấp nhận 88,52% -105,5% Các kết hợp chất nội sinh thực tế khơng có ảnh hưởng đến việc xác định hợp chất mục tiêu - Tỷ lệ Thu hồi chiết xuất hoàn hảo ba cấp độ mẫu QC 74,70% -93,48% 85,92% IS chứng minh phương pháp đáng tin cậy 21 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ĐỘ CHÍNH XÁC VÀ ĐỘ ĐÚNG - Độ xác ngày xác định cách so sánh tỷ lệ diện tích pic lần đo mẫu QC ba mức nồng độ với IS ngày độ xác giửa ngày thực ba đợt ba ngày liên tiếp - Độ xác chấp nhận phạm vi không 15% (CV), ngoại trừ LLOQ chấp nhận phạm vi 20% (CV) - Độ xác định độ lệnh phần trăm so với giá trị lý thuyết không 20% Kết (Bảng sau) độ xác ngày nhỏ 20% độ nằm phạm vi 20%, cho thấy độ xác độ phương pháp chấp nhận để xác định hợp chất cần phân tích huyết tương 22 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ĐỘ CHÍNH XÁC VÀ ĐỘ ĐÚNG Intra-day (n=5) Added Measured Target compound concentration concentration Precision (R.S.D.) Accuracy (RE%a) (ng/mL) (mean±S.D.,ng/mL) Inter-day (n=5) Measured concentration (mean±S.D.,ng/mL) Accuracy (RE% ) Precision (R.S.D.) a 100 114.0±3.080 14 2.7 108.1±9.180 8.5 8.1 500 571.2±20.95 14 3.7 575.0±15.56 2.7 15 2000 1950±26.40 -2.5 1.4 1904±46.57 2.4 -4.8 20 20.14±0.3100 0.70 1.6 19.76±0.4600 2.3 -1.2 100 95.72±1.990 -4.3 2.1 96.98±1.790 1.9 -3.0 500 493.8±4.190 -1.2 0.90 507.8±11.52 2.3 1.6 200 208.9±19.63 4.4 9.4 213.2±16.04 7.5 6.6 1000 1148±26.48 15 2.3 1162±25.58 2.2 16 5000 4237±61.70 -15 1.5 4125±105.8 2.6 -18 0.5 0.4900±0.02000 -2.0 4.7 0.4500±0.04000 9.9 -10 2.140±0.04000 7.0 1.9 2.080±0.06000 2.7 4.0 10 9.590±0.1300 -4.1 1.4 9.490±0.1600 1.7 -5.1 CBZ AI IM AO 23 23 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ĐỘ CHÍNH XÁC VÀ ĐỘ ĐÚNG Intra-day (n=5) Added Measured Target compound concentration concentration Precision (R.S.D.) Accuracy (RE%a) (ng/mL) (mean±S.D.,ng/mL) Inter-day (n=5) Measured concentration (mean±S.D.,ng/mL) Accuracy (RE% ) Precision (R.S.D.) a 100 102.6±5.210 2.6 5.1 100.7±6.680 6.6 0.70 500 583.4±12.02 17 2.1 576.9±11.89 2.1 15 2000 1832±25.07 -8.4 1.4 1802±45.98 2.6 -9.9 200 180.7±14.52 -9.7 8.0 186.1±15.94 8.6 -7.0 1000 1091±23.63 9.2 2.2 1076±20.08 1.9 7.6 5000 4724±174.6 -5.5 3.7 4550±170.1 3.7 -9.0 20 18.85±1.950 -5.8 10 19.91±2.270 11 -0.50 100 109.6±7.340 9.6 6.7 100.7±13.60 14 0.70 500 461.8±33.81 -7.6 7.3 450.6±32.01 7.1 -9.9 20 19.64±1.840 -1.8 9.4 19.74±1.790 9.1 -1.3 100 115.5±5.440 16 4.7 101.6±12.24 12 1.5 500 435.8±27.29 -13 6.3 434.0±26.88 6.2 -13 CBZ-EP CBZ-DiOH 2-OH-CBZ 3-OH-CBZ 23 24 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ĐỘ ỔN ĐỊNH - Độ ổn định chất phân tích huyết tương đánh giá cách lấy mẫu nồng độ thấp, trung bình, cao chất phân tích: + Độ ổn định ngắn hạn: nhiệt độ phòng + Độ ổn định dài hạn: tháng -80°C + Độ ổn định đông rã đông: chu kỳ kết-rã đông -20°C + Độ ổn định sau pha: 24 lấy mẫu tự động 4°C sau kết tủa protein - Kết so với mẫu pha tương đương nồng độ Kết độ ổn định (Bảng sau) cho thấy hợp chất mục tiêu, ba nồng độ nghiên cứu, có độ ổn định chấp nhận giai đoạn thử nghiệm 25 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ĐỘ ỔN ĐỊNH Freeze-thaw stability Nominal Measured concentration Precision concentration (ng/mL) (R.S.D.) (ng/mL) Target compound Short-term stability Measured Precision concentration (R.S.D.) (ng/mL) Long-term stability Measured Precision concentration (R.S.D.) (ng/mL) Post-preparative stability Measured Precision concentration (R.S.D.) (ng/mL) 100 107.6 3.1 100.3 2.7 106.9 2.4 105.0 2.5 500 563.7 5.8 587.7 1.2 562.4 1.3 571.2 2.6 2000 1860 1.5 1819 0.90 1948 1.9 1876 1.2 20 20.04 3.0 19.35 