Phân lập đánh giá các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA đến nảy mầm cũng như sự sinh trưởng và phát triển cây lúa

Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp hormone IAA là những chủng vi khuẩn đem lại sự tương tác tốt với thực vật giúp cái thiện sự sinh trưởng phát triển thực vật hướng tới một tiềm năng lớn cho phát triển các dòng kích thích sinh trưởng sinh học an toàn cho cây trồng và môi trường

LỜI CẢM ƠN

Sau 4 năm học tập tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, trong quá trình thực tập tốt nghiệp tại Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, nhờ sự giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của bộ môn, cùng với sự nỗ lực, học tập của bản thân, em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.

Em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, và những người thân của em đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Đặng Thị Thanh Tâm, giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học thực vật đã tận tình hướng dẫn và dạy dỗ em trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới ThS Nguyễn Thị Thủy, ThS Phạm Thị Thu Hằng cán bộ tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật

đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài, em xin gửi lời cảm ơn đến sinh viên Nguyễn Thị Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện các thí nghiệm lây nhiễm, em xin cảm ơn đến nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học do giảng viên Đặng Thị Thanh Tâm hướng dẫn đã giúp đỡ em các thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, và em xin cảm ơn toàn thể bạn bè và các anh, chị đang thực tập tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực tập.

Hà Nội, ngày 01 tháng 01 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Hoàng Mạnh Hùng

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

TT Chữ viết

tắt

6 IAA Indol - 3 - acetic acid

rhizobacteria

Vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng

trưởng thực vật

8 PSB Phosphate solution bacteria Vi khuẩn phân giải phốt pho

9 PSF Phosphate solution fungi Nấm phân giải phốt pho

microorganism

Vi sinh vật phân giải phốt pho

11 PGP Plant growth promoting Thúc đẩy tăng trưởng thực vật

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

TÓM TẮT

PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) được gọi là những chủng vi khuẩnvùng rễ thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật Nhóm vi khuẩn tổng hợp IAA là nhóm vikhuẩn vùng rễ đang được nghiên cứu hiện nay nhằm cải thiện tỉ lệ nảy mầm hạt giống,chất lượng cây trồng thông qua sự thúc đẩy nảy mầm, tăng chiều cao của cây, tăng chiềudài và diện tích bề mặt rễ, do đó cho phép các loài thực vật dễ hấp thu chất dinh dưỡng vànước từ đất Đề tài này nhằm phân lập, sàng lọc, tuyển chọn, đánh giá được các chủng vikhuẩn có khả năng tổng hợp IAA đối với sự nảy mầm của hạt cũng như sự phát triển củacây con

Từ hai vị trí địa lý khác nhau (Thị trấn Trâu Quỳ, Hà Nội; Huyện Nam Sách, HảiDương) chúng tôi tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn trên bề mặt rễ và cộng sinh cùngvới rễ lúa và tuyển chọn được 4 chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA cao nhất sovới một số chủng phân lập từ sản phẩm thương mại là: RHT1 (857,8 µg/ml); RHT2(855,85 µg/ml); RĐ15 (621,75 µg/ml); RA22 (781,3 µg/ml)

Bốn chủng vi khuẩn sau khi đã tuyển chọn được tiếp tục nghiên cứu môi trườngthích hợp cho khả năng tổng hợp IAA được tốt nhất thông qua việc xác định các nhân tốảnh hưởng như pH, thời gian, các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nồng độ của tiền chất, Kết quả của nghiên cứu này đã tìm ra được một môi trường tối ưu nhất cho khả năng tổnghợp IAA đối với từng chủng vi khuẩn là khác nhau Đối với chủng RHT1 thì môi trườngtối ưu là môi trường: King’B + 3g/l L-Tryptophan + 1% Saccarose + 1,5% KNO3 và môitrường có pH = 6 Môi trường thích hợp với chủng RHT2 là môi trường King’B + 3g/l L-Tryptophan + 1% Manitol với pH = 8 Môi trường King’B + 3g/l L-Tryptophan + 1%Glucose + 0,5% KNO3 với pH = 5 là môi trường tối ưu nhất cho chủng vi khuẩn RĐ15.Còn chủng RA22 đạt được nồng độ IAA cao nhất khi được nuôi cấy trong môi trườngKing’B + 3g/l L-Tryptophan + 1% Saccarose + 0,5% KNO3 với giá trị pH = 5

Đề tài này mở ra một giải pháp mới cho việc thay thế các chất kích thích tăngtrưởng hóa học bằng các chất kích thích tăng trưởng nội sinh được sinh ra trong các

chủng vi khuẩn có lợi PGPR giúp kích thích sự nảy mầm của hạt cũng như sự phát triểncủa cây trổng Các chủng vi khuẩn này với có những kết quả tác động khác nhau khi lâynhiễm trên hạt giống của 8 giống lúa khác nhau Các chủng vi khuẩn đều được lây nhiễmvới hạt lúa ở giá trị OD600 = 0,1 ở hai trường hợp là độc lập và kết hợp Trong 8 giống lúađược lây nhiễm với các công thức vi khuẩn khác nhau thì có 6 giống lúa cho kết quả vềkhả năng sinh trưởng của cây nảy mầm từ hạt tốt hơn với công thức đối chứng Cụ thểgiống BC15 đạt được khả năng sinh trưởng cao nhất là 1297,52 khi lây nhiễm với côngthức RĐ15.RA22; giống Nv1 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 640,42 với công thức

vi khuẩn RHT2; giống BT7 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 838,70 khi lây nhiễm vớicông thức RHT2; giống KD18 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 670,00 khi lây nhiễmvới công thức RHT1.RA22; giống N46 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là 1046,00 khilây nhiễm với công thức RĐ15.RA22; giống T23 có khả năng sinh trưởng tốt nhất là924,30 khi lây nhiễm với công thức RA22 Còn 2 giống lúa còn lại N91, T65 cũng đượclây nhiễm với các công thức vi khuẩn tương tự như các giống lúa còn lại nhưng khả năngsinh trưởng thấp hơn công thức đối chứng có thể được giải thích về khả năng tổng hợpIAA quá cao của các chủng vi khuẩn dẫn đến tác động vào sự cân bằng của nồng độauxin nôi sinh, auxin ngoại sinh của mô tế bào thực vật và sự mất cân bằng giữa tỷ lệgiữa auxin và cytokinin nên đã dẫn đến kết quả thấp hơn các công thức đối chứng Nhưvậy có thể thấy rằng tùy thuộc vào từng giống lúa khác nhau, vào nồng độ của hormonenội sinh, sự tương tác của các đơn chủng hay đa chủng vi khuẩn có sự ảnh hưởng nhấtđịnh đến khả năng sinh trưởng của từng giống

PHẦN I MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Theo nghiên cứu và số liệu thống kê của Godfray và cộng sự (2010), dân số thếgiới được giả định tăng từ 7 tỷ ở hiện tại lên 8,3 tỷ USD trong năm 2025 và như vậy thếgiới sẽ cần nhiều thức ăn hơn 70 đến 100 % vào năm 2050 Chính vì thế, việc sản xuấtcác loại ngũ cốc, đặc biệt là lúa mì, gạo và ngô, chiếm một nửa lượng calo của con người,cũng phải được tăng lên để đáp ứng nhu cầu Hiện nay, sự tăng trưởng sinh khối thực vậtđược tăng cường bởi các nguồn bổ sung của hóa chất mà hoạt động như chất điều hòasinh trưởng thực vật (sử dụng một cơ chế kích thích tố) và các chất dinh dưỡng Các chấtdinh dưỡng được bổ sung vào đất thành phần chủ yếu lànitơ, phốt pho và kali TheoRoberts (2009) việc sử dụng toàn cầu hàng năm của nitơ hóa học, phốt pho và phân bónkali là 130, 40, và 35 triệu tấn Tương ứng với việc sử dụng nhiều của hóa chất trongtrồng trọt dẫn đến một số vấn đề như ô nhiễm nước, suy thoái đất, mất đa dạng sinh học

và tăng nguy cơ ảnh hưởng có hại đến sức khỏe cho con người

Hiện nay một hướng nghiên cứu đang rất được các nhà khoa học quan tâm đó là

sử dụng các vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích sinh trưởng của thực vật (plantgrowth-promoting rhizobacteria - PGPR) Vi khuẩn thúc đẩy sinh trưởng thực vật là cácloài vi khuẩn có thể được tìm thấy trong các vùng rễ, bề mặt rễ và có thể cải thiện mức độhay chất lượng sự phát triển của thực vật một cách trực tiếp và hoặc gián tiếp Một trongnhững cơ chế trực tiếp mà nhóm vi khuẩn PGPR giúp tăng trưởng thực vật đáng quantâm là các chủng PGPR có khả năng sản xuất và điều chỉnh sự tổng hợp chất điều hòasinh trưởng hay phytohormone trong cá thể thực vật (Glick năm 1995) Đặc biệt cácchủng có khả năng sản sinh chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin Indole-3-acetic

acid (IAA) như Rhizobium, Microbacterium, Sphingomonas, Mycobacterium, Bacillus, Pseudomonas và Azotobacter (Choi và cs, 2008) được đánh giá là có ý nghĩa to lớn đối

với nền sản xuất nông nghiệp khi các báo cáo ở các tài liệu trên thế giới đã chỉ ra rằngPGPR có thể kiểm soát các tác nhân từ nguồn bệnh và sâu bệnh, kích thích tăng trưởng

thực vật, tăng năng suất cây trồng và cải thiện chất lượng các sản phẩm nông nghiệp,chúng có thể có những tác động diễn ra đồng thời ở thực vật hay theo một tuần tự(Lugtenberg và cs, 2013)

Từ những cơ sở thực tiễn nói trên chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu: “Đánh giá tác động của một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA đến sự nảy mầm, và sinh trưởng của cây con nảy mầm từ hạt trên cây lúa” Hướng nghiên cứu tập trung

chủ yếu phân lập, đánh giá, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAAcao và tác động tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây con nảy mầm từ các loạihạt giống khác nhau

- Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA từ rễ cây lúa

- Đánh giá được các đặc điểm sinh học và các điều kiện tối ưu tổng hợp IAA củacác chủng vi khuẩn phân lập được

- Đánh giá được khả năng tương tác của các chủng vi khuẩn phân lập được đến sự

nảy mầm của hạt lúa trong điều kiện invitro

- Đánh giá được khả năng tương tác của các chủng vi khuẩn phân lập được đến sự

sinh trưởng của cây con nảy mầm từ hạt lúa trong điều kiện invitro.

