Đang tải... (xem toàn văn)
Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC – MS/MS PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CARBAMAZEPINE VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NÓ TRONG HUYẾT TƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN ĐỘNG KINH Wei Jiang, Tianyi Xia, Yunlei Yun, Mingming Li, Feng Zhang, Shouhong Gao, Wansheng Chen Xuất hiện: Journal of Chromatography B Ngày nhận: 11 tháng năm 2017 Ngày sửa đổi: tháng 12 năm 2018 Ngày chấp thuận: 13 tháng 12 năm 2018 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC – MS/MS PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CARBAMAZEPINE VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NÓ TRONG HUYẾT TƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN ĐỘNG KINH 01 Tổng quan – giới thiệu Trang thiết bị 02 03 Kết bàn luận Tổng kết 04 TỔNG QUANGIỚI TỔNG QUAN – GIỚI THIỆU 01 TỔNG QUAN – GIỚI THIỆU Carbamazepine (5H-dibenzo [b, f] azepine-5-carbox-amide, CBZ) • Thuốc điều trị bệnh động kinh • Giới thiệu lần đầu vào năm 1990 • Tác dụng phụ: nhìn đơi, điều hịa, carbamazepine-10,11CYP 3A4 buồn ngủ,v.v epoxide (CBZ-EP) 10,11CYP 2A8 Chuyển hóa Gan dihydro-10,11-trans-dihydroxy- carbamazepine (CBZDiOH) 2- ydroxycarbamazepine (2-OH-CBZ) 3hydroxycarbamazepine (3-OH-CBZ) sản xuất iminostilbene (IM) Myeloperoxidase acridine (AI) acridone (AO) Ngoài ra, bạch cầu, với chức miễn dịch tham gia vào trình oxy hóa CBZ 01 TỔNG QUAN – GIỚI THIỆU GC Tập trung vào nồng độ hai chất chuyển hóa chính: CBZ-EP CBZ-DiOH LC Có mở rộng chất chuyển hóa khác Thời gian phân tích dài: 50 phút UHPLC MS/MS Phân tích đồng thời CBZ chất chuyển hóa Thời gian phân tích ngắn: phút TRANG THIẾT BỊ TRANG THIẾT BỊ 02 2.1 Chemicals and reagents – Hóa chất thuốc thử TRANG THIẾT BỊ • CBZ (carbamazepin) phenacetin (IS) (độ tinh khiết hai > 99,0% ) cung cấp Viện kiểm soát thực phẩm dược phẩm quốc gia (Bắc Kinh, Trung Quốc) • CBZ-EP, IM AI cung cấp SIGMA-ALDRICH (St Louis, MO, USA) • CBZ-DiOH, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ AO cung cấp Toronto Research Chemicals Inc (Toronto Canada) • Methanol acetonitrile phân tích mua từ Cơng ty Merck (Darmstadt, Đức) • Axit formic cung cấp Công ty Tedia Inc (Fairfield, Hoa Kỳ) • Nước siêu tinh khiết sản xuất với Hệ thống nước thuốc thử Milli-Q (Millipore, MA, Hoa Kỳ) • Các đĩa kết tủa protein Ostro 96 giếng(Ostro 96-well protein precipitation plates) lấy từ công ty Waters (Waters, Zellik, Bỉ) 02 TRANG THIẾT BỊ Máy sắc ký lỏng hiệu cao dòng Agilent 1200 đầu dò quang phổ khối ba tứ cực Agilent 6460 (Agilent Corporation, MA, USA) áp dụng cho phân tích UHPLC-MS / MS Thu thập liệu tiến trình phân tích phần mềm xử lý liệu phân tích định lượng Agilent 6460 Phiên B.01.02 (Agilent Corporation, MA, USA) Agilent 6460 Triple Quad Mass Spectrometer (Model K6460) System: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/K333590205_QQQ_Concepts.pdf 2.2 Instrumentation – Thiết bị đo 02 2.3 Chromatographic and mass spectrometric conditions – Điều kiện sắc ký khối phổ TRANG THIẾT BỊ Thông số Điều kiện UHPLC-MS/MS Cột Chế độ ghi phổ Agilent 1200 đầu dò khối phổ ba tứ cực Agilent 6460 XDB-C18 Agilent (1.8μm, 2.1mm × 50 mm) MRM Nhiệt độ cột Thể tích tiêm Tổng thời gian chạy cho lần tiêm Nhiệt độ khí sấy Lưu lượng khí khơ Áp suất máy phun