(Luận văn thạc sĩ) tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của một số bệnh nhân điều trị ở bệnh viên đa khoa việt tiệp hải phòng 2010 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN VŨ SƠN TÌM HIỂU CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ Ở BỆNH VIỆN ĐA KHOA VIỆT TIỆP HẢI PHÒNG 2010 - 2012 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN VŨ SƠN TÌM HIỂU CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ Ở BỆNH VIỆN ĐA KHOA VIỆT TIỆP HẢI PHÒNG 2010 - 2012 Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Lê Thị Quỳnh Mai Hà Nội - Năm 2012 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC VI RÚT ĐƢỜNG HÔ HẤP 1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae 1.1.2 Vi rút họ Paramyxoviridae 1.1.3 Vi rút họ Picornaviridae 1.1.4 Vi rút họ Coronaviridae 12 1.2 SỰ LƢU HÀNH CỦA VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP 15 1.2.1 Trên giới 15 1.2.2 Tại Việt Nam 17 1.3 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG 19 1.4 DỰ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ 19 1.4.1 Dự phòng 20 1.4.2 Điều trị 21 1.5 CHẨN ĐOÁN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM 22 1.5.1 Phương pháp phát kháng nguyên 22 1.5.2 Phương pháp phát vật liệu di truyền 23 1.5.3 Phương pháp phát kháng thể 24 1.6 CƠ SỞ LÝ LUẬN ĐỂ THIẾT KẾ VÀ TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 26 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 28 2.1.1 Định nghĩa ca bệnh 28 2.1.2 Cỡ mẫu 28 2.2 VẬT LIỆU 28 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm 28 2.2.2 Trang thiết bị dụng cụ 30 2.2.3 Sinh phẩm 32 2.3 PHƢƠNG PHÁP 37 2.3.1 Tách chiết vật liệu di truyền vi rút ARN 37 2.3.2 Phản ứng di truyền phân tử (PCR) 37 2.3.3 Phương pháp Luminex/xTAG RVP 43 2.3.4 Phân lập 45 2.3.5 Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence) 47 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 3.1 CÁC TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TẠI HẢI PHÒNG 50 3.1.1 Sự phân bố bệnh phẩm theo tháng 50 3.1.2 Phân bố ca bệnh theo giới 51 3.1.3 Phân bố theo độ tuổi 52 3.2 XÁC ĐỊNH CĂN NGUYÊN 53 3.2.1 Tỷ lệ tác nhân vi rút gây VĐHHC xác định nghiên cứu 55 3.2.2 Vai trò họ vi rút gây VĐHHC 56 3.2.3 Kết xác định nguyên vi rút gây VĐHHC 57 3.2.4 Phân tích lưu hành tác nhân vi rút theo tháng 61 3.2.5 Sự liên quan tác nhân lây nhiễm lứa tuổi 63 3.3 PHÂN LẬP 65 3.4 XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM 66 3.4.1 Đặc tính kháng nguyên 66 3.4.2 Xác định đặc điểm di truyền vi rút cúm 67 3.5 HỒN THIỆN QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VĐHHC 71 Kết luận: 73 Kiến nghị 74 CÁC CHỮ VIẾT TẮT ARN Axit Ribonucleic ADN Axit Deoxy Ribonuleic Bp Cặp base A/H1N1pdm/09 Vi rút cúm A/H1N1 đại dịch 2009 CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Phịng ngừa kiểm sốt bệnh, Mỹ) dNTP Deoxiribonucleotide 5‟-triphosphates ELISA Enzyme linked-immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme) HA Hemagglutination test (Phản ứng ngưng kết hồng cầu) HAI Hemagglutination Inhibition Test (Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu) KN Antigen (Kháng nguyên) KT Antibody (Kháng thể) RSV Respiratory Syncytial Virus (Vi rút hợp bào đường hô