Đang tải... (xem toàn văn)
Trong khuôn khổ của nghiên cứu này hành khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh và mới nhất, với mục tiêu là tìm ra những chủng E. ictaluri có độc lực cao làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn như sản xuất vắc-xin hay nghiên cứu chọn giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN KHẢO SÁT, PHÂN LẬP VÀ LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC MẠNH VÀ MỚI NHẤT Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Hồng Lộc1, Võ Hồng Phượng1, Trịnh Quốc Trọng2 TĨM TẮT Từ 50 mẫu cá có biểu bệnh gan thận mủ thu tỉnh ĐBSCL từ tháng 03/2010 đến tháng 05/2013, nhóm nghiên cứu phân lập bốn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri I, II, III, IV có khả gây bệnh thực nghiệm cá tra Qua khảo sát độc lực bốn chủng vi khuẩn, chủng Edwardsiella ictaluri I IV có độc lực cao gấp đơi so với chủng lại với LD50 khoảng 2x104 CFU/0,2 ml/cá Với liều tiêm 106 CFU/cá, cá bắt đầu chết sau ngày tiêm, chủng E ictaluri I gây chết sớm cho tỉ lệ chết cao (99%) so với chủng vi khuẩn cịn lại Chủng III có tỉ lệ chết thấp Ở liều tiêm 105 CFU/cá, cá chết ngày thứ sau tiêm tập trung nhiều vào ngày 3, & sau tiêm So với chủng vi khuẩn khác chủng I cho tỷ lệ chết cao (85%) sớm Ở liều tiêm thấp 104 CFU/cá, cá bắt đầu chết vào ngày thứ chết tập trung từ ngày 4-6 sau tiêm Trong số chủng vi khuẩn thử nghiệm có chủng IV cho tỷ lệ chết cao (50%) chủng I gây chết sớm so với chủng lại Kết cho thấy, vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ cá tra gồm nhiều chủng có độc lực cao thấp khác nhiên khác biệt khơng đáng kể Từ khóa: vi khuẩn, gây nhiễm, tiêm I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, ngồi việc mở rộng diện tích ni trồng thủy sản việc đa dạng hóa đối tượng ni quan tâm đáng kể Nhiều đối tượng nuôi thích ứng với vùng địa lý khác nghiên cứu phát triển Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) xem đối tượng nuôi chủ lực nước tập trung phát triển nuôi chủ yếu khu vực Đồng sông Cửu Long Với điều kiện thích hợp, số tỉnh có diện tích sản lượng cá tra lớn Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long Hậu Giang Tuy nhiên, tình hình ni cá tra gặp nhiều khó khăn vấn đề dịch bệnh giá thị trường tiêu thụ Nghiên cứu cho thấy, cá tra thường xuất loại bệnh gan thận mủ, xuất huyết, phù đầu, trắng gan, trắng mang ký sinh trùng Trong đó, bệnh gan thận mủ xem bệnh thường xuất nguy hiểm Theo báo cáo Cục Thú Y, năm 2013 loại dịch bệnh cá tra xảy 71 xã thuộc 21 huyện tỉnh nuôi cá tra tập trung ĐBSCL với tổng diện tích ao cá có cá nhiễm bệnh 732,1 bệnh gan thận mủ chiếm tỷ lệ cao (48%) Bệnh gan thận mủ cá tra Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản * Email: lehongphuoc@yahoo.com Trung tâm Quốc gia giống thủy sản nước khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 87 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN xác định tác nhân vi khuẩn E ictaluri (Crumlish ctv., 2002) gây Loài vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae E Ictaluri, phần lớn biết đến tác nhân gây bệnh xuất huyết nội tạng (Enteric septicaemia of catfish- ESC) cá nheo (Ictalurus punctatus) Mỹ (OIE, 2006) Cho đến nay, nghiên cứu liên quan đến tác nhân cá tra quan tâm nghiên cứu đặc tính sinh hóa, di truyền, dịch tễ độc lực Trong khuôn khổ nghiên cứu này, tiến hành khảo sát, phân lập lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh nhất, với mục tiêu tìm chủng E ictaluri có độc lực cao làm tiền đề cho nghiên cứu sâu sản xuất vắc-xin hay nghiên cứu chọn giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập E ictaluri Mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập vi khuẩn gan, thận cá tra bệnh gan thận mủ, cá bệnh thu làm nhiều đợt từ tháng 03/2010 đến 05/2013 (Bảng 1) Bảng Thông tin mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập E ictaluri Đợt thu Thời gian Đợt 03/2010 Số lượng mẫu Cỡ cá 14 20-25 g 16 >40 g Địa điểm An Giang Đợt 05/2012 20-25 g Bến Tre Đợt 01/2013 10 20-25 g Tiền Giang Đợt 05/2013 25-30 g Tiền Giang 88 2.1.2 Cá tra thí nghiệm Cá tra thí nghiệm có trọng lượng từ 20 đến 25 g/con Cá thí nghiệm khỏe mạnh, khơng bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri Cá chuyển phịng thí nghiệm ướt dưỡng 2-3 tuần Sau đó, cá chuyển vào bể kính từ 7-10 ngày, kiểm tra diện E ictaluri gan, thận, lách cá môi trường thạch máu trước tiến hành thí nghiệm 2.1.3 Mơi trường ni cấy, phân lập vi khuẩn Môi trường dùng để phân lập vi khuẩn mơi trường thạch máu có bổ sung 5% máu cừu Các môi trường khác dùng để tăng sinh vi khuẩn bao gồm môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHIB) Nutrient Broth (NB) Môi trường thạch chuẩn bị cách dùng môi trường lỏng thêm vào 15 g Agar cho lít mơi trường 2.1.4 Hóa chất khác Cồn 70%, cồn 90%, dung dịch đệm pH 7, nước muối 0,85% NaCl, thuốc tím, Chlorine, dung dịch Formaline (Merck) để bất hoạt vi khuẩn, thuốc gây mê cho cá EGME - C2H10O2 (Merck, Đức),… 2.1.5 Dụng cụ thí nghiệm Máy trộn mẫu, máy quang phổ đo OD, tủ ấm, tủ cấy vi sinh, tủ lắc ổn nhiệt, tủ mát 40C, tủ lạnh âm 20oC, âm 70oC, máy ly tâm lạnh, cân điện tử, kim tiêm 1ml, kim tiêm tự động, ống nghiệm, eppendorf, đĩa petri, bể composite 1m3, bể kính (80 lít) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu mẫu Thu mẫu cá tra có biểu bệnh tích điển hình bệnh gan thận mủ (đốm trắng mủ gan - thận) Tiến hành thu mẫu cá bệnh dịch bệnh bùng phát thu tối thiểu 3-5 mẫu/ao, thu cá bệnh nặng chết cá sống có TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN dấu hiệu lâm sàng điển hình Thu mẫu quan nội tạng cá, cho vào eppendorf điều kiện vô trùng bảo quản lạnh (4oC) Mẫu thu chuyển đến phòng thí nghiệm sớm tốt để tiến hành phân lập định danh 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập định danh vi khuẩn Dùng môi trường: Blood agar, BrainHeart Infusion Agar để phân lập vi khuẩn Sử dụng test kit API 20E để test sinh hóa định danh vi khuẩn theo khóa phân loại Bergey (1996) Ngồi cịn xác định E ictaluri phương pháp PCR Sử dụng cặp mồi EiFd-1 (5’GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC-3’), EiRs-1 (5’- GAACGCTATTAACGCTCACACC-3’) để khuếch đại đoạn trình tự dài 407 bp thuộc gen 16S rRNA, đặc hiệu cho loài vi khuẩn E ictaluri (Panangala ctv., 2007) 2.2.3 Phương pháp tách nucleic acid vi khuẩn Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cho vào 1ml nước cất vơ trùng, hịa đều, ly tâm 10 phút với tốc độ 13.000 g, bỏ dịch Cặn huyền phù với 500 µl dịch đệm ly trích DNA (50 mM Tris, pH 8; mM EDTA, pH 8; 500 mM NaCl; 1% SDS 10 µg/ml Proteinase K), ủ 100°C 10 phút, để nguội sau ly tâm 13.000 g phút Tủa dịch thể tích cồn tuyệt đối, ly tâm 13.000 g 10 phút thu tủa DNA Loại bỏ dịch để tủa DNA khô tự nhiên, hịa tan tủa DNA nước cất vơ trùng giữ -20°C 2.2.4 Phương pháp xác định LD50 Xác định mật độ vi khuẩn tương đối canh trùng gốc thông qua giá trị OD550nm đếm khuẩn lạc đĩa thạch Tiến hành pha loãng canh trùng gốc để dãy mật độ vi khuẩn cho tiêm vào cá với liều 104, 105, 106 CFU/0,2 ml/cá Mỗi nồng độ tiêm cho 20 cá Theo dõi tỷ lệ sống chết nồng độ pha lỗng tính liều LD50 theo Reed-Muench (1938) 2.2.5 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn E.ictaluri lấy từ ống giữ giống (âm 70°C) cấy môi trường