sự biến đổi các chỉ huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri có độc lực khác nhau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG VĂN NHÍ SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG VĂN NHÍ SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. PHẠM THANH LIÊM 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i LỜI CẢM TẠ Xin gởi lời cảm tạ sâu sắc đến thầy Phạm Thanh Liêm đã tạo điều kiện cho tôi được thực nghiệm và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin gởi lời cảm ơn quý báo đến cô Đặng Thị Mai Thy, cô Nguyễn Thị Thu Hằng cùng với tất cả các quý thầy cô, các anh chị cán bộ trong khoa Thủy Sản nói riêng và trường Đại học Cần Thơ nói chung đã truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức nền tảng quý báo trong suốt thời gian học tập ở trường và làm luận văn tốt nghiệp. Cảm ơn cha mẹ và các anh chị tôi đã động viên và tạo điều kiện cho tôi được hoàn thành tốt việc học tập trong suốt 4 năm theo học ở trường. Tôi xin cảm ơn bạn Nguyễn Thị Chúng, bạn Lê Thượng Khởi đã cùng thực hiện đề tài với tôi và cuối cùng là tất cả các bạn cùng lớp Bệnh học Thủy sản khóa 31 đã nhiệt tình động viên và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập ở trường. Xin chân thành cảm ơn! PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii TÓM TẮT Đề tài “Sự biến đổi các chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực khác nhau” nhằm xách sự biến động các chỉ tiêu huyết học của cá tra giống khi cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD 50 khác nhau. Đề tài được thực hiện trên ba chủng chủng T8, KSL 103, CAF 258 với hai đối chứng (một đối chứng tiêm nước muối sinh lý và một đối chứng không tiêm). Nồng độ vi khuẩn gây cảm nhiễm là liều gây chết 50% tương ứng với từng chủng vi khuẩn, thời điểm thu mẫu được được định là thu trước khi thí nghiệm,; thu lần 1 sau khi gây cảm nhiễm và lần 2 được thu sau 12 ngày cảm nhiễm. Hồng cầu được phân tích theo phương pháp của Natt and Herrick, (1952), bạch cầu được phân tích theo phương pháp của Humason, (1979), số liệu thống kê được sử lý bằng trương trình SPSS 16.0 (sử dụng phép thử phép thử Ducan và phép thử LSD). Sau khi phân tích nhậ thấy: sự biến động về số lượng tế bào hồng cầu giữa 3 chủng T8, KSL 103, CAF 258 là giống nhau; Chủng T8 có tỷ lệ giảm số lượng TBC, lympho, tiểu cầu ít hơn, BCĐN thì cao hơn chủng KSL 103 và CAF 258; Khả năng phục hồi TBC ở chủng T8 nhanh hơn, còn BCTT và BCĐN thì chủng CAF 258 nhanh hơn. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii MỤC LỤC Trang Phần 1:ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi thâm canh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 3 2.2 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra 3 2.2.1 Sơ lược về lịch sử bệnh do E.ictaluri gây ra trên cá trơn 3 2.2.2 Đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa 4 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 4 2.3 Các chỉ tiêu huyết học 5 2.3.1 Hồng cầu 6 2.3.2 Tế bào lympho 6 2.3.3 Tiểu cầu 6 2.3.4 Bạch cầu đơn nhân 6 2.3.5. Bạch cầu trung tính 6 2.3.6 Một số nghiên cứu về huyết học trên cá 8 2.4 Một số kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong phòng thí nghiệm 9 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Thời gian và địa điểm 11 3.2 Vật liệu nghiên cứu 12 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 12 3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 12 3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu 12 3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể 12 3.3.2 Cách chuẩn bị dung dịch vi khuẩn 12 3.3.3 Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cá 13 3.3.4 Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm 14 3.3.5 Thời gian thu mẫu 14 3.4 Phương pháp phân tích mẫu 14 3.4.1 Phương pháp đếm hồng cầu (Natt and Herrick, 1952) 15 3.4.2 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu (Humason, 1979) 16 3.5 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri theo phương pháp truyền thống 17 3.6 Xử lý số liệu 17 PHẦN 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 18 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv 4.1 Đặc điểm cá thí nghiệm 18 4.1.2 Đặc điểm bên ngoài 18 4.1.3 Đặc điểm bên trong 18 4.2 Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri 19 4.3 Kết quả phân tích huyết học 21 4.3.1 Hồng cầu 22 4.3.1.1 Hình tái hồng cầu 22 4.3.1.2 Số lượng hồng cầu 23 4.3.2 Bạch cầu 25 4.3.2.1 Tổng bạch cầu 25 4.3.2.2 Các loại tế bào bạch cầu 28 4.4 Mức độ biến động về huyết học giữa các chủng vi khuẩn 31 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề xuất 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 Phụ lục 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.3 5. Tế bào máu 8 Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 14 Hình 3.4 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu 16 Hình 3.4.1 Buồng đếm hồng cầu 17 Hình 4.1 Hệ thống các bể bố trí thí nghiệm 18 Hình 4.1.3 Nội tạng cá tra bị nhiễm E. Ictaluri 19 Hình 4.2.1 Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 19 Hình 4.2.2 Kết quả test sinh hóa vi khuẩn E. Ictaluri 20 Hình 4.3.1.1a Hồng cầu cá khỏe 23 Hình 4.3.1.1bHồng cầu cá bệnh 23 Hình 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 25 Hình 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 28 Hình 4.3.2.2 Hình thái các tế bào bạch cầu 31 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.2.1 Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm 11 Bảng 4.2 Kết quả tái định danh vi khuẩn sau khi gây cảm nhiễm 21 Bảng 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu (tế bào x 10 5 /mm 3 ) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 23 Bảng 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC (tế bào x 10 4 /mm 3 ) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 26 Bảng 4.3.2.2a Sự biến động số lượng lympho (tế bào x 10 3 /mm 3 ) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 29 Bảng 4.3.2.2b Sự biến động số lượng tiểu cầu (tế bào x 10 3 /mm 3 ) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 29 Bảng 4.3.2.2c Sự biến động số lượng bạch cầu trung tính (tế bào x 10 3 /mm 3 ) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 30 Bảng 4.3.2.2d Sự biến động số lượng bạch cầu đơn nhân (tế bào x 10 3 /mm 3 ) qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluric 30 Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 1 31 Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 2 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long TGTM: Trắng gan, trắng mang Tb: tế bào BCTT: Bạch cầu trung tính BCĐN: Bạch cầu đơn nhân TBC: Tổng bạch cầu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Gới thiệu Hiện nay nuôi trồng thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước, sản lượng, diện tích ngày càng tăng. Riêng Đồng Bằng Sông Cửu Long, tính đến năm 2008 đã hơn 1,2 triệu ha diện tích mặt nước có khả năng nuôi trồng thủy sản, chiếm gần bằng 60% của cả nước, trong đó diện tích có khả năng nuôi thuỷ sản nước ngọt trên 500.000 ha và được xác định là có điều kiện rất thuận lợi. Giá trị xuất khẩu cũng rất lớn, năm 2007 tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đạt 2,328 tỷ USD, năm 2008 tăng lên 2,5 tỷ USD, chiếm hơn 60% tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước. Trong đó cá tra là một trong những đối tượng thủy sản được xuất khẩu nhiều nhất, năm 2008 Đồng Bằng Sông Cửu Long có 5.102ha diện tích ao nuôi (tăng 11% so năm 2007), với sản lượng cá trên 1 triệu tấn, xuất khẩu trên 535 ngàn tấn qua 117 quốc gia (http://seafoodno4.com/chitiettt.php?id=143). Để đảm bảo sản lượng xuất khẩu nên bên cạnh việc tăng diện tích nuôi người dân còn đẩy mạnh việc nuôi cá với mật độ cao, dẫn đến nhiều yếu tố bất lợi như ô nhiễm nguồn nước, dịch bệnh thường xuyên xảy ra… gây nhiều tổn thất cho người nuôi. Vì vậy, nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu và phòng chống dịch bệnh trên thủy sản đựơc thực hiện là đều tất yếu. Kết quả điều tra của Lý Thị Thanh Loan (2008 ) về tình hình dịch bệnh năm 2007 ở đồng bằng sông Cửu Long thì tần suất xuất hiện bệnh mủ gan là 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70% và vàng da: 21,60%,trong đó bệnh mủ gan gây nhiều tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi. Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 (Ferguson et al , 2001). Về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra đã được Từ Thanh Dung (2005) xác định là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi. Khi bệnh cá bơi lờ đờ, bỏ ăn, thân, vi và hậu môn bị huyết, đồng thời trên gan, thận và tụy tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm bên trong chứa dịch màu trắng đục. Cùng với việc xác định được tác nhân gây bệnh, từ trước đến nay đã có nhiều chủng vi khuẩn được phân lập từ các ao nuôi cá bị bệnh mủ và gây cảm nhiễm trở lại trong phòng thí nghiệm nhằm tìm hiểu khả năng gây bệnh, đặc điểm sinh hóa, tìm hiểu độc lực…Tuy nhiên, vẫn chưa có chủng vi khuẩn nào đã phân lập, được tìm hiểu về huyết học. Vì vậy đề tài “Sự biến đổi các chỉ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2 tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực khác nhau” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu Xác định sự biến động các chỉ tiêu huyết học của cá tra giống khi cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD 50 khác nhau 1.3 Nội dung thưc hiện • Gây cảm nhiễm cho cá tra giống với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD 50 khác nhau. • Định loại và định lượng các tế bào máu trên cá tra cảm nhiễm. • Tái phân lập và định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... nhân gây bệnh để chắc chắn rằng chủng vi khuẩn phân lập được là chủng vi khuẩn ban đầu đem gây cảm nhiễm Bởi vì khi cá có dấu hiệu nhiễm bệnh thì tác nhân gây ra chưa hẳn là do chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm, mà nó còn có thể là kết quả của vấn đề môi trường xấu hoặc do vi khuẩn khác gây ra Hơn nữa tác nhân gây bệnh phải luôn tìm thấy trên sinh vật nhiễm bệnh và tác nhân gây bệnh phải được xác định từ... Về hình thái các tế bào bạch cầu thì không có gì biến đổi giữa cá khỏe với các lần thu mẫu và giữa các chủng vi khuẩn với nhau nhưng có sự biến động rất lớn về số lượng tế bào lympho, tiểu cầu giữa cá trước TN với các đợt thu mẫu, còn bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân nhìn chung ít biến động Lympho: Theo Hibiya (1982) tế bào lympho chiếm 70-90% TBC của cá, kết quả định lượng lympho ở chủng T8 là156,1x103... có kích thước biến đổi, phát triển tốt ở 280C và phát triển yếu ở 370C Điều này lý giải tại sao E .ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá mà chưa tìm thấy trên các động vật máu nóng khác Theo Lương Trần Thục Đoan (2006), khi kiểm tra đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn E .ictaluri 224 phân lập trên cá tra ở Vi t Nam thì chỉ tiêu citrate cho kết quả dương tính, đây là điểm khác biệt so với vi khuẩn E .ictaluri. .. so với cá trước TN, sau 12 ngày gây cảm nhiễm cá có dấu hiệu phục hồi, số lượng hồng cầu của cá thu ở lần 2 tăng lên so với lần 1 nhưng vẫn còn thấp hơn so với cá trước TN Kết quả phân tích số lượng hồng cầu ở cá đối chứng có giảm hơn so với cá trước TN nhưng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Riêng đối chứng ở chủng T8, có số lượng hồng cầu giảm nhiều so với cá trước TN nhưng kết quả vi sinh ở các. .. độ (Branson, 1993) nên sự khác biệt của các thông số huyết học giữa các nghiên cứu có thể là do ảnh hưởng của các nhân tố trên Từ bảng 4.3.1.2 có thể thấy sự biến động số lượng hồng cầu ở cả 3 chủng là tương tự nhau, đều giảm so với cá trước TN ở lần thu thứ 1 và tăng lên so với lần 1 ở lần thu thứ 2 nhưng vẫn còn thấp hơn so với cá trước TN Ở lần thu thứ 1, số lượng hồng cầu ở chủng CAF 258 được xác... đều có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p . Sự biến đổi các chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực . khác nhau nhằm xách sự biến động các chỉ tiêu huyết học của cá tra giống khi cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD 50 khác nhau.