sương 25 0C 2μl phút 325°C 10 lít/phút 40psi Pha động acetonitril (A) axit formic 0,1% nước (B) Điều kiện rửa giải theo gradient Thời gian (phút) %A 0-3 phút 3-5 phút 15% A → 30% A 30% A → 95% A 02 2.4 Analytical procedures – Quy trình phân tích TRANG THIẾT BỊ 2.4.1 Preparation of standard and quality control (QC) solutions – Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch kiểm soát chất lượng Các dung dịch gốc CBZ, AI, IM, AO, CBZ-EP, CBZ-DiOH, 2-OH-CBZ, 3OHCBZ IS: cân xác hòa tan -> nồng độ 1mg/ml Các dung dịch thứ cấp (working solutions): pha loãng dung dịch gốc với methanol 10% theo bảng sau: Mức nồng độ (ng/ml) CBZ AI IM AO CBZ-EP CBZDiOH 2-OHCBZ 3-OHCBZ IS 500 1000 2000 5000 10000 20000 50000 100 200 500 1000 2000 5000 10000 1000 2000 5000 10000 20000 50000 100000 10 20 50 100 200 500 1000 2000 5000 10000 20000 50000 1000 2000 5000 10000 20000 50000 100000 100 200 500 1000 2000 5000 10000 100 200 500 1000 2000 5000 10000 1000 Các dung dịch hiệu chuẩn (Calibration standards): pha loãng dung dịch thứ cấp tương ứng với huyết tương người (không chứa thuốc) theo tỉ lệ 1:9 để đạt mức nồng độ theo bảng: Mức nồng độ (ng/ml) CBZ AI IM AO CBZ-EP CBZ-DiOH 2-OHCBZ 3-OH-CBZ 50-5000 10-1000 100-1000 0.2-20 50-5000 100-10000 10-1000 10-1000 03 3.2 Selection of internal standard – Lựa chọn chất chuẩn nội KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phenacetin qua khảo sát cho hiệu ứng nền, độ phục hồi, phản ứng ion hóa đặc tính sắc ký chứng minh tương tự chất phân tích (target compounds) Phenacetin có hiệu chất chuẩn nội Đảm bảo tính xác phân tích, với tính khả thi giảm chi phí thực hành lâm sàng 03 3.3 Sample preparation – Chuẩn bị mẫu KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phương pháp SPE công nhận phương pháp hiệu việc loại bỏ tín hiệu nhiễu (eliminating interferences) protein (thậm chí lipid) LLE phương pháp phổ biến khác để phân tách hợp chất lipophilic sử dụng dung mơi chiết thích hợp Tuy nhiên, so với tỉ lệ thời gian / dung môi hữu tiêu thụ SPE LLE, phương pháp kết tủa protein đơn giản nhanh chóng áp dụng chủ yếu cho TDM thực hành lâm sàng Sử dụng đĩa kết tủa protein Ostro 96 giếng dùng ACN để kết tủa protein cho hiệu suất cao Đáp ứng nhu cầu mặt thời gian lâm sàng: thời gian chuẩn bị phút phân tích UHPLC-MS/MS vòng phút 03 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.1 Specificity – Tính đặc hiệu KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đỉnh cực đại CBZ bảy chất chuyển hóa IS (chuẩn nội) cho thấy khơng có nhiễu từ chất nội sinh, phân tách đường sở tốt đạt cho thành phần Chất phân tích Thời gian lưu (phút) CBZ 3,3 AI 1,6 IM 4,4 AO 4,2 CBZ-EP 3,7 CBZ-DiOH 2,5 -OH-CB 3,4 3-OH-CBZ 3,7 IS 3,4 Mẫu trắng – huyết khơng chứa thuốc Mẫu chuẩn – mẫu huyết có thêm chất biết trước nồng độ 100 ng/ml Mẫu thử – mẫu huyết bệnh nhân động kinh điều trị với CBZ 03 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.2 LLOQ and linearity of calibration curves – LLOQ độ tuyến tính đường cong hiệu chuẩn Phương pháp cho kết giới hạn định lượng - LLOQ : • 50 ng / ml cho CBZ CBZ-EP • 10 ng / ml cho AI, 3-OH-CBZ 2-OH-CBZ • 100 ng / ml cho IM CBZ-DiOH • 0,2 ng / ml cho AO với RE chấp nhận vòng ± 20% 03 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.3 Extraction recovery and matrix effect – Độ hồi phục hiệu ứng Hiệu ứng chất phân tích IS chấp nhận với 88,52% -105,5% giá trị phù hợp ba cấp độ QC Độ phục hồi phép phân tích 74,70% -93,48% với ba cấp độ mẫu QC 85,92% IS chứng minh phương pháp đáng tin cậy 03 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.3 Extraction recovery and matrix effect – Độ hồi phục hiệu ứng Hiệu ứng chất phân tích IS chấp nhận với 88,52% -105,5% giá trị phù hợp ba cấp độ QC Độ phục hồi phép phân tích 74,70% -93,48% với ba cấp độ mẫu QC 85,92% IS chứng minh phương pháp đáng tin cậy 03 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.4 Precision and accuracy – Độ độ xác Độ xác ngày ngày 20% độ nằm khoảng 20%, cho thấy phương pháp đạt độ xác để xác định chất cần phân tích huyết tương 03 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.4 Precision and accuracy – Độ độ xác Độ xác ngày ngày 20% độ nằm khoảng 20%, cho thấy phương pháp đạt độ xác để xác định chất cần phân tích huyết tương 03 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.5 Stability – Độ ổn định Kết cho thấy chất phân tích, ba nồng độ nghiên cứu, có độ ổn định chấp nhận 03 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết cho thấy chất phân tích, ba nồng độ nghiên cứu, có độ ổn định chấp nhận 3.4.5 Stability – Độ ổn định 03 3.5 Application – Áp dụng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nồng độ trung bình hợp chất mục tiêu Kết tương tự FPIA – phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực lĩnh vực lâm sàng CBZ-EP CBZ-DiOH chất chuyển hóa CBZ với thay đổi lớn nồng độ huyết tương Sản phẩm đường chuyển hóa phụ: 2-OH-CBZ 3-OH-CBZ xác định tương ứng 27 74 bệnh nhân số giá trị phát nằm thấp LLOQ AI AO tìm thấy với nồng vết (trace level) trung bình 16,20 ng/ml 0,8 ng/ml IM, sản phẩm q trình oxy hóa trực tiếp xúc tác hệ thống CYP450, chiếm tỷ lệ lớn tất hợp chất mục tiêu TỔNG KẾT TỔNG KẾT 04 TỔNG KẾT Tốc độ phân tích nhanh (5 phút) Phương pháp xác định đồng thời CBZ bảy chất chuyển hóa phương pháp UHPLC MS/MS Tính khả thi cao việc xác định tác nhân độc hại CBZ nghiên cứu theo dõi TDM nghiên cứu dược động học Phương pháp thay đầy hứa hẹn cho FPIA lĩnh vực lâm sàng 05 TÀI LIỆU THAM KHẢO Wei Jiang, Tianyi Xia, Yunlei Yun, Mingming Li, Feng Zhang, Shouhong Gao, Wansheng Chen , UHPLC-MS/MS method for simultaneous determination of carbamazepine and its seven major metabolites in serum of epileptic patients Chromb (2018), https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2018.12.016 Agilent 6460 Triple Quad Mass Spectrometer (Model K6460) System: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/K333590205_QQQ_Concepts.pdf Cám ơn thầy bạn .. .ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC – MS/MS PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CARBAMAZEPINE VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NÓ TRONG HUYẾT TƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN ĐỘNG KINH 01 Tổng quan – giới thiệu Trang thiết... thấy phương pháp đạt độ xác để xác định chất cần phân tích huyết tương 03 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.5 Stability – Độ ổn định Kết cho thấy chất phân tích, ... gia vào trình oxy hóa CBZ 01 TỔNG QUAN – GIỚI THIỆU GC Tập trung vào nồng độ hai chất chuyển hóa chính: CBZ-EP CBZ-DiOH LC Có mở rộng chất chuyển hóa khác Thời gian phân tích dài: 50 phút UHPLC