1.2 19.75 2.7 19.71 2.1 100 97.04 2.1 96.95 2.2 97.15 1.8 97.05 1.8 500 514.8 1.7 509.0 0.70 502.9 3.0 508.9 1.6 20 227.9 7.0 215.6 2.7 219.8 3.9 221.1 4.3 100 1155 4.0 1153 4.2 1163 1.6 1157 3.1 500 4256 3.9 4330 4.7 4225 2.6 4270 3.5 0.5 0.4400 4.3 0.4300 2.7 0.4500 1.5 0.4400 2.6 2.060 2.0 2.030 3.2 2.090 2.5 2.060 2.3 10 9.580 2.1 9.470 1.2 9.670 1.5 9.570 1.4 CBZ AI IM AO 25 26 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ĐỘ ỔN ĐỊNH Freeze-thaw stability Nominal Measured concentration Precision concentration (ng/mL) (R.S.D.) (ng/mL) Target compound Short-term stability Measured Precision concentration (R.S.D.) (ng/mL) Long-term stability Measured Precision concentration (R.S.D.) (ng/mL) Post-preparative stability Measured Precision concentration (R.S.D.) (ng/mL) 100 100.1 3.6 96.04 1.3 86.08 3.4 94.07 2.6 500 561.1 1.7 548.0 2.9 563.4 1.6 557.5 1.9 2000 1762 2.3 1737 0.70 1795 2.1 1765 1.5 200 194.1 6.1 201.0 7.4 181.6 5.9 192.2 6.3 1000 1062 1.7 1049 2.2 1039 2.1 1050 1.8 5000 4424 1.0 4336 0.80 4553 1.7 4438 1.0 20 19.98 8.2 21.06 1.7 18.18 5.2 19.74 4.8 100 89.95 8.9 100.1 7.2 98.57 2.0 96.21 5.8 500 434.8 9.5 453.8 5.9 458.9 9.4 449.2 8.1 100 18.22 5.3 19.04 9.6 19.70 6.0 18.99 6.8 500 96.93 4.8 88.85 8.7 94.45 12 93.41 8.4 2000 448.2 8.1 440.8 6.2 441.4 8.3 443.5 7.3 CBZ-EP CBZ-DiOH 2-OH-CBZ 3-OH-CBZ 27 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP - CBZ-EP CBZ-DiOH chất chuyển hóa CBZ với thay đổi lớn nồng độ huyết tương cá nhân khác - Sản phẩm chuyển hóa phụ 2-OH-CBZ 3OH-CBZ xác định 27 74 bệnh nhân số giá trị phát thấp giới hạn định lượng - AI AO tìm thấy với mức độ trung bình 16,2 ng/ml 0,8/ml - IM chiếm tỷ lệ lớn Độ dao động cao so với nghiên cứu tương tự - Khơng có khác biệt đáng kể so với kết FPIA lâm sàng Vì AI,AO,3-OH-CBZ,2-OH-CBZ IM cho nguyên nhân gây độc chế bệnh sinh phản ứng có hại gây CBZ 28 KẾT LUẬN - Phương pháp UHPLC-MS/MS xác định đồng thời CBZ bảy chất chuyển hóa có lợi sử dụng đĩa lắng kết tủa protein 96 giếng nhanh chóng với sản lượng cao tổng thời gian phân tích phút để xác định hồn tồn CBZ bảy chất chuyển hóa - Đặc biệt nước phương Tây, phương pháp thiết lập phương pháp thay đầy hứa hẹn cho FPIA (Miễn dịch huỳnh quang phân cực) - Chứng minh tính khả thi, đặc biệt việc xác định theo dõi nồng độ độc chất điển hình CBZ nghiên cứu dược động học 29 Tài liệu tham khảo - Wei Jiang, Tianyi Xia, Yunlei Yun, Mingming Li, Feng Zhang, Shouhong Gao, Wansheng Chen , UHPLC-MS/MS method for simultaneous determination of carbamazepine and its seven major metabolites in serum of epileptic patients Chromb (2018), https:// doi.org/10.1016/j.jchromb.2018.12.016 - Agilent 6460 Triple Quad Mass Spectrometer (Model K6460) System: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/K333590205_QQQ_Concepts.pdf 30 CÁM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE! Liên hệ nhóm 22: Võ Nam Anh Nguyễn Hoàng Lê An Phạm Thế An Nguyễn Trọng Anh Lê Thanh Tân 31 ... 1 076 ±20.08 1.9 7. 6 5000 472 4± 174 .6 -5.5 3 .7 4550± 170 .1 3 .7 -9.0 20 18.85±1.950 -5.8 10 19.91±2. 270 11 -0.50 100 109.6? ?7. 340 9.6 6 .7 100 .7? ?13.60 14 0 .70 500 461.8±33.81 -7. 6 7. 3 450.6±32.01 7. 1 -9.9... có đầy đủ chất chuyển hóa, đối tượng đa số người khỏe mạnh - Chưa biết đầy đủ chế gây độc CBZ chất chuyển hóa ĐIỂM NỔI BẬT CỦA NGHIÊN CỨU - Xác định đồng thời CBZ chất chuyển hóa - Thời gian... CBZ 500 83 .70 ±1 .75 0 2.1 103.8±3.990 3.9 2000 84 .70 ±2.380 2.8 99.53? ?7. 920 8.0 0.5 81.90±2.450 3.0 98. 57? ?5.110 5.2 AI 77 .03? ?7. 310 9.5 105.4±6.060 5.8 10 74 .70 ±2.380 3.2 99. 87? ?9. 470 9.5 20