hấp) RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược) TCYTTG World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) VĐHHC Viêm đường hô hấp cấp WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng viêm đường hô hấp cấp (VĐHHC) nguyên vi rút vi khuẩn chủ yếu hay gặp nước có kiểu hình khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều Một số tác nhân gây nên vụ dịch lẻ tẻ thành đại dịch (dịch cúm, vi rút hợp bào hô hấp – Respiratory Sycytial Virus…) [6, 30, 51] Tác nhân vi rút gây bệnh thường gặp là: vi rút thuộc họ Picornaviridae, Paramyxoviridae (RSV, vi rút cúm…), Orthomyxoviridae (vi rút cúm A, B…) [1, 13, 51] Trong đó, vi rút cúm xem nguyên quan trọng gây bệnh VĐHHC [50, 59, 79] Hiện có khoảng 200 loại vi rút có cấu trúc kháng nguyên khác gây bệnh VĐHHC Trên giới, hội chứng VĐHHC xuất quanh năm vùng ôn đới, vào thời gian thời tiết lạnh ẩm Bệnh viêm đường hô hấp cấp nguyên vi rút thường mang tính chất “mùa” - thời gian mà số mắc cộng đồng tăng cao, ví dụ: dịch cúm theo mùa, RSV thường tập trung vào mùa đông nước ôn đới thuộc khu vực Bắc bán cầu, cúm nguyên nhân gây VĐHHC vào mùa thu đầu đông, cao điểm nhiễm vi rút entero lại vào cuối hè… VĐHHC vi rút có ảnh hưởng lớn tới sức khỏe đặc biệt trẻ em người già nước phát triển Theo báo cáo tổ chức Y tế giới (WHO) có khoảng 4.5 triệu trẻ em tuổi tử vong hàng năm VĐHHC nguyên vi rút chiếm 40% tổng số [86] Tại Việt Nam, bệnh VĐHHC xảy quanh năm, có tỷ lệ mắc đứng đầu 10 bệnh truyền nhiễm cấp tính [12] Tuy nhiên, nghiên cứu VĐHHC nguyên vi rút tác nhân chủ yếu thường gặp hạn chế Đặc biệt nghiên cứu sâu vi rút học phương pháp chẩn đốn nhanh phịng thí nghiệm kỹ thuật sinh học phân tử, đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên tác nhân vi rút gây bệnh VĐHHC chưa áp dụng rộng rãi, lý chúng tơi tiến hành nghiên cứu: “Tìm hiểu nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp cấp số bệnh nhân điều trị bệnh viện đa khoa Việt Tiệp - Hải Phòng 2010-2012” Với mục tiêu: Xác định tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp bệnh nhân điều trị bệnh viện đa khoa Việt Tiệp Hải Phòng phương pháp RTPCR Luminex/xTAG RVP Tìm hiểu đặc điểm di truyền vi rút cúm thơng qua phân tích vi rút cúm phân lập Hồn thiện quy trình chẩn đốn sớm nhiễm vi rút đường hô hấp bệnh phẩm lâm sàng kỹ thuật RT- PCR thông dụng (conventional RT-PCR) CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC VI RÚT ĐƢỜNG HÔ HẤP Các vi rút gây bệnh VĐHHC thường gặp ghi nhận từ họ là: Adenoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Tuy nhiên, nghiên cứu vi rút thuộc họ thơng dụng phân tích là: Bảng 1.1 Các vi rút gây bệnh VĐHHC STT Họ Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Loại vi rút - Vi rút cúm A (H1N1, H3N2, H1pdm, H5N1) - Vi rút cúm B - Vi rút hợp bào đường hô hấp (Respiratory syncytial virus-RSV) - Vi rút human Metapneumoviridae (hMPV) - Vi rút cúm (vi rút Parainfluenza) phân típ 1, 2, 3 Picornaviridae Coronaviridae - Vi rút Entero - Vi rút Rhino - Vi rút gây hội chứng viêm đường hơ hấp cấp tính nguy hiểm (Severe acute respiratory syndrome coronavirus - SARS-CoV) 1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae 1.1.1.1 Hình thái: Orthomyxoviridae họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genome ARN đơn, âm, phân đoạn Trước đây, vi rút Orthomyxo Paramyxo xếp chung vào họ Myxoviridae chúng có cấu trúc khả lây bệnh giống nhau, sau tách thành họ riêng Orthomyxoviridae Paramyxoviridae phát thấy chúng nhiều đặc điểm không giống [13, 51] Vi rút Orthomyxoviridae gồm nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto vi rút Isa [51] Trong vi rút cúm A lưu hành phổ biến gia cầm, người động vật khác lợn, ngựa… nguyên gây nên đại dịch lớn toàn cầu Vi rút cúm B thường gây bệnh nhẹ bộc phát thành dịch vào mùa đơng, đặc biệt trẻ em Vi rút cúm C chưa thấy biểu gây bệnh nguy hiểm cho người Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc virion vi rút cúm [18] Virion có vỏ đa hình thái, thường có hình cầu với cấu trúc xoắn, đường kính 80-120nm đơi thấy dạng sợi dài đến vài µm Genome vi rút cúm A B chia thành phân đoạn, đơn âm với tổng khối lượng 5x106 Dalton Trong virion có chứa enzyme ARN-polymerase phụ thuộc ARN, enzyme cần cho trình phiên mã genome ARN chuỗi âm Protein capsid kết hợp với ARN tạo nucleocapsid đối xứng xoắn Nucleocapsid bao bọc màng protein M1 (M: Matrix) phía ngồi màng lại bao bọc vỏ lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào chủ Protein M2 đâm xuyên nhô khỏi vỏ ngoài, tạo thành kênh ion, làm cho pH endosome thay đổi [13] Bề mặt vi rút có đính gai chất glycoprotein, kháng nguyên hemagglutinin (HA) neuraminidase (NA) Protein HA gây ngưng kết hồng cầu có vai trị gắn vi rút vào tế bào vật chủ, protein NA có vai trị phá vỡ liên kết vi rút tế bào để giải phóng vi rút 1.1.1.2 Cấu trúc phân tử Vật liệu di truyền vi rút cúm A, B phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb Mỗi phân đoạn mã hoá cho protein cấu trúc không cấu trúc: protein cấu trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP M1 protein không cấu trúc: NS1, NS2 M2 vi rút cúm A NP vi rút cúm B Phân đoạn gen HA gồm 1.742-1.778 nucleotid mã hóa cho 562-566 axit amin, protein HA có khả gây ngưng kết hồng cầu, gắn với thụ thể chứa axit sialic bề mặt tế bào giúp vi rút xâm nhập vào tế bào Protein HA tồn dạng: dạng tiền thân không phân tách HAo dạng phân tách thành HA1 HA2 liên kết với cầu nối disulfua (S-S) Sự phân tách điều kiện định để vi rút có khả gây nhiễm lây truyền vi rút [73] Ngồi ra, vị trí axit amin gen HA có vai trị gắn với thụ thể tế bào chủ đóng vai trị quan trọng việc lây truyền vi rút cúm Vi rút cúm người gắn vào thụ cảm thể tế bào chủ cổng 2.6 (SAα- 2,6 Gal) [43] Phân đoạn gen NA có 1413 nucleotid mã hóa cho 453 axit amin Protein NA có chất enzyme đóng vai trị quan trọng việc giải phóng vi rút từ tế bào nhiễm lan trải vi rút đường hô hấp Các đột biến vị trí axit amin: 275, 295 NA típ N1 hay 292 NA típ N2 liên quan kháng giảm độ nhạy thuốc kháng vi rút (Osertamivir Zanamivir) Sự đột biến cho kết trình cạnh tranh sinh học [19, 34, 35, 42, 44] rút cúm vi rút gây viêm đường hô hấp cấp Hà Nội 2001", Y học thực hành (505), Số 3/2005: 23-26 10 Nguyễn Hữu Tâm (2006) Mô tả số đặc điểm dịch tễ học trường hợp mắc bệnh cúm A/H5N1 Miền Bắc Việt Nam, năm 2005, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật, Đề tài cấp Viện, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Hà Nội 11 Trần Văn Tiến cs (2001) Thống kê bệnh truyền nhiễm tr 40 12 Trƣờng Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Vi sinh Vật (2003) Vi sinh Y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội tr 297-309 13 PGS TS Phạm Văn Ty (2007) Virut học, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội tr 205- 256 14 Nguyễn Thu Vân (2006) Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 tế bào thận khỉ tiên phát quy mơ phịng thí nghiệm, Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nước ĐTDDL-2006/02G, Hà Nội 15 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ƣơng (2001) Phân tích số liệu bệnh truyền nhiễm Việt Nam 1996-2000, Nhà xuất Bản Đồ, Hà Nội Tiếng Anh 16 Anne-Charlotte Sentilhes, Vimatha Xaysitthideth, Sareth Rith, Somvay Ongkhamme, Thongchanh Bernatas, Vincent Sisouk,Darouny Deubel, Philippe Phonekeo, Jean-Jacques Buchy, Paul Brey, Phengta Vongphrachanh (2011) "Identification of viruses in Acute Lower Respiratory Infections (ALRI) in Lao People's Democratic Republic" BMC Proc 2011; 5(Suppl 1): P74 17 Beckett CG., Kosasih H., Ma'roef C., Listiyaningsih E., Elyazar IR., Wuryadi S., Yowono D., McArdle JL., Corwin AL., Porter KR (2004) "Influenza surveillance in Indonesia: 1999-2003", Clinical Infectious Disease, 39: 443-449 77 18 Besselaar TG, Botha L, McAnerney JM, Schoub BD (2004) "Antigenic and molecular analysis of influenza A (H3N2) virus strains isolated from a localised influenza ourbreak in South Africa in 2003", J Med Virol., 73: 7178 19 Carr J., Ives J., Kelly L., Lambkin R., Oxford J., Mendel D., Tai L., N, Roberts (2002) "Influenza virus carrying neuraminidase with reduced sensitivity to oseltamivir carboxylate has altered properties in vitro and is compromised for infectivity and replicative ability in vivo", Antiviral Res, 54: pp 79-80 20 Centers for Disease Control and Prevention (April 25-29,2005) Modern Methods for Influenza Detection and Subtyping, Atlanta, Georgia 21 Centers for Disease Control and Prevention (August 13-14, 2003) "Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis", Surveillance Coordinator's Conference Atlanta, Georgia, US 22 Clinton S Robbins, Carla M T Bauer, Neda Vujicic, Gordon J Gaschler, Brian D Lichty, Stämpfli., Earl G Brown and Martin R (2006) "Cigarette Smoke Impacts Immune Inflammatory Responses to Influenza in Mice ", American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 174: 1342-1351 23 Echevarria JE, et al (1998) J Clin Microbiol, 36: 1388-1391 24 Ellis JS, Smith JW, Braham S, Lock M, Barlow K, MC, Zambon (2007) "Deign and validation of an H5 Taqman real-time one-step reverse transcription-PCR and confirmatory assays for diagnosis and verification of influenza A virus H5 infections in human," J Clin Microbiol, 45(1535-1543) 25 Enders Ko Ng, Preter KC Cheng, Antia YY Ng, Hoang, TL, Lim, and William WL (2005) "Influenza A H5N1 detection", Emer Inf Dis, 11: 13031305 26 Fabrice Carrat, Juliette Deshayes, Isabelle Goderel, Gregory Pannetier, Valleron., Céline Lazarovici and Alain-Jacques (June 2004) "Factors 78 associated with intensity of symptoms in patients seeking medical advice for flu", International Congress Series, 1263: 308-311 27 Fay H Johnston, Anne M Kavanagh, Scott, David M J S Bowman and Randall K (2002) "Exposure to bushfire smoke and asthma: an ecological study", The Medical journal of Australia, 176(11): 535-538 28 Gibson UEM, Heid CA., Williams PM.(1996) "A novel method for real time quantitative RT-PCR", Genome Res, 6: 995-1001 29 Glezen, W P (1977) "Pathogenesis of bronchiolitis: epidemiologic considerations", Pediatr Res 11: 239 - 243 30 Glezen, W P., F W Denny (1973) "Epidemiology of acute lower respiratory disease in children", N Engl J Med, 288: 498 - 505 31 Guy Boivin MD.(2002) Update on human metapneumoniavirus, Laval University, Quebec City, Canada 32 Hampson AW (1999) "Epidemiological data on Influenza in Asian countries", Vaccine, 17(19-23) 33 Harmon MW., PA Rota, HH Walls, and AP Kendal (1988) "Antibody response in humans to influenza virus type B host cell-dirived variant after vaccination with standard (egg-devired) vaccine or natural infection", J Clin Microbiol, 26: 333-337 34 Herlocher ML., Carr J., Ives J., Elias S., Truscon R., Roberts NA., Monto AS (2002) "Influenza virus carring an R292K mutation in the neuraminidase gene is not transmitted in ferrets", Antivial Res, 54(p.99-111) 35 Herlocher ML., Truscon R., Elias S., Yen HL., Roberts NA., Ohmit SE., Monto AS (2004) "Influenza viruses resistant to the antiviral drug oseltamivir: transmission sudies in ferrets", J Infect Dis, 190: pp.1627-1630 36 Hien T Nguyen, Nila J Dharanb, Mai T.Q Le, Nguyen B Nguyen, Chung T Nguyen, Dong V Hoang, Huu N Tran, Chien T Bui, Dat T Dang, Dinh N Pham, Hoa T Nguyen, Tu V Phan, David T Dennis, 79 Timothy M Uyeki, Joshua Mottb, Nguyen Yen T (2010) "National influenza surveillance in Vietnam, 2006–2007", Vaccine, 28: 398-402 37 Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, R, and Watson (1993) "Kinetic PCR analysis; real time monitoring of DNA amplification reaction", Biotechnology (NY), 11(1026-1030) 38 Hiroshi Kida, Yoshihiro Sakoda (2004) "Fortieth Anniversary United States-Japan cooperative medical science program", p4 39 Hirst GK (1942) "The quantitative determination of influenza virus and antibodies by means of red cell agglutination", J.Exp.Med., 75: 47-64 40 Holmes EC, E Ghedin, N Miller, J Taylor, Y Bao, KS George, BT Grenfell, SL Saizberg, CM Fraster, DJ Lipman and JK Taubenberger (2005) " Whole-genome analysis of human influenza A virus reveals multiple persistent lineages and reassortment among recent H3N2 viruses", PLoS Biol, 3: 1579-1588 41 http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_protein/33.html 42 Hui-Ling Yen, Louise M.Herlocher, Erich Hoffmann, Mikhail N., Matrosovich, Arnold S.Monto, Roberts G.Webster, and Elena A.Govorkova (2005) "Neuraminidase Inhibitor-Resistant Influenza Viruses May Differ Substantially inFitness and Transmissibility", Antimicrob Agents Chemother, 49 (10): 4075-4084 43 Ito., Couceiro JNSS., Kelm S., Baum LG., Krauss S., Castrucci MR., Donatelli I., Kida H., Paulson JC., Webster RG., and Kawaoka Y (1998) "Molecular basc of the genratin in pigs of influenza A viruses with pandemic potential", J Virol, 72: 7367-7373 44 Ives J., Carr J., Mende DB., Tai CY., Lambkin R., Kelly L., JS., Oxford, Hayden FG., Roberts NA (2002) "The H274Y mutation in the influenza A/H1N1 neuraminidase active site following oseltamiver phosphate treatment leave virus severely compromised both in vitro and in vivo", Antivial Res, 55: 307 80 45 Jeremy D Kark, M.D., Ph.D., , Moshe Lebiush, M.D., and Lotte Rannon, M.D (October 21, 1982) "Cigarette Smoking as a Risk Factor for Epidemic A(H1N1) Influenza in Young Men," N Engl J Med 307: 10421046 46 Jeremy D.Kark, Moshe lebiush (1981) "Smoking and epidemic influenzalike Illness in female military recruits: a brief survey," AM J Public health, 71: 530-532 47 John Ridley Pattison, Richard J Whitley (2002) Clinical Virology Second Edition John Wiley and Sons 90-101 48 Kanti Pabbaraju, Kara L Tokaryk, Sallene Wong, Julie D Fox (2008) "Comparison of the Luminex xTAG Respiratory Viral Panel with In-House Nucleic Acid Amplification Tests for Diagnosis of Respiratory Virus Infections ", J Clin Microbiol 2008 September; 46(9): 3056–3062 49 Kanti Pabbaraju, Sallene Wong, Kara L Tokaryk, Kevin Fonseca, Steven J Drews (2011) "Comparison of the Luminex xTAG Respiratory Viral Panel with xTAG Respiratory Viral Panel Fast for Diagnosis of Respiratory Virus Infections", J Clin Microbiol 2011 May; 49(5): 1738– 1744 50 Kim, H W., J O Arrobio, C D Brandt (1973) "Epidemiology of respiratory syncytial virus infection in Washington, D.C I Importance of the virus in different respiratory disease syndromes and temporal distribution of infection" Am J Epidemiol, 98: 216 - 225 51 Knipe, David M, Howley, Peter M (2007) Fields Virology, 5th Edition,Lippincott Williams and Wilkins, II(II), Specific Virus Families, 48 52 Huey-Pin Tsai, Pin-Hwa Kuo, Ching-Chuan Liu, Jen-Ren Wang (2001) "Respiratory Viral Infections among Pediatric Inpatients and Outpatients in 81 Taiwan from 1997 to 1999", J Clin Microbiol 2001 January; 39(1): 111– 118 53 Leslie collier, John Oxford (1993) Human virology: A text for students of medicine dentistry and microbiology, Oxford University Press: 107-137 54 Li KS, Y Guan, J Wang, GJD Smith, KM Xu, L Duan, AP Rahardjo, P Puthavathana, Buranathai C, Nguyen TD, Estoepangestie ATS, Chaisingh A, Auewarakul P, Long HT, Hanh NTH, Webby RJ, Poon LLM, Chen H, Shortridge KF, Yuen KY, Webster RG and Peiris JSM (2004) "Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia", Nature, 430: 209-213 55 Masahiro Ito, Masahiro Wantanabe, Naoko Nakagawa, Toshiaki Ihara, Okuno, Yoshinobu (2006) "Rapid detection and typing of influenza A and B by Loop-mediated isothermal amplification; comparision with immunochromatography and virus isolation", Journal of Virological Methods, 135 (2): 272-275 56 Mizuta K, Abiko C, Aoki Y, Suto A, Hoshina H, Itagaki T, monthly isolation of respiratory viruses from children by cell culture using a microplate method: a two-year study from 2004 to 2005 in yamagata, Japan", Jpn J Infect Dis 2008 May;61(3):196-201 57 Modified from Halonen P, et al (1995) J Clin Microbiol 33: 648-653 58 Murphy BR., El Tierney, BA Barbour, RH Yolken, DW Alling, HP Holley, Chanok, RE mayner and RM (1980) "Use of enzyme-linked immunosorbent assay to detect serum antibody responses of volunteers who received attenuated influenza A virus vaccines", Infect Immu, 29: 342-347 59 N J Cox., K Subbarao (2000) “Global epidemiology of Influenza, Past and Present”, Annu Rev Med, 51: 407-21 60 Nagamine K, T Hase, Notomi, and T (2002) "Accelerated reaction by loop mediated isothermal amplification using loop primers", Mol Cell, Probes 16: 223-229 82 61 Niigata Prefectural Institute of Health and Environmental Sciences (2005) "Manual on Investigation of Virus, Virology Section", Ver 2.1 62 Noble GR (1982) Epidemiological and clinical aspects of influenza, In basic and Applied Influenza Research, ed AS Beare: 11-50 63 Notomi T, H Okayama, H Masubuchi, T Yonekawa, K Wantanabe, N Amino, Hase, and T (2002) "Loop-mediated isothermal amplification on DNA", Nucleic Acid Res, 28: 63 64 Pandemic (H1N1) 2009 Virus Revisited: an Evolutionary Retrospective Infect Genet Evol 2011 July; 11(5): 803–811 65 Paul Digard (update April 8, 2009) Orthomyxovirus, Avaiable from: http://www.microbiologybytes.com/virology/Orthomyxoviruses.html 66 Piechulek H., Al-sabbir A et al (2003) "Diarrhea and ARI in rural areas of Bangladesh", Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health, 34(2): 337-342 67 Philip A Chan, Leonard A Mermel, Sarah B Andrea, Russell McCulloh, John P Mills, Ignacio Echenique, Emily Leveen, Natasha Rybak, Cheston Cunha, Jason T Machan, Terrance T Healey, and Kimberle C Chapin (2011) " Distinguishing Characteristics between Pandemic 2009–2010 Influenza A (H1N1) and Other Viruses in Patients Hospitalized with Respiratory Illness", PLoS One 2011; 6(9): e24734 68 Reid AH., Fanning TG., Hultin JV et al (1999) "Origin and evolution of the 1919 “Spanish” influenza virus hemagglutinin gene", Proc Natl Acad Sci USA, 96: 1651-56 69 Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2012 southern hemisphere influenza season Weekly Epidemiol Rec 2011 Oct 12;86(42):457-68 70 Robert L Atmar, Pedro A Piedra, Shital M Patel, Stephen B Greenberg, Robert B Couch, W Paul Glezen (2011) “Picornavirus, the 83 Most Common Respiratory Virus Causing Infection among Patients of All Ages Hospitalized with Acute Respiratory Illness” J Clin Microbiol 2012 February; 50(2): 506–508 71 Selwyn B.J (1990) "The epidemiology of acute respiratory tract infections young children: comparison of finding from several developing countries", Rev.Infect.Dis, 8: 870-888 72 Simmerman JM., Thawatsupha P., Kingnate D., Fukuda K., Chaising A., Dowell SF (2004) "Influenza in Thailand: a case study for middle income countries", Vaccine, 23: 182-187 73 Steinhauer DA (1999) "Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus", Virology, 258: p1-20 74 Stuart-Harris CH., Schild GC., JS, Oxford (1985) Influenza The virus and the Disease, Vitoria, Can.: Edward Arnold, 2nd ed.:118-38 75 Taubenberger JK Reid AH., Krafft AE et al (1997) “Initial genetic characterization of the 1918 “Spanish” influenza virus” Science, 275: 179396 76 Thai H.T.C, MQ., Le, Vuong CD, Parida M, Minekawa H, Notomi T., Hasebe F., and Kouichi Morita et al (2004) "Development and Evaluation of a novel Loop-mediated isothermal amplification method of rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus", Journal of the Clinical Microbiology, 42: 1956-1961 77 Thomas Rowe, Robert A Abernathy, Jean Hu-Primer, William W Thompson, Xiuhua Lu, Wilina