thạch máu (BA) ủ nhiệt độ 28°C thời gian 24 sau tiếp tục đưa vi khuẩn vào mơi trường BHIB (pH 7, nhiệt độ 28°C ni lắc 200 vịng/phút) với mật độ 103 CFU/ml tăng sinh thời gian 24 sau đo mật độ OD550nm xác định mật độ tế bào trước công vào cá tra với liều 0,2 ml dịch vi khuẩn/cá Gây bệnh thực nghiệm phương pháp tiêm: Gây mê cá thí nghiệm EGME (Ethylene Glycol Monophenyl Ether, Merck) 0,2 ppt (1 ml EGME lít nước) 3-5 phút Sử dụng kim tiêm bán tự động (Socorex) với chiều dài mũi kim tiêm mm dùng cho cá 10-40 g để đảm bảo an tồn cho cá thí nghiệm Mũi kim tiêm vào xoang bụng cá vị trí hai vây bụng cá tra chếch góc 45° 2.2.6 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Tại thời điểm thu mẫu kiểm tra OD550nm, canh khuẩn pha loãng theo hệ số 10 tiến hành cấy đĩa thạch để xác định mật độ vi khuẩn Sau pha loãng dùng micropipette hút 0,1 ml cho vào đĩa thạch NA Tương ứng với độ pha loãng cấy đĩa Dùng que cấy chang canh khuẩn mặt thạch sau cho vào tủ ấm 28ºC tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc sau 36h ni cấy, tính mật độ vi khuẩn theo công thức: A (tế bào/ml) = (a + b)/2 x 10 x D Trong đó: A mật độ vi khuẩn (tế bào/ml) a, b số khuẩn lạc mọc đĩa đĩa ứng với độ pha loãng xác định D = độ pha lỗng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 89 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát độc lực vi khuẩn Mục đích thí nghiệm để so sánh độc lực chủng vi khuẩn E ictaluri phân lập Thí nghiệm bố trí bể kính Mỗi bể kính chứa 20 cá có trọng lượng trung bình 20 g Cá thí nghiệm tiêm canh khuẩn với liều 104, 105 106 CFU/0,2 ml/cá Cá đối chứng tiêm với nước muối sinh lý Mỗi nghiệm thức thí nghiệm lập lai lần Sau tiêm, cá bố trí vào bể kính cho nhịn đói vịng Sau đó, cá cho ăn bình thường Theo dõi cá chết hàng ngày sau tiêm kết thúc thí nghiệm sau tuần Thu mẫu cá chết bể vào ngày cá chết tập trung, thu ngẫu nhiên cá/bể cho phân tích vi khuẩn kiểm tra tác nhân gây bệnh III KẾT QUẢ 3.1 Kết phân lập, định danh vi khuẩn từ mẫu cá tra bệnh Kết phân lập E ictaluri qua đợt thu mẫu thu 04 chủng E ictaluri I, II, III IV Kết kiểm tra sinh hóa từ chủng vi khuẩn trình bày bảng Các chủng E ictaluri gây tan huyết môi trường thạch máu, khuẩn lạc nhìn rõ sau 36-48 cấy đĩa thạch (Hình 1) nhuộm Gram cho thấy vi khuẩn có dạng trực khuẩn Gram âm Bảng Kết kiểm tra sinh hóa chủng vi khuẩn E ictaluri Phản ứng Chủng vi khuẩn E ictaluri I E ictaluri II E ictaluri III E ictaluri IV ONPG + + + - ADH - - - - LDC - + + + ODC - - - - CIT + + + d H2S - - - - URE - - - - TDA - - - - VP + + + d GEL + + + - GLU + + + + MAN - d d - INO - - - - SOR - - - - RHA - - - - SAC - d d - MEL + - - - AMY - d d - ARA + d d - NIT + + + - O/F +/+ +/+ +/+ +/+ LAC + + + + NO3 + + + + + + + - ESCULIN Ghi chú: (-): âm tính, (+) dương tính, d: dương tính khơng rõ 90 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 6/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Hình Các chủng vi khuẩn E ictaluri I, II, II, IV môi trường thạch máu Kết kiểm tra PCR 16S rRNA E ictaluri (Panangala cvt., 2007) cho thấy chủng E ictaluri cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 407 bp, tương ứng với chủng chuẩn E ictaluri LMG7860 (Hình 2) Hình Điện di sản phẩm PCR M: DNA 100bp plus (ABM, Canada), chứng âm (-) sử dụng nước cất, chứng dương (+) DNA vi khuẩn E ictaluri LMG7860 (Đại học Ghent, Bỉ) 3.2 Kết khảo sát độc lực chủng vi khuẩn E ictaluri Ở thí nghiệm này, với liều tiêm 106 CFU/ cá, cá bắt đầu chết sau ngày tiêm Chủng E ictaluri I cho tỷ lệ chết sớm cao so với chủng vi khuẩn lại (Đồ thị 1) Chủng E ictaluri III cho tỉ lệ chết thấp có ý nghĩa thống kê (p