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (PGPR)

1.1 Khái niệm

Sự phát triển của thực vật trên nền đất nông nghiệp chịu ảnh hưởng của nhiều yếu

tố vô sinh và hữu sinh Khái niệm vùng rễ lần đầu tiên được giới thiệu bởi Hiltner để mô

tả các vùng hẹp của đất xung quanh rễ, nơi dân số vi khuẩn được kích thích phát triển bởi

sự hoạt động của rễ (Hiltner, 1904) Theo McCully (2005), vùng rễ bao gồm đất xungquanh rễ cũng như các nhân tố vật lý, hóa học, sinh học ở trong đấy đã được thay đổi bởihoạt động của rễ Ngoài một số lượng lớn các vi khuẩn còn có các vi sinh vật khác nhưnấm, động vật nguyên sinh và tảo cùng tồn tại trong vùng rễ Để hỗ trợ cho các hoạt độngcủa những vi khuẩn có lợi cho vùng rễ của mình, thực vật sẽ giải phóng các hợp chất hữu

cơ thông qua dịch tiết (Lynch, 1990) tạo ra một môi trường sống rất chọn lọc (García và

cs, 2001)

Tầm quan trọng của vi khuẩn vùng rễ từ lâu đã được công nhận, tuy nhiên, vikhuẩn vùng rễ chỉ là một phần nhỏ trong tổng số đa dạng sinh học đất Có một nhóm vikhuẩn đất trong các thập niên gần đây đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu

là nhóm vi khuẩn được gọi là vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPR) Vikhuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật là vi khuẩn cư ngụ ở rễ cây, chúng có khảnăng thúc đẩy tăng trưởng thực vật, làm giảm bệnh hoặc các thiệt hại do côn trùng PGPR

đã và đang được quan tâm nghiên cứu rất nhiều và nhiều sinh phẩm của nó đã đượcthương mại hóa phục vụ cho sản xuất nông nghiệp (Antoun và Kloepper, 2001) Ví dụ,

chi Rhizobium là nhóm vi khuẩn vùng rễ được biết đến rộng rãi nhất và nó đã được

thương mại hóa thành công với nhiều ứng dụng thực tế trong nông nghiệp theo nguyên lýphát triển cộng sinh với thực vật (Saharan và cs, 2011)

Vào đầu những thế kỉ này, mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn liên kết hay cộng sinhvới thực vật từ đó kiểm soát sự sinh trưởng của thực vật nhưng chúng lại chưa đượcnghiên cứu rộng rãi cho đến khi các công bố mang tính đột phá về sự tương tác của vi

khuẩn đến thực vật từ những nghiên cứu của Bashan và Holguin (1998), sự phát hiện vi

khuẩn Pseudomonads có khả năng kiểm soát các mầm bệnh và gián tiếp điều khiển sự phát triển thực vật của Kloepper và cs(1980), hay việc tìm thấy Azosprillum sp., a diazotrophic, loài vi khuẩn sống tự do tăng nhanh xung quanh vùng rễ của cây trồng

nhiệt đới (Maria và cs, 2002)

Các nhà nghiên cứu hiện nay đã ứng dụng đặc tính có lợi của các chủng vi khuẩnvùng rễ và mang lại thành công trong các thí nghiệm như nâng cao chất lượng và sảnlượng của khoai tây, củ cải đường, củ cải và khoai lang (Barriuso và cs, 2008) Ứng dụngthương mại của PGPR đang được thử nghiệm và đã có rất nhiều thành công Tuy nhiên,

sự hiểu biết tường tận hơn về khả năng tương tác của vi sinh vật dẫn đến tăng trưởng củathực vật sẽ làm tăng tỷ lệ thành công của các ứng dụng trên nhiều lĩnh vực phục vụ chomục đích phát triển nông nghiệp bền vững (Kloepper và cs, 1980)

PGPR có ảnh hưởng đến tăng trưởng nhiều loại thực vật khác nhau bằng các cơchế trực tiếp hoặc gián tiếp và chúng chịu ảnh hưởng của một số thay đổi hóa học trongđất Vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPB) cũng đã được báo cáo gây ảnhhưởng đến sự tăng trưởng, năng suất và hấp thu dinh dưỡng bởi một loạt các cơ chế Một

số chủng vi khuẩn trực tiếp điều tiết sinh lý học thực vật bằng cách bắt chước tổng hợpcác hormone thực vật, trong khi những chủng khác tăng khoáng chất và nitơ sẵn có trongđất như là một cách để làm tăng thêm tốc độ tăng trưởng Các chủng có thể biểu hiệnnhiều hơn hai hoặc ba đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGP), có thể thúc đẩytăng trưởng thực vật trực tiếp hoặc gián tiếp hoặc kết hợp (Okon và Labandera-Gonzalez,1994) Sự tăng trưởng thực vật cũng như hiệu quả sự tương tác của vi khuẩn bị ảnhhưởng bởi tình trạng dinh dưỡng của đất Việc cấy vi khuẩn có tác dụng kích thích thìthực vật tăng trưởng tốt trong đất thiếu dinh dưỡng hơn trong đất giàu chất dinh dưỡng(Glick, 1995) Việc kiểm tra đồng thời vi khuẩn vùng rễ tổng hợp auxin cho thúc đẩy

tăng trưởng trong điều kiện môi trường tự nhiên và trong điều kiện in vitro là một phương

pháp hữu ích để lựa chọn hiệu quả các chủng PGPR có khả năng tổng hợp auxin chínhxác nhất (Asghar và cs, 2004) Ví dụ như, một số PGPR giải phóng một hỗn hợp các

thành phần bay hơi như 2, 3 - butanediol và acetoin thúc đẩy sự tăng trưởng của cây

Arabidopsis thaliana (Ryu và cs, 2003) Thí nghiệm của Anjum và cộng sự (2007) cho thấy, việc cấy vi khuẩn diazotroph làm tăng đáng kể năng suất bông hạt, chiều cao cây và

cộng đồng vi khuẩn trong đất (Anjum và cs, 2007) Một thí nghiệm khác trên cây đậuchickpea đã chỉ ra rằng việc lây nhiễm các PGPR có khả năng làm giàu phốt pho mộtcách thống nhất đã cải thiện tăng trưởng, năng suất và nốt sần (Shahzad và cs, 2008)

PGPR có thể điều chỉnh rễ phát triển và tăng trưởng thông qua việc sản xuấtphytohormones, chất chuyển hóa trung gian và các enzym Những tác động phổ biến nhấtquan sát được là giảm tốc độ tăng trưởng của rễ chính, và tăng số lượng và chiều dài của

rễ và lông rễ PGPR cũng ảnh hưởng đến dinh dưỡng cây trồng thông qua cố định đạm,hòa tan photpho, hoặc sản xuất siderophore, và sửa đổi chức năng sinh lý rễ bằng cáchthay đổi gen phiên mã và chất chuyển hóa được sinh tổng hợp trong tế bào thực vật.(Vacheron, 2013)

Hình 1: Tác động của PGPR trên rễ thực vật (Vacheron, 2013)

1.2 Phân loại và ứng dụng

Những loài vi khuẩn đất mà phát triển mạnh trong vùng rễ của cây đồng thời cũng

có thể phát triển trong, trên hoặc xung quanh các mô thực vật, kích thích tăng trưởng thựcvật bởi rất nhiều cơ chế thì các vi khuẩn được gọi chung là PGPR (vi khuẩn vùng rễ thúcđẩy tăng trưởng thực vật) (Akhtar và cs, 2012).Thường thì PGPR được phân loại thànhhai nhóm chính là PGPR kiểm soát sinh học (Biocontrol PGPR) và vi khuẩn tăng trưởngthực vật “ plant growth promoting bacterial (PGPB)” (Bashan and Holguin, 1998) Chúngcũng thể hiện cho những ứng dụng nổi bật của các đặc tính có lợi của chính những chủng

vi khuẩn này

1.2.1 PGPR kiểm soát sinh học

Ứng dụng của nguyên liệu hoá học cho sản xuất phân bón cũng như thuốc trừ sâulàm cải thiện năng suất cho một nền nông nghiệp truyền thống Tuy nhiên, hiện nay cácnhà khoa học đang muốn hướng đến một giải pháp thay thế cho hệ thống này Sử dụngcác vi khuẩn như các tác nhân kiểm soát sinh học cho bệnh thực vật có nguồn gốc từ đất

đã được nghiên cứu trong nhiều thập kỉ vừa qua (Landa và cs, 2004) Từ việc nghiên cứungăn chặn các bệnh ở rễ bên trong đất đã rút ra được kinh nghiệm đáng chú ý là sử dụngphương pháp luân canh để duy trì năng suất cho hệ sinh thái nông nghiệp (Hu và cs,1997) Vi khuẩn vùng rễ thuộc nhóm kiểm soát sinh học PGPB thì có khả năng ngăn chặncác bệnh thực vật bằng cách sản sinh hàng loạt các chất ức chế hay gia tăng sức đề khángbẩm sinh của thực vật (Jetiyanum and Klopper, 2002; Gardner và cs, 2001; Bashan,2002) Những chủng PGPB kiểm soát sinh học có thể tăng nhanh sinh khối ở vùng rễ vàcạnh tranh cùng với những chủng vi sinh vật có hại như những vi sinh vật gây bệnh trên

bề mặt rễ của cây (Rangarajan và cs, 2003) Một số các phương thức hoạt động sử dụngcác vi khuẩn có khả năng kiểm soát sinh học vùng rễ được thảo luận ở các mục dưới đây

1.2.1.1 Khả năng kháng nấm của PGPR

PGPR ngăn chặn sự gia tăng của các bệnh từ nấm và do đó hỗ trợ tăng trưởng thực

vật Một số PGPR tổng hợp kháng sinh chống nấm, ví dụ P fluorescens sản xuất

phloroglucinol 2,4 - diacetyl ức chế sự tăng trưởng của nấm đạo ôn (Nowak-Thompson

và cs, 1994) Một số PGPR làm suy giảm khả năng sản sinh axit fusaric do nấm

Fusarium sp do đó ngăn chặn được bệnh héo xanh trên một số loài thực vật (Toyoda và

Utsumi, 1991) Một số PGPR cũng có thể sản xuất các enzyme làm tan tế bào nấm Ví

dụ: Pseudomonas stutzeri sản xuất chitinase ngoại bào và laminarinasecó khả năng làm tan các sợi nấm Fusarium solani (Mauch và cs, 1988) Trong những năm gần đây, fluorescent Pseudomonas đã được đề xuất như nhân tố tiềm năng kiểm soát sinh học do

khả năng xâm chiếm vùng rễ và bảo vệ thực vật chống lại một loạt các bệnh nấm nguyhiểm như đen mục rễ của thuốc lá (Voisard và cs, 1989), rễ thối hạt đậu (Papavizas và

cs, 1974), mục rễ của lúa mì (Garagulia và cs, 1974), sự thối úng của củ cải đường(Kumar và cs, 2002) Và như triển vọng của kĩ thuật di truyền sinh vật thì chúng đượcphân lập và tuyển chọn từ đó thương mại hóa thành các sản phẩm kiểm soát bệnh sinhhọc để nâng cao chất lượng sản phẩm (Dowling và O'Gara, 1994)

1.2.1.2 PGPR hoạt động dưới điều kiện bất lợi của môi trường

Cây trồng nông nghiệp sinh trưởng trong nhiều điều kiện bất lợi gây ra bởi cả haiyếu tố sinh học và phi sinh học Những bất lợi này đã làm giảm sản lượng các loại câytrồng và là rào cản đối với sự phát triển của cây trồng ở các khu vực không phù hợp chotrồng trọt Các thiệt hại năng suất gắn liền với điều kiện bất lợi phi sinh học có thể đạt50% đến 82%, tùy thuộc vào mùa vụ (Saharan và cs, 2011) Trong nhiều khu vực bánkhô cằn và khô cằn trên thế giới, sản lượng cây trồng bị hạn chế do độ mặn của nướctrong hệ thống thủy lợi cũng như độ mặn đất quá cao Khi độ mặn cao, thực vật giảm tốc

độ tăng trưởng lá do giảm sự hấp thu nước, trong đó hạn chế khả năng quang hợp Câytrồng đã phải thay đổi sự trao đổi chất và sinh lý trong phản ứng với nồng độ muối bất lợi

và thiếu nước (hạn hán) (Hu, 2005) Sự tương tác các chủng PGPR đã làm giảm bớtnồng độ muối cao trong thực vật (Saharan và cs, 2013) Ví dụ như ở cây đậu tương thì đấtmặn là một trong những yếu tố nghiêm trọng nhất hạn chế sự phát triển của nốt sần, năngsuất và phản ứng sinh lý (Saharan và cs, 2011) Sự gia tăng độ mặn trong đất đã gây ranhững rối loạn sinh lý ở rau diếp (Han và Lee, 2005) Mục tiêu lâu dài của sự tương tácgiữa thực vật và các chủng vi sinh vật là tác động đến độ mặn của đất, từ đó cải thiện

năng suất cây trồng ở những vùng địa lý này Ví dụ cụ thể được nêu ra là sự hiểu biết về

cơ chế thích nghi thẩm thấu (osmoadaptation) trong Azospirillum sp Tổng hợp và hoạt động của nitrogenases trong A brasilense bị ức chế bởi điều kiện mặn bất lợi (Tripathi và

cs, 2002) Tripathi và cộng sự (2002) theo các tác giả này báo cáo rằng trong

Azospirillum sp có một sự tích lũy các chất hòa tan tương thích như glutamate, proline,

glycine betaine và trehalose để phản ứng lại với độ mặn thông qua cơ chế thẩm thấu,proline đóng vai trò quan trọng trong thẩm thấu thông qua tăng sinh trong điều kiện bấtlợi từ đó thay đổi các osmolyte được chi phối từ glutamate để proline di chuyển vào

trong A brasilense Azospirillum cộng sinh trên cây lúa miến đã giúp tiềm năng tích trữ

về nước cao hơn và làm giảm nhiệt trong cây khi thời tiết quá nắng nóng Do đó, chúng ít

bị hạn hán hơn những cây không có sự cộng sinh của loài vi khuẩn này Saleena và cộng

sự (2002) đã nghiên cứu sự đa dạng của Azospirillum sp bản địa cộng sinh với lúa và

canh tác dọc theo bờ biển của bang Tamil Nadu

Các PGPR chứa deaminase ACC có mặt trong nhiều loại đất khác nhau, chúnghứa hẹn thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật nhờ sự tương tác cùng vi khuẩn, đặc biệt làtrong điều kiện không thuận lợi về môi trường như lũ lụt, kim loại nặng, phytopathogens,hạn hán và muối cao Ethylene là một phytohormone quan trọng, hơn nữa nếu được sảnxuất trong điều kiện bất lợi có thể dẫn đến sự ức chế tăng trưởng thực vật hoặc gây chết,đặc biệt là cho cây giống PGPR chứa deaminase ACC có thể thủy phân ACC, các tiềnthân trực tiếp của ethylene, F-ketobutarate và ammonia, bằng cách đó chúng thúc đẩytăng trưởng của thực vật Cộng sinh các loại cây trồng với PGPR chứa ACC deaminase

có thể hỗ trợ tăng trưởng cho thực vật bằng cách giảm tác hại của ethylene trong điềukiện độ mặn bất lợi (Belimov và cs, 2001)

1.2.1.3 PGPR sản sinh HCN

Một nhóm vi sinh vật hoạt động như các tác nhân kiểm soát sinh học của các loài

cỏ dại bao gồm các vi khuẩn hại vùng rễ (DRB – deleterious rhizobacteria) mà có thể cưtrú trên bề mặt rễ cây và có thể ngăn chặn tăng trưởng thực vật (Suslow và Schroth,

1982) Nhiều DRB đặc hiệu trên những loài cây trồng cụ thể (Schippers và cs, 1987).Cyanide là chất hóa học nguy hiểm bởi chúng có tính độc hại Xyanua hoạt động như mộtchất ức chế chuyển hóa chung, nó được tổng hợp, bài tiết và chuyển hóa bởi hàng trămsinh vật, bao gồm vi khuẩn, tảo, nấm, thực vật và côn trùng, nó được sử dụng như mộtchất tự bảo vệ để tránh ăn thịt hoặc cạnh tranh cùng loài Các loài thực vật nói chung làkhông bị ảnh hưởng tiêu cực bởi cộng sinh với chủng vi khuẩn sản sinh cyanide và những

vi khuẩn vùng rễ đặc hiệu ở từng loại thực vật có thể làm tác nhân sinh học kiểm soát cỏdại (Zeller và cs, 2007) Một chất chuyển hóa trung gian được sản xuất thường bởi

Pseudomonads vùng rễ là Hydrogen cyanide (HCN), một loại khí gây ảnh hưởng tiêu cực

đến sự trao đổi chất và tăng trưởng của rễ (Schippers và cs, 1990), một cơ chế tiềm năng

và tương thích với môi trường để kiểm soát sinh học của cỏ dại (Heydari và cs, 2008)

Các HCN đã được tìm thấy ở cả Pseudomonas (88,89 %) và Bacillus (50 %) trong đất

vùng rễ và nốt rễ cây (Ahmad và cs, 2008) HCN là một chất gây ô nhiễm môi trường

nghiêm trọng và là chất chuyển hóa kiểm soát sinh học trong loài Pseudomonas HCN chỉ

được biết đến khi Castric (1977) lấy bằng chứng rằng glycine là một tiền thân của HCN

cho P Aeruginosa Các cây lúa miến có các kiểu gen khác nhau thì có các liên kết khác nhau với vi sinh vật đất và kiểu ảnh hưởng khác nhau đến số FLPs (Fluorescent pseudomonads) trong hệ thống canh tác (Funnell-Harris và cs, 2008) Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một số các Pseudomonas spp chuyển hóa chất HCN có thể nâng

cao khả năng phát triển của cây Wani và cs (2007) đã thử nghiệm rễ phân lập cho khảnăng sản xuất HCN trong ống nghiệm cho thấy rằng hầu hết các chủng sản xuất HCN hỗtrợ cho sự phát triển của thực vật Các chủng từ đất vùng rễ của đậu xanh cũng thể hiệnnhiều hơn hai hoặc ba đặc điểm của PGPR bao gồm cả sản xuất HCN cũng thúc đẩy tăngtrưởng thực vật trực tiếp hoặc gián tiếp hoặc cộng sinh Vùng rễ có lượng lớn tập trungcủa Mesorhizobiumloti MP6 đã sản xuất cyan hytric axit (HCN) trong điều kiện phát

triển bình thường và tăng cường sự phát triển của mù tạt Ấn Độ (Brassica campestris) (Chandra và cs, 2007) Phân lập các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Pseudomonas

từ đất vùng rễ mù tạt có khả năng sản xuất HCN và không có bất kỳ thay đổi đáng kể nào

trong khả năng sản xuất HCN khi ứng dụng chúng cho sản xuất thuốc diệt cỏ p-ethyl & clodinafop).

(quizalafop-1.2.1.4 PGPR tổng hợp khoáng chất

Sắt là một yếu tố tăng trưởng quan trọng cho tất cả các sinh vật sống Sự khanhiếm sắt sinh học trong môi trường sống của đất và trên bề mặt cây tạo nên một cuộccạnh tranh dữ dội (Loper và Henkels, 1997) Khi sắt dưới giới hạn thì tạo điều kiện choPGPB sản xuất các hợp chất phân tử trọng lượng thấp gọi là siderophores để cạnh tranhđược ion sắt (Whipps, 2001) Siderophores (tiếng Hy Lạp : "phần tử mang sắt" ) là kháthấp, có ái lực cao với sắt, các hợp chất tạo phức được tiết ra bởi vi sinh vật như vi khuẩn,nấm và cỏ (Miller và Marvin, 2008) Vi sinh vật giải phóng siderophores lọc sạch sắt từcác giai đoạn khoáng sản hình thành phức hợp Fe3+ có thể hoà tan được rồi vận chuyểnlên bởi cơ chế dẫn truyền Siderophores nằm trong số những chất kết dính Fe3+ mạnhnhất được biết đến, enterobactin là một trong những nhóm mạnh nhất trong số này(Raymond và cs, 2003) Phân phối các chủng có khả năng sản xuất siderophores theophân tích nhóm giới hạn khuếch đại DNA ribosome (ARDRA - Amplified ribosomalDNA restriction analysis) cho kết quả rằng hầu hết các phân lập thuộc về vi khuẩn Gram

âm tương ứng với chi Pseudomonas và Enterobacter, chi Bacillus và Rhodococcus là vi

khuẩn Gram dương đều có khả năng sản xuất siderophores (Tian và cs, 2009)

1.2.2 PGPR kiểm soát tăng trưởng thực vật

1.2.2.1 PGPR cố định đạm

Một số loài vi khuẩn thuộc chi Azospirillum, Alcaligenes, Arthrobacter, Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia liên quan đến rễ cây và có thể gây ra tác dụng có lợi

đối với sự tăng trưởng của thực vật (Egamberdiyeva, 2005) Thành phần dịch tiết ở rễ củatừng loài thực vật đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn và làm phong phú thêm cácloại vi khuẩn Vì vậy, cộng đồng vi khuẩn trong vùng rễ phát triển tuỳ theo tính chất vànồng độ các hợp chất hữu cơ của dịch tiết cũng như khả năng tương ứng của vi khuẩn để

sử dụng như các nguồn năng lượng đó (Curl và Truelove, 1986) Theo Hallmann và cộng

sự (1997) liên tục thấy sự tồn tại của vi khuẩn trong đất vùng rễ, bề mặt rễ và nội bào củacác mô thực vật Sự tương tác kết hợp của thực vật và vi sinh vật như một kết quả củađồng tiến hóa, việc sử dụng các nhóm vi khuẩn sau để sản xuất những chế phẩm sinh họcphải được điều chỉnh trước, để nó phù hợp với một hệ thống nông nghiệp bền vững lâudài PGPR thường được sử dụng như những chế phẩm sinh học để cải thiện tốc độ tăngtrưởng và năng suất của cây trồng nông nghiệp, chúng như một biện pháp khả thi để thaythế phân hóa học, thuốc trừ sâu, và các chất kích thích (Ashrafuzzaman và cs, 2009).Việc sử dụng phân bón sinh học và chất tăng trưởng sinh học từ vi khuẩn cố định cũngnhư lợi ích vi sinh vật mang lại có thể làm giảm lượng sử dụng phân bón hóa học do đóchi phí sản xuất thấp hơn Không chỉ có vậy, việc sử dụng PGPR để tăng năng suất thaythế phân bón hóa học còn giúp giảm thiểu ô nhiễm và bảo vệ môi trường, hướng đến mộtnền nông nghiệp sinh thái (Ştefan và cs, 2008) Do đó vi khuẩn vùng rễ là một tác nhântiềm năng cho sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật trong nông nghiệp (Chaiharn và cs,2008), được sử dụng như những chế phẩm sinh học để cải thiện tốc độ tăng trưởng vànăng suất của cây trồng nông nghiệp PGPR hoặc sự kết hợp của PGPR và AMF

(Arbuscular mycorrhiza fungi – nấm vùng rễ Arbuscular) có thể nâng cao hiệu quả sử

dụng chất dinh dưỡng của phân bón và cho phép áp dụng tỉ lệ giảm phân bón hóa học(Adesemoye và cs, 2009) Việc sử dụng PGPR phân lập được như những chế phẩm phânbón sinh học có lợi cho canh tác lúa giúp tăng cường sự phát triển của lúa bằng cách thúcđẩy tăng trưởng những chỉ tiêu sinh lý khác Ứng dụng sự tương tác kết hợp của PGPRnhư phân sinh học ảnh hưởng đến năng suất và có lợi cho tăng trưởng của đậu chickpeatrong điều kiện thực nghiệm (Rokhzadi và cs, 2008) Cố định đạm sinh học đóng góp 180

X 106 tấn/năm trên toàn cầu, mà trong đó các tập đoàn vi sinh vật cộng sinh sản xuất80% và phần còn lại đến từ các hệ thống sống tự do hoặc kết hợp (Graham và cs, 1988).Theo Young (1992), vi khuẩn và tảo có khả năng cố định một lượng đáng kể nitơ trongkhông khí để làm giàu cho đất Cố định đạm bao gồm cố định đạm cộng sinh (N2-cốđịnh) và không cộng sinh Trong cố định đạm cộng sinh, vi khuẩn và các vi sinh vật khác

sẽ cộng sinh bắt buộc trong cây họ đậu và Frankia trong cây không phải họ đậu Trong

cố định đạm không cộng sinh (sống tự do, kết hợp hoặc endophytic) nhưng vi khuẩn vẫn

có khả năng cố định N2 như: vi khuẩn lam, Azospirillum, Azotobacter, Acetobacter

diazotrophicus, Azoarcus,

1.2.2.2 Khả năng phân giải Phosphate của PGPR

Cải thiện độ phì của đất là một trong những chiến lược phổ biến nhất để tăng sảnxuất nông nghiệp Khả năng cố định đạm sinh học là rất quan trọng trong việc nâng cao

độ phì của đất Ngoài việc cố định đạm sinh học, phosphate hòa tan cũng không kémphần quan trọng Phốt pho (P) là chất dinh dưỡng thiết yếu quan trọng cho sự tăng trưởng

và phát triển sinh học Vi sinh vật cung cấp một hệ thống sinh học có khả năng hoà tan P

vô cơ trong đất để sẵn có cung cấp cho thực vật Một số vi sinh vật có khả năng chuyểnđổi phốt pho hòa tan (P) thành một dạng dễ hấp thu, như orthophosphate, đây một đặcđiểm quan trọng của một nhóm PGPB giúp tăng sản lượng cây trồng (Rodriguez và cs,2006) Vi khuẩn vùng rễ sử dụng phosphate có thể là một tác nhân đầy hứa hẹn cho sựthúc đẩy tăng trưởng thực vật trong nông nghiệp Theo Chen và cộng sự (2006) có thể sửdụng các vi khuẩn hòa tan phosphate như những chế phẩm làm tăng sự hấp thu của P củacây trồng Trong cộng đồng rất đa dạng các vi sinh vật sinh sống trên rễ, vi khuẩn và các

vi sinh vật hòa tan phosphate PSM (Phosphate Solution Microoganism – Vi sinh vật phângiải phốt pho) đã cung cấp một giải pháp công nghệ sinh học mới thay thế những cái cũgiúp đáp ứng nhu cầu P của thực vật, hướng tới nền sản xuất nông nghiệp bền vững.Những sinh vật này không những cung cấp P cho thực vật mà còn tạo điều kiện chochúng phát triển bởi các cơ chế khác PSM bao gồm chủ yếu là vi khuẩn và nấm PSM

hiệu quả nhất thuộc về chi Bacillus, Rhizobium và Pseudomonas, trong nấm Aspergillus

và Penicillium Trong vi khuẩn vùng rễ, hai loài nốt sần đậu xanh là Mesorhizobium ciceri và Mesorhizobium Mediterraneum được gọi là những đối tượng hoà tan phosphate

tốt (Rivas và cs, 2006)

1.2.2.3 PGPR tổng hợp phytohormone

Hormon thực vật là những tác nhân hóa học có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứngvới môi trường của mỗi loại cây Các nội tiết tố hay hormone nội sinh là các hợp chất hữu

cơ có hiệu quả rất tốt ở nồng độ rất thấp, chúng thường được tổng hợp trong một phầncủa thực vật và vận chuyển đến các vị trí khác Chúng tương tác với mô đích cụ thể gây

ra phản ứng sinh lý, chẳng hạn như sự tăng trưởng hay chín trái cây, Mỗi hiện tượngsinh lý đấy thường là kết quả của hai hoặc nhiều hormone tác động cùng nhau Vìhormon có tác dụng kích thích hoặc ức chế tăng trưởng thực vật nên nhiều nhà thực vậthọc cho rằng chúng như các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Các nhà thực vật họcphân loại hormon thực vật thành năm nhóm chính là: auxin, giberelin, ethylene,cytokinin, và axit abscisic (Lugtenberg và cs, 2013)

Thực vật sản xuất phytohormones hay các chất điều hòa sinh trưởng, ví dụ như cáchợp chất ở nồng độ thấp hơn 1 mM có thể điều chỉnh tốc độ tăng trưởng và phát triển củacây Có bảy loại hormon thực vật, cụ thể là gồm 5 nhóm chính auxin, cytokinin,giberelin, axit abscisic, ethylene và 2 nhóm mới phát hiện gần đây là strigolactones vàbrassinosteroid Phytohormones điều hòa các quá trình như phân chia tế bào, tăng kíchthước kéo dãn tế bào, sự phân hóa, nảy chồi và làm già hóa các tế bào Con đường tổnghợp phytohormone và sự tương tác của chúng đóng một vai trò quan trọng trong quá trìnhphối hợp và phản ứng của tế bào (Moller và cs, 1999; Santner và cs, 2009) Nhiều vikhuẩn vùng rễ có thể sản xuất các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong ống nghiệm,chẳng hạn như auxin, cytokinin, giberelin, axit abscisic, và ethylene (Zahir và cs, 2003)

Vi khuẩn sản xuất ra axit abscisic và ethylene được biết đến như các tác nhân kiểm soáttrong điều kiện bất lợi Hiện nay, chưa biết tới loài vi khuẩn hay nấm nào có thể sản xuấtđược brassinosteroid và strigolactones

Sản xuất phytohormone bởi các vi khuẩn có thể điều chỉnh mức độ hoóc môn thựcvật nội sinh và do đó có thể có một ảnh hưởng to lớn đối với tăng trưởng và phát triển củathực vật (Gray, 2004; Van Loon, 2007)

 PGPR tổng hợp Cytokinin

Nhiều loại vi khuẩn vùng rễ có thể sản xuất cytokinin trong môi trường nhân tạo,

ví dụ như Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Erwinia, Pantoea agglomerans, Pseudomonas, Rhodospirillum rubrum, Serratia và Xanthomonas (García

và cs, 2001) Quang phổ của cytokinin sản xuất bởi vi khuẩn vùng rễ tương tự như sảnxuất ở thực vật (Barea và cs năm 1976; García và cs, 2001; Frankenberger và Arshad,1995) trong đó isopentenyladenine, trans - zeatin, cis- zeatin và ribosides của chúng làphổ biến nhất được tìm thấy

 PGPR tổng hợp Gibberellins (GAs)

Các chủng vi khuẩn sản xuất giberelin được biết đến như Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum brasilense, A lipoferum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium japonicum, Clostridium, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Rhizobium và Xanthomonas, tiết ra nó trong vùng rễ (Frankenberger và

Arshad, 1995; Gutiérrez Manero và cs, 2001; Rademacher, 1994; Tsavkelova và cs,2006) Hầu hết khả năng tổng hợp gibberellin trong vi khuẩn vùng rễ đều đang trong quátrình nghiên cứu và tìm hiểu

Kang và cs (2009) cho thấy hệ thống nuôi cấy huyền phù của GAs được sản xuất

bởi calcoaceticus Acinetobacter đã có thể tăng sự phát triển của dưa chuột, bắp cải Trung

Quốc và hoa cúc mão Cơ chế kích thích tăng trưởng thực vật của vi khuẩn tổng hợpgiberelin vẫn còn chưa sáng tỏ Người ta cho rằng vi khuẩn có thể làm tăng mức độ GAtrong các khu vực trồng bằng một trong hai cách là tổng hợp GA hay phân giải GA từdịch tiết rễ hoặc là hydroxylating bất hoạt GA với nhiều hình thức hoạt động (Bottini và

cs, 2004) Fulchieri và cộng sự (1993) cho rằng giberelin tăng mật độ lông hút ở vùng rễliên quan đến dinh dưỡng và hấp thu nước

 PGPR tổng hợp Abcisic Acid (ABA)

ABA có thể được sản xuất trong môi trường nuôi cấy của một số vi khuẩn như

Azospirillum brasilense (Cohen và cs, 2008; Perrig và cs, 2007; Boiero và cs, 2007) và

Bradyrhizobium japonicum Nồng độ ABA trong các khu vực đất trồng Arabidopsis thaliana đã được tăng lên bởi Azospirillum brasilense SP25 (Cohen và cs, 2008).

Hiệu quả của lây nhiễm vi khuẩn sản xuất ABA trên tăng trưởng thực vật được thửnghiệm bởi Miernyk (1979) để củng cố thêm Kết quả nghiên cứu cho thấy ABA ức chế

sự tổng hợp của cytokinin từ đó đã suy đoán rằng sự tăng trưởng ABA dẫn đến sự tăngtrưởng của thực vật bằng cách can thiệp với cytokinin (Spaepen và cs, 2009) Bên cạnh

đó ABA do vi khuẩn tiết ra cũng có thể làm giảm bớt stress thực vật bằng cách tăng tỷ lệrễ/chồi (Boiero và cs, 2007)

 PGPR tổng hợp Auxin

IAA (axit indole-3-acetic acid) thuộc nhóm phytohormones và thường được coi lànguồn gốc quan trọng nhất trong nhóm auxin Nó hoạt động như một phân tử tín hiệuquan trọng trong việc điều tiết sự phát triển thực vật bao gồm cả sinh cơ quan, đáp ứngvới môi trường, phản ứng của tế bào chẳng hạn như tăng kích thước tế bào, phân chia,phân biệt và điều hòa gen (Ryu và Patten, 2008) Có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năngtạo ra IAA - hoóc môn thực vật nhóm auxin Con đường sinh tổng hợp tạo ra IAA đãđược xác định, lượng IAA dư thừa từ sinh tổng hợp đã tạo nên sự tương tác giữa thực vật

và vi khuẩn Tương tác giữa vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA và thực vật dẫn đến sựthay đổi về bệnh lý trong miễn dịch thực vật Xem xét vai trò của vi khuẩn có khả năngsinh IAA trong tương tác của chúng với thực vật cho thấy vi khuẩn sử dụng hoóc - mônthực vật này để tương tác với thực vật như một phần chiến lược để xâm nhập vào bêntrong tế bào thực vật của chúng như là sự khắc phục của cơ chế miễn dịch thực vật cơbản Hơn nữa, vài báo cáo gần đây cho thấy IAA cũng có thể là phân tử báo hiệu trong vikhuẩn và do đó có thể có ảnh hưởng trực tiếp đối với sinh lý học vi khuẩn (Spaepen và

cs, 2007) Có nhiều hệ vi thực vật đất có khả năng tổng hợp auxin hoàn toàn cả khi ởtrong đất hay trong nuôi cấy Tiềm năng tổng hợp auxin bởi vi khuẩn vùng rễ có thể được

sử dụng như một công cụ sàng lọc có hiệu quả chủng PGPR (Khalid và cs, 2004)

2 Quá trình xâm nhập của các vi khuẩn vào rễ thực vật

PGPR có liên kết đến rễ cây, bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp kích thích tăngtrưởng thực vật Người ta phân loại quần thể vi khuẩn vùng rễ như sau:

(i ) vi khuẩn sống trong đất gần rễ, sử dụng các chất chuyển hóa bị rò rỉ từ rễ nhưnguồn C và N

(ii ) vi khuẩn thuộc địa hóa rhizoplane (bề mặt rễ),

(iii ) vi khuẩn cư trú trong mô rễ, nằm ở khoảng trống giữa tế bào biểu bì mô rễ(iv ) vi khuẩn sống bên trong các tế bào, trong cấu trúc chuyên hóa hoặc nốt vàthường rơi vào hai nhóm là các cây họ đậu có liên quan rhizobia và cây thân gỗ liên quan

đến loài Frankia

Đây là sự sắp xếp theo thứ tự cộng sinh ít hay nhiều với các loài thực vật có liênquan, từ gần như bình thường đến quy định và nằm trong cấu trúc đặc biệt của mô rễ.Trong phân loại này, các cơ chế khác nhau của sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật đã đượcthành lập, được biết đến nhiều nhất là sự cộng sinh của rhizobia - cây họ đậu

Vùng rễ có thể được định nghĩa là bất kỳ khối lượng đất mà chịu ảnh hưởng của rễcây hoặc kết hợp có rễ và lông và các nguyên liệu cho thực vật sử dụng cho sự phát triển(Andrade và cs, 1997; Mahaffee và Kloepper, 1997; Bringhurst và cs, 2001) Không giannày bao gồm lượng đất bị ràng buộc bởi rễ cây, thường mở rộng một vài milimet tính từmặt gốc (Bringhurst và cs, 2001) và có thể bao gồm lớp biểu bì của rễ thực vật( Mahaffee và Kloepper, 1997) Dịch tiết của thực vật trong rễ, chẳng hạn như axit amin

và đường, cung cấp nguồn năng lượng và chất dinh dưỡng phong phú cho vi khuẩn dẫnđến quần thể vi khuẩn lớn hơn trong khu vực này so với bên ngoài vùng rễ Sinh vật vùng

rễ nhiều nhất xuất hiện trong vòng 50 mm của bề mặt rễ và các quần thể trong vòng 10

mm tính từ đó có thể đạt 1,2 ×108 tế bào/cm3 hoặc 109-1012 tế bào vi khuẩn/g đất Mặc dù

có số lượng lớn các vi khuẩn trong vùng rễ nhưng chỉ có 7-15 % tổng số bề mặt gốc làthường bị chiếm đóng bởi các tế bào vi sinh vật (Foster và cs, 1983, Pinton và cs 2001)

Vi khuẩn vùng rễ cư trú bên trong rễ cây, tạo thành các tập đoàn vi khuẩn lớn hơn là

endophytes Chúng bao gồm một loạt các vi khuẩn trong đất tập hợp lại và không hẳn làđặc hiệu như sự cộng sinh rhizobia - cây họ đậu Endophytes có thể kích thích tăngtrưởng thực vật trực tiếp hoặc gián tiếp (Kobayashi và cs, 1995) và bao gồm các rhizobia.Định nghĩa sau đây cho endophytic vi khuẩn đã được đề xuất : " những vi khuẩn có thểđược phân lập từ bề mặt khử trùng mô thực vật hoặc chiết xuất từ trong thực vật và rõràng không gây hại cho cây trồng” (Hallmann và cs, 1997) Nói chung, một tỷ lệ lớn hơncủa endophytes là PGPR là trường hợp cho vi khuẩn sinh sống tại các rễ nổi trên mặt đấthoặc rễ (Nowak, 1998) Vi khuẩn trong nốt sần (rhizobia) và các vi khuẩn vùng rễ cốđịnh đạm cũng là endophytes (Lodewyckx và cs 2002 ), chúng sống trong các cơ quan rễphát triển đặc biệt, chúng có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các vikhuẩn cố định đạm chủ yếu cây họ đậu rhizobia và cây thân gỗ liên quan đến loài

Frankia (Gardner và cs, 1984; Reddell và cs, 1991; Rosbrook và Reddell, 1995; Nickel

và cs, năm 2001; Rojas và cs, 2001) mặc dù cyanobacteria cố định đạm cộng sinh củacây mè (Rai và cs, 2000) cũng là các PGPR Để hỗ trợ cho khái niệm này, hai thuật ngữđơn giản được áp dụng: vi khuẩn PGPR nội bào (iPGPR) cư trú bên trong tế bào thực vật,sản xuất các nốt và được cư trú sâu trong những cấu trúc đặc biệt và PGPR ngoại bào(ePGPR ) - những vi khuẩn sống bên ngoài tế bào thực vật và không sản xuất nốt, nhưngtăng cường tăng trưởng thực vật thông qua sản xuất các hợp chất tín hiệu trực tiếp kíchthích tăng trưởng thực vật, cải thiện khả năng kháng bệnh thực vật hoặc cải thiện vậnđộng các chất dinh dưỡng của đất ePGPR có thể được chia thành ba loại, dựa trên mức

độ kết hợp với rễ cây: những chủng sống gần, những chủng không tiếp xúc với cội rễ,những vi khuẩn cư trú trên bề mặt rễ và những chủng sống trong không gian giữa các tếbào của vỏ rễ (Hình 2)

Hình 2: Mức độ của các tập đoàn vi khuẩn trong rễ cây: iPGPR sản xuất nốt và sinh

sống trên rễ cây và ePGPR.

3 Vi khuẩn có khả năng sản sinh hormone tăng trưởng IAA

Ảnh hưởng của auxin lên sự phát triển của mỗi giống thực vật phụ thuộc vào nồng

độ auxin, ở nồng độ thấp có thể kích thích tăng trưởng nhưng lại có thể gây ức chế ởnồng độ cao Chính sự tập trung của các chủng vi khuẩn đặc hiệu xung quanh chúng sẽquyết định nồng độ auxin đó (Arshad và cs, 1991) Thực vật khác nhau đáp ứng khácnhau với nồng độ auxin biến động (Sarwar và cs, 1994) Theo báo cáo của Saharan vàcộng sự (2011) các chủng sản xuất số tiền chất cao nhất của auxin là indole acetic acid(IAA) và indole acetamit (IAM) trong đất ở môi trường bình thường làm cho tốc độ tăngtrưởng và năng suất của lúa mì đạt mức tối đa Ngay cả các chủng sản xuất số lượng IAAthấp hơn nhưng liên tục và ổn định cũng giúp cải thiện tăng trưởng thực vật (Tsavkelova

và cs, 2007) Các chủng này sản xuất một số lượng lớn các IAA hỗ trợ thực vật trongđiều kiện bất lợi về môi trường (Giongo và cs, 2007) Sự tồn tại của vi khuẩn trong vùng

rễ cũng như trọng lượng rễ và chồi của cây lúa mì bị ảnh hưởng tích cực của việc bổ sung

IAA (Narula và cs, 2006) Được phân lập từ rễ của phong lan nhiễm bệnh Dendrobium moschatum, các chủng Rhizobium, Microbacterium, Sphingomonas, và chi

Mycobacterium là một trong những chủng sản xuất IAA tích cực nhất Loài Pseudomonas và vi khuẩn Bacillus có thể sản xuất chất kích thích sinh học nhưng không

được đặc trưng cho phytohormones hoặc điều hòa sinh trưởng do cây trồng có số lượngrất lớn rễ tốt làm tăng bề mặt hấp thụ của rễ cây để hấp thụ nước và chất dinh dưỡng Vikhuẩn vùng rễ là nhóm vi khuẩn đầu tiên có khả năng của PGPR để tổng hợp IAA thúcđẩy sự tăng trưởng và kháng bệnh trong các loài thực vật (Mandal và cs, 2007) Tổng hợp

IAA được nghiên cứu trong các chủng Rhizobium liên kết với một vài vật chủ như trong

cây họ đậu (Roy và Basu, 2004) Tuy nhiên, Sridevi và Mallaiah (2007) cho thấy rằng tất

cả các chủng Rhizobium phân lập từ nốt sần rễ của Sesbania sesban (L) M đều sản xuất IAA Các Rhizobium sp phân lập từ nốt sần rễ cây Vigna mungo (L) H được tìm thấy để

cung cấp ở mức độ cao IAA cho trẻ hóa và phát triển mạnh nốt sần rễ Tất cả các

Rhizobium spp phân lập từ Crotalaria sp đều hoạt động tích cực cho việc sản xuất IAA

nhưng các chủng đó lại có sự khác biệt đáng kể trong sản xuất auxin tùy thuộc vào cácđiều kiện nuôi cấy Theo Etesami và cộng sự (2009) vi khuẩn vùng rễ có thể được sửdụng như chất kích thích và phân sinh học phục vụ sản xuất lúa mì vì nó có thể hấp thunhiều chất dinh dưỡng (N, P và K) bằng cách sản xuất IAA và sau đó làm phát triển mạnh

mẽ hệ thống rễ cây Khi làm việc trên đậu xanh cho thấy các chủng Bacillus, Pseudomonas và Azotobacter đều sản xuất được IAA nhưng chỉ có 85,7% Rhizobium có

thể sản xuất IAA

Pseudomonas fluorescens B16 là PGPR tạo ra Pyrroloquinoline quinone - một yếu

tố thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Choi và cs, 2008) Tuy nhiên, khả năng sản xuất chất

tăng trưởng thực vật như phytohormone và IAA của Azotobacter là để cải thiện tốt hơn cho hoạt động của diazotrophic Vi khuẩn Pseudomonas, đặc biệt là P fluorescens và P putida là loại quan trọng nhất của PGPR sản xuất auxin và làm tăng năng suất Khakipour và cộng sự (2008) đánh giá tiềm năng sản xuất auxin của chủng Pseudomonas

thông qua nghiên cứu sắc ký, sử dụng HPLC đưa ra so sánh với các phương pháp được

sử dụng và chỉ định phương pháp tổng hợp IAA của các chủng nghiên cứu khi áp dụng.Trong thực tế, một loạt các auxin như axit indole-3-acetic acid (IAA), axit indole-3-pyruvic, axit indole-3- butyric và acid lactic indol; cytokinin và giberelin được phát hiện

nhưng việc sản xuất ra auxin là quan trọng nhất (Barassi và cs, 2007) Chủng

Azospirillum brasilense SM có tiềm năng trở thành một loại vi khuẩn vùng rễ với khả

năng gây nên sự tích tụ IAA dưới các áp lực chất dinh dưỡng, biến động môi trường, nuôicấy hàng loạt dài hạn và có ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển của lúa miến Hơn nữa,

nó cũng có khả năng thúc đẩy sự phát triển của một số loại cây trồng khác như đậu xanh,ngô, và lúa mỳ (Malhotra và Srivastava, 2008) Một số vi khuẩn hòa tan P và hoạt độngcủa một số loài nấm có khả năng sản xuất IAA giúp kích thích tăng trưởng thực vật,nhưng khả năng sản xuất IAA khác nhau giữa các chủng PSB và PSF (Souchie và cs,

2007) Bacillus megaterium từ rễ trà có thể sản xuất IAA và do đó thúc đẩy tăng trưởng

thực vật (Chakraborty và cs, 2006)

Một số vi sinh vật sản xuất auxin khi có sự hiện diện của một tiền chất phù hợp

như L-tryptophan Tăng tryptophan dẫn đến tăng khả năng sản xuất IAA trong Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (Idris và cs, 2007) Tiến và các cộng sự cho thấy Azospirillum

có thể sản xuất auxin khi tiếp xúc với tryptophan Cây được lây nhiễm với vi khuẩn vùng

rễ cùng với ion Ag+ và L-tryptophan (TRP) cho trọng lượng khô của rễ cao nhất và làmtăng đáng kể sự hấp thu của N, P, K so với cây đối chứng không lây nhiễm Karnwal thử

nghiệm fluorescent Pseudomonas phân lập được về khả năng sản xuất axit axetic indol

trong môi trường nhân tạo khi có và không có sự xuất hiện của L-tryptophan, kết quả chothấy khả năng sản xuất IAA sẽ tăng khi gia tăng nồng độ tryptophan

Một số nghiên cứu đã chỉ ra các chủng sản xuất IAA có tác dụng kích thích sựtăng trưởng của rất nhiều đối tượng thực vật Thí nghiêm được tiến hành trên khoai langgiống khi được cấy với các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA, kết quả làm tăngđáng kể sự phát triển của khoai lang thông qua sự hấp thu N, P, K, Ca và Mg (Farzana và

cs, 2005) Có một gia tăng đáng kể khối lượng khô của rễ và gốc rễ của cây bạch đàn khitrồng trên nền đất có vi khuẩn vùng rễ có khả năng sản xuẩt IAA (Saharan và cs, 2011).Một số chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích sự hình thành phát triển rễ và cây, tối đa hóanăng suất các cây được cắt trong vườn ươm vô tính (Teixeira và cs, 2007) Khi dưachuột, cà chua và hạt tiêu được lây nhiễm với các chủng PGPR sản xuất IAA, có một sự

gia tăng đáng kể trong sự phát triển của các loại thực vật này (Kidoglu và cs, 2007) Vikhuẩn có khả năng tổng hợp IAA đóng một vai trò quan trọng trong thúc đẩy nảy mầmhoa lan, ít nhất là khi các chủng vi khuẩn đã được gắn chặt chẽ với các hạt giống Chủng

Azospirillum brasilense Az39 và Brayrhizobium japonicum dòng E109 cả hai đều có khả

năng bài tiết IAA vào môi trường nuôi cấy, tại một nồng độ đủ để tạo ra những thay đổi

hình thái và sinh lý trong mô hạt giống của ngô (Zea mays L) và đậu tương (Glycine max

L) và chịu trách nhiệm thúc đẩy sự phát triển sớm của chúng (Cassa´na và cs, 2009) Việc

sử dụng các PGPR phân lập được rất có lợi cho trồng lúa, có thể thúc đẩy sự phát triểncủa lúa bằng cách gây sản xuất IAA (Saharan và cs, 2011)

3.1 Con đường chuyển hóa IAA của các vi khuẩn bên trong rễ thực vật

Với những phân tích từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau thì có các con đường tổnghợp IAA khác nhau đã được xác định Tìm thấy sự tương đồng giữa con đường sinh tổnghợp IAA ở thực vật và vi khuẩn Tổng quan về con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩnđược mô tả bởi Spaepen và cộng sự (2007) (Hình 3), và tình trạng hiện tại của các genliên quan, protein và các trung gian chất chuyển hóa được thảo luận Nếu có thể, so sánhvới cây sinh tổng hợp IAA được thực hiện thì tryptophan đã được xác định là một tiềnthân chính chuyển hóa sinh tổng hợp IAA và là con đướng chính trong vi khuẩn Việcxác định trung gian dẫn đến việc xác định năm con đường khác nhau sử dụng tryptophannhư một tiền tố cho IAA

Hình 3: Tổng quan về các con đường tổng hợp IAA ở vi khuẩn

Các sản phẩm trung gian được đề cập là tên của con đường chuyển hóa IAAld, 3-acetaldehyde; IAM, indole-3 acetamide; IPDC, indole-3-pyruvate decarboxylase; Trp, tryptophan (Theo Spaepen và cs, 2007)

indole-Con đường tổng hợp IAA từ Indole-3-acetamide

Con đường tổng hợp IAA theo đường hướng indole-3-acetamit (IAM) được đánh

giá tốt nhất và đặc trưng cho sự tổng hợp IAA của vi khuẩn Trong lộ trình hai bước nàytryptophan được chuyển thành IAM bởi enzyme tryptophan-2-monooxygenase (IaaM)

mã hóa bởi gen iaaM Trong bước thứ hai, IAM được chuyển thành IAA bởi một IAMhydrolase (IaaH) mã hóa bởi iaaH Các gen iaaM và iaaH đã được tái bản và đặc trưng từ

những vi khuẩn khác nhau chẳng hạn như vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae, Pantoea agglomerans, Rhizobium và Bradyrhizobium (Sekine và

cs, 1989; Clark và cs, 1993; Morris, 1995; Theunis và cs, 2004) Các gen liên quan đến

IAM đã phát hiện trên nhiễm sắc thể trong loài Pseudomonas khác nhau cũng như trên plasmid như pPATH của Pa agglomerans (Glickmann và cs, 1998; Manulis và cs, 1998).

Con đường tổng hợp IAA từ Indole-3-pyruvate

Con đường indole-3-pyruvate (IPyA) được cho là một con đường chính cho sinhtổng hợp IAA trong thực vật Tuy nhiên, các gen chủ chốt và enzyme đã chưa được xácđịnh trong các loài thực vật Trong vi khuẩn, sản xuất IAA thông qua con đường IPyA đã

được mô tả ở một loạt các vi khuẩn như các vi khuẩn kháng nấm đạo ôn Pa agglomerans,

vi khuẩn có lợi Bradyrhizobium, Azospirillum, Rhizobium và Enterobacter cloacae và vi

khuẩn lam (Spaepen và cs, 2007) Bước đầu tiên trong con đường này là biến đổitryptophan thành IPyA bởi một aminotransferase (transamination) Trong tỷ lệ giới hạnthì IPyA bị decarboxylated thành indole-3 acetaldehyd (IAAld) bởi decarboxylase indole-3-pyruvate (IPDC) Trong bước cuối cùng IAAld bị oxy hóa thành IAA (Hình 4) Gen mã

hóa cho enzyme quan trọng – IPDC đã được phân lập và đặc trưng từ Azospirillum brasilense, En cloacae, Pseudomonas putida và Pa agglomerans (Koga và cs, 1991;

Costacurta và cs, 1994; Brandl và Lindow, 1996; Patten và Glick, 2002b) Trong

Azospirillum lipoferum, gen IPDC nằm trên nhiễm sắc thể (Blaha và cs, 2005) nhưng

trong hầu hết các trường hợp xác định bộ gen thì vị trí của gen này đã không được xácđịnh trên nhiễm sắc thể Trong những sinh vật này, con đường bất hoạt insertional dẫn

đến khả năng sản xuất IAA thấp hơn, giảm lên đến 90% ở Az brasilense (Prinsen và cs,

1993) cho thấy tầm quan trọng của con đường IPyA trong sản xuất auxin.Tuy nhiên,trong trường hợp xuất hiện đột biến hoàn toàn gen sinh tổng hợp IAA thì vẫn có conđường sinh tổng hợp IAA dự phòng

Con đường tổng hợp IAA từ Tryptamine

Ở vi khuẩn, con đường tổng hợp tryptamine (TAM) đã được xác định trong vi

khuẩn Bacillus cereus bằng cách xác định hoạt động của tryptophan decarboxylase ( Perley và Stowe, 1966) và trong Azospirillum bởi phát hiện việc chuyển đổi tryptamine

ngoại sinh thành IAA (Hartmann và cs, 1983) Trong thực vật tryptamine được xác định

là một hợp chất nội sinh và gen mã hóa cho decarboxylases tryptophan (xúc tácdecarboxylation chuyển tryptophan thành tryptamine) đã được nhân lên và đặc trưng từcác loài thực vật khác nhau cho thấy một con đường sinh tổng hợp IAA qua tryptaminetrong thực vật Các quá trình làm hạn chế cho con đường này trong thực vật có lẽ được

xúc tác bởi một loại protein monooxygenase giống như flavin (YUCCA) (chuyển đổitryptamine N - hydroxyl - tryptamine) Sự hiện diện của các chất trung gian, đó là vùngdưới N - hydroxyl - tryptamine (có lẽ là indole -3- acetaldoxime và indole -3-acetaldehyd) cần phải được khẳng định (Bak và cs, 2001; Zhao và cs, 2001) Bước cuốicùng của con đường này trong vi khuẩn là khác với các nhà máy: trong vi khuẩn TAM làchuyển đổi trực tiếp với IAAld bởi một oxidase amin (Hartmann và cs, 1983).

Con đường tổng hợp IAA từ Tryptophan side-chain oxidase

Hoạt động của Tryptophan side-chain oxidase (TSO) chỉ được chứng minh trong

Pseudomonas fluorescens CHA0 Trong này con đường tryptophan được chuyển trực tiếp

đến IAAld bỏ qua IPyA, có thể được oxy hóa thành IAA (Oberhansli và cs, 1991) Không

có dấu hiệu cho thấy con đường này tồn tại trong thực vật

Con đường tổng hợp IAA từ Indole-3-acetonitrile

Sinh tổng hợp IAA thông qua indole-3- axetonitril (IAN) đã được nghiên cứu rộngrãi ở cây trồng trong những năm gần đây Cuối cùng bước vào con đường này ở vi khuẩnthì việc chuyển đổi IAN thành IAA do một nitrilase đã được xác định bởi Bartling và cs(1992); các bước dẫn đến sự hình thành của IAN từ tryptophan vẫn là một vấn đề đangđược tranh luận Gần đây, hai con đường đã được đề xuất cho sự hình thành này: mộtqua glucosinolate indolic (glucobrassicin) và hai là thông qua indole -3- acetaldoxime

(Bak và cs, 2001; Zhao và cs, 2001) Trong vi khuẩn như Alcaligenes faecalis (Nagasawa

và cs, 1990; Kobayashi và cs, 1993) nitrilases đã phát hiện với độ đặc hiệu cho

indole-3-acetonitrile Trong Agrobacterium tumefaciens và Rhizobium spp thì nitrile hydratase và

amidase được xác định, cho thấy việc chuyển đổi của IAN thành IAA thông qua IAM(Kobayashi và cs, 1995)

Con đường Tryptophan độc lập

Một con đường tryptophan độc lập ở vi khuẩn được chứng minh trong Az brasilense bằng cách bố trí các thí nghiệm với tiền chất Con đường này chiếm ưu thế

trong trường hợp không có tryptophan được bổ sung vào môi trường: 90% IAA đượctổng hợp thông qua con đường tryptophan độc lập, trong khi chỉ có 0,1% được sản xuấtthông qua con đường IAM (Prinsen và cs, 1993)

Trong Pa.agglomerans, ví dụ gen trong con đường IAM cũng như cho con đường

IPyA đã được xác định (Manulis và cs, 1998) Việc sử dụng kỹ thuật phân tích để pháthiện và định lượng các chất trung gian cũng như sự tiến bộ nhanh chóng trong hệ genchức năng sẽ chắc chắn cung cấp một thông tin chi tiết hơn về con đường sinh tổng hợpIAA khác nhau hiện diện trong vi khuẩn

3.2 Sàng lọc các gen quy định cho khả năng tổng hợp IAA ở vi khuẩn

Có ý kiến cho rằng 80% các vi khuẩn vùng rễ sản xuất IAA (Patten và Glick,1996; Khalid và cs, 2004) Tuy nhiên, nghiên cứu về xác định và mô tả đặc điểm các genchủ chốt hoặc protein liên quan đến sinh tổng hợp IAA là ít và hầu như đã được hướngdẫn đến một gen cụ thể hoặc protein của một con đường sinh tổng hợp Mặc dù đã có sẵnmột bộ sưu tập lớn các chủng tổng hợp IAA nhưng việc xác định các gen hoặc protein

vẫn chỉ giới hạn trong một nhóm nhỏ các mô hình sinh vật , ví dụ Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum, Pa agglomerans và En Cloacae (Spaepen và cs, 2007) Ngay

cả trong những sinh vật mô hình, tuy đã tạo ra được đột biến gen gây mất khả năng sinhtổng hợp IAA nhưng trên thực tế vẫn có IAA được sinh ra, từ đó cho thấy rằng trong vikhuẩn IAA được tổng hợp thông qua nhiều con đường

Bảng 2.1: Lựa chọn protein làm mục tiêu cho công cụ tìm kiếm BLAST

decarboxylase Enterobacter cloacaeIPyA Phenylpyruvate decarboxylase Azospirillum brasilense Sp245IPyA/TAM Indole-3-acetaldehyde Ustilago maydis FB1

dehydrogenaseTAM Tryptophan decarboxylase Catharanthus roseus

TAM Copper amine/tyramine

oxidase Klebsiella aerogenes

Để mở rộng nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng sản xuất IAA, phân tích bộ gencho thấy sự hiện diện của gen sinh tổng hợp IAA được công bố công khai Sử dụng cácgen hoặc protein đặc trưng làm chức năng như mục tiêu trong một tìm kiếm BLAST(bảng 2.1) Con đường IAN được loại trừ khỏi phân tích do gen hay protein của conđường này trong vi khuẩn thiếu đặc trưng Trong bước thứ hai của thuật toán BLAST(Altschul và cs, 1997), trình tự nucleotide dịch mã hoặc chuỗi protein mục tiêu đã được

sử dụng để xác định các protein tương tự trong trình tự bộ gen Theo báo cáo củaSpaepen và cộng sự (2007) thì kết quả BLAST được tóm tắt và diễn giải trong bảng 2.1,trong đó cho thấy sự phân bố của các con đường khác nhau giữa các bộ gen được nghiêncứu của 369 trình tự gen (chuỗi lấy từ NCBI trên 12-09-2006), 57 trình tự bộ gen (15,4%)chứa các gen cần thiết tổng hợp IAA từ tryptophan Sự hiện diện của gen sinh tổng hợpIAA trong hệ gen không có nghĩa là vi khuẩn có khả năng sản xuất IAA: chức năng phântích các gen vẫn còn cần thiết để xác nhận khả năng tổng hợp IAA Sự tách cặp giữa biểuhiện của gen sinh tổng hợp IAA và khả năng sinh tổng hợp IAA được minh họa bằng vi

khuẩn kỵ khí phân hủy Nitơ ở dạng khử là Azoarcus chủng EbN1 Hệ gen mã hóa cho

phenylpyruvate decarboxylase và các gen khác là một phần của con đường IPyA (Rabus

và cs, 2005) Trong số vi khuẩn mà bộ gen được giải trình tự tại NCBI, gen mã hóa chocon đường IPyA là nhiều nhất trong số 89,5% các chủng tổng hợp IAA giả định

Bảng 2.2: Phân phối con đường tổng hợp IAA của vi khuẩn đã được công bố công

đã được nghiên cứu mã hóa cho một hoặc nhiều con đường có thể sinh tổng hợp IAA, xuhướng này cần xác nhận thêm Khả năng sản xuất IAA không phải là phổ biến như mongđợi trong vi khuẩn cộng sinh với thực vật: 19,2 % trình tự các chủng có một hoặc nhiềucon đường sinh tổng hợp IAA mã hóa trong hệ gen của chúng

Một quan sát đáng chú ý là sự phân bố của con đường TAM (được xác định trong8,8% của các chủng tổng hợp IAA giả định): gen mã hóa enzyme của con đường là TAMđược tìm thấy trong vi khuẩn lam, đất và vi khuẩn cộng sinh với thực vật

(Rhodopseudomonas và Mesorhizobium) Thông qua thí nghiệm, chất trung gian TAM

đã được xác định trong Azospirillum và Bacillus cereus (Hartmann và cs, 1983) Protein

tương tự như decarboxylase tryptophan, liên quan đến những chuyển hóa đầu tiên củaquá trình TAM thì chưa được xác định cho những đặc trưng của vi khuẩn

Sản xuất IAA qua IPyA đã được mô tả cho cyanobacteria (Sergeeva và cs, 2002).Nhưng vi khuẩn lam chứa phần lớn lục lạp dẫn đến liên kết tiến hóa giữa thực vật và vikhuẩn sinh tổng hợp IAA trở thành có liên quan Trong ba loài vi khuẩn lam thì nhữnggen quan trọng có thể tham gia vào sinh tổng hợp IAA được xác định thì cả hai gen quyđịnh cho con đường IPyA, được coi chính là một Con đường sinh tổng hợp IAA pháthiện trong thực vật chính là con đường TAM đã được xác định

3.3 Tương tác của nhóm vi khuẩn tổng hợp IAA đến khả năng phát triển thực

vật

Như chúng ta đã biết vi khuẩn vùng rễ có thể sử dụng các con đường khác nhaucho sinh tổng hợp IAA Hầu hết trong số chúng sử dụng tryptophan được tiết ra từ thựcvật như một phần của dịch tiết ở rễ là một tiền chất (Costacurta và Vanderleyden, 1995;Spaepen và cs, 2007; Spaepen và cs, 2009) (Hình 4) Kamilova và cs (2006) quan sát

thấy rằng P fluorescens WCS365 kiểm soát điều kiện sinh học bất lợi trong khi sản xuất

IAA trong sự hiện diện của tryptophan, có thể kích thích tăng trưởng rễ của củ cải, mộtloại cây tiết ra một lượng lớn tryptophane trong dịch tiết của nó

Theo nghiên cứu mới nhất của Lugtenberg và cộng sự (2013) về khả năng tươngtác của nhóm vi khuẩn tổng hợp IAA đến khả năng phát triển của thực vật đã được phân

tích trên chủng Azospirillum brasilense, một vi khuẩn cố định đạm thúc đẩy tăng trưởng

thực vật bằng cách tăng sự xuất hiện ở bề mặt rễ của mình thông qua việc rút ngắn chiềudài rễ chính và nâng cao hình thành rễ bên, lông hút Quan điểm hiện nay sản xuất auxin

là yếu tố chính chịu trách nhiệm cho những thay đổi ở rễ thực vật và do đó chúng là tácnhân tăng thúc đẩy tăng trưởng ở thực vật (Pliego và cs, 2011; Hình 4) Khái niệm này

được dựa trên các quan sát được trên chủng Azospirillum brasilense như sau:

(i) Dobbelaere và cộng sự (1999) cho thấy rằng tác động của những chủng hoang

dã trên rễ có thể đã được mô phỏng bằng cách bổ sung thêm auxin tinh khiết (ii) Một chủng đột biến bị giảm mạnh trong sản xuất IAA thì không gây ra những

thay đổi về rễ

(iii) Một chủng có khả năng sản xuất IAA sau khi phân lập cho thấy tác dụng tương

tự trên những thay đổi rễ như các chủng tự nhiên ban đầu nhưng đã ở nồng độ

tế bào vi khuẩn thấp hơn (Spaepen và cs, 2008)

Điều thú vị là, khi số lượng dịch tiết rễ trở nên hạn chế cho vi khuẩn phát triển,

Azospirillum brasilense tăng sản xuất IAA của nó, do đó tạo ra các rễ bên và sự hình

thành lông hút mà kết quả tạo ra tiết dịch nhiều hơn do đó vi khuẩn phát triển hơn nữa

Hình 4: Kích thích các rễ nhánh và phát triển bởi auxin Màu xanh lá cây: thực vật.

Màu hồng: vi sinh vật Màu xanh dương: quy trình (Lugtenberg, 2013)

Với những phân tích tỉ mỉ hơn về các loài vi khuẩn, vai trò của IAA tổng hợp từ vikhuẩn trong các tương tác với thực vật thì các đặc điểm vi sinh vật xuất hiện được đadạng hơn Sự phân bố rộng của gen sinh tổng hợp IAA trên vi khuẩn, sự tồn tại của conđường trao đổi chất khác nhau và sự đa dạng trong kết quả về phía thực vật khi vi khuẩn

tổng hợp IAA tương tác với thực vật, gợi lên câu hỏi là tại sao vi khuẩn sản xuất IAA.Ngoại trừ một vài trường hợp, mối liên hệ giữa vi khuẩn tổng hợp IAA và thực vật đãkhông được chứng minh hoặc ít nhất là vẫn còn chưa sang tỏ Đây là một phần của tổngquan nhằm mục đích đưa ra một cái nhìn sâu sắc sản xuất IAA của vi khuẩn là một trongnhững chiến lược khác nhau để dụ dẫn tạo ra những liên kết với cây trồng là yếu tố kiểmsoát đến kết quả của năng suất của cây.

Hàng loạt PGPR, nó đã được chứng minh rằng tăng cường phổ biến lượng rễ có

liên quan đến vi khuẩn sinh tổng hợp IAA Nghiên cứu với đột biến Azospirillum thay đổi trong sản xuất IAA ủng hộ quan điểm rằng tăng rễ là do Azospirillum tổng hợp IAA

(Dobbelaere và cs, 1999) Sự tăng cường hấp thu khoáng ở rễ cây và gốc tiết ra dịch, do

đó kích thích vi khuẩn xâm lấn phát triển và do đó khuếch đại hiệu quả việc cộng sinhcủa vi khuẩn vào thực vật (Dobbelaere và cs, 1999; Lambrecht và cs, 2000; Steenhoudt

và Vanderleyden, 2000) Hơn nữa, đường cong sinh trưởng của rễ trong nuôi cấy với

nồng độ ngày càng tăng của Azospirillum đặc biệt phù hợp với đường cong sinh trưởng

của rễ khi tăng nồng độ IAA (Fallik và cs, 1994) Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu

người ta thấy rằng Azospirillum một mình sinh tổng hợp IAA không thể đáp ứng cho các

loài thực vật tổng thể hiệu lực thúc đẩy tăng trưởng mà đã quan sát được Do đó, " Giảthuyết thêm " đã được đề xuất để giải thích sự tăng trưởng và thúc đẩy năng suất với

Azospirillum, giả thuyết được đưa ra rằng việc thúc đẩy tăng trưởng là kết quả của nhiều

cơ chế (phytohormone sinh tổng hợp, cố định đạm, những cơ chế khác) làm việc cùng

nhau (Ba-san và Holguin, 1997) Tương tự như vậy, khả năng của Ps putida GR12 - 2

để kích thích kéo dài rễ đã được chứng minh có liên quan đến sản xuất IAA nhưng sảnxuất IAA không phải nguyên nhân chủ yếu thúc đẩy tăng trưởng, bằng chứng là mộtnghiên cứu với IAAoverproducing đột biến (Xie và cs, 1996) Trong nghiên cứu củachúng transposon đột biến được sử dụng để cô lập bảy đột biến mà IAA overproduced sovới loại hoang dã Điều thú vị là sáu trong số bảy đột biến có một đột biến mà sản xuấtIAA là gấp ba lần tốc độ của GR12 - 2, kích thích rễ kéo dài theo thống kê thì tươngđương với GR12 - 2 này Phát hiện chứng tỏ với GR12 - 2 lây nhiễm trên thực vật không

thể hiện mối quan hệ trực tiếp giữa nồng độ IAA sản xuất và tầm quan trọng của sự kéodài rễ Một đột biến sản xuất IAA là gấp bốn lần tốc độ của GR12 -2 thì rễ bị mất hoạtđộng kéo dài Điều này được giải thích bởi sự tương tác của IAA với enzyme 1 -aminocyclopropane - 1 - carboxylate (ACC) synthase Số lượng lớn IAA do vi khuẩncùng với thực vật sản xuất nội sinh kích hoạt ACC synthase, dẫn đến sản xuất của ACC,một tiền chất cho ethylene Ethylene là một chất ức chế tăng trưởng rễ, đặc biệt giảm độdài rễ chính (Glick và cs, 1998 Glick, 2005) Đặc điểm chính của GR12 -2 là loại vikhuẩn sản xuất deaminase ACC có thể chuyển đổi ACC với amoniac và mộtketobutyrate Chuyển đổi này làm giảm các nồng độ của ACC trong môi trường rễ, do đólàm giảm số lượng ethylene và do đó ức chế sự tăng trưởng của rễ Các vi khuẩn có lợithế trong tình trạng này sẽ bằng cách sử dụng ACC như một nguồn nitơ Do đó, mộttương tác khác cân bằng các yếu tố bao gồm cả vi khuẩn sinh tổng hợp IAA sẽ tốt hơn làsản xuất IAA xe như một đặc điểm cần thiết để kích thích tăng trưởng thực vật (Xie và

cs, 1996)

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu nghiên cứu

Rễ cây lúa được thu thập tại vùng phụ cận Thị trấn Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm,thành phố Hà Nội; Làng Cõi, Huyện Nam Sách, Tỉnh Hải Dương

5 Hạt giống lúa thu thập từ trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồngTrường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (NV1, N91, T65, T23, N46)

3 hạt giống lúa thu thập từ bộ môn Di truyền – Giống, Khoa Nông Học, Đại họcnông nghiệp Hà Nội (KD18, BC15, BT7)

2 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

3 Thời gian nghiên cứu

Tháng 7 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

4 Nội dung nghiên cứu

4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập

Chọn lọc ra 4 chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA cao nhất, tiềm năng nhất

để phục vụ tiếp theo cho các nghiên cứu tiếp theo

4.1.1 Thí nghiệm 1: Phân lập, nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn có khả

năng tổng hợp IAA sống trên bề mặt rễ lúa

Chọn 30 chủng vi khuẩn phân lập được từ bề mặt rễ lúa để nghiên cứu các đặcđiểm của chúng dựa trên các chỉ tiêu theo dõi Sau khi được làm thuần các chủng vikhuẩn được nuôi lỏng lắc trên môi trường King’B (1954) kiểm tra hoạt tính IAA bằngphản ứng màu sử dụng thuốc thử Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995) Sau đó sàng

lọc ra từ 1 đến 3 chủng có khả năng tổng hợp IAA tốt nhất để đánh giá các dặc trưng hìnhthái.

4.1.2 Thí nghiệm 2: Phân lập, nghiên cứu đặc điểm các chủng vi khuẩn sống cộng

sinh trong rễ lúa

Chọn 60 chủng vi khuẩn được phân lập từ bên trong rễ lúa rồi nghiên cứu các đặcđiểm của chúng dựa trên các chỉ tiêu theo dõi Sau khi được làm thuần các chủng vikhuẩn được nuôi lỏng lắc trên môi trường King’B (1954) kiểm tra hoạt tính IAA bằngphản ứng màu sử dụng thuốc thử Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995) Sau đó sànglọc ra từ 2 đến 4 chủng có khả năng tổng hợp IAA tốt nhất để đánh giá các đặc trưng hìnhthái

4.2 Nội dung 2: Đánh giá khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn thông qua ảnh hưởng của một số thành phần môi trường

Các chủng vi khuẩn sau khi được xác định về mặt đặc điểm hình thái và xác địnhkhả năng tổng hợp IAA được bố trí các thí nghiệm ảnh hưởng của các thành phần môitrường đến khả năng tổng hợp IAA của chúng Nhằm tìm ra công thức môi trường tối ưunhất cho vi khuẩn sản xuất được lượng IAA có nồng độ cao nhất trong khoảng thời gianngắn nhất Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp IAA cần đượcnghiên cứu như nồng độ các chất: L-tryptophan, nguồn cacbon, nguồn nitơ Ảnh hưởngcủa pH hay thời gian nuôi cấy cũng được nghiên cứu để đánh giá khả năng tác động đếntổng hợp IAA Sử dụng nền môi trường để nuôi vi khuẩn là King’B (King và cs, 1954).Lượng IAA được xác định thông qua thuốc thử Salkowski (Glickmann và Dessaux,1995) sau đó được đo ở bước sóng 535 nm và đối chiếu với đường chuẩn IAA đã xâydựng được để xác định hàm lượng Các thí nghiệm được xây dựng và nghiên cứu trên 4chủng vi khuẩn sàng lọc được

4.2.1 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ L-Tryptophan đến khả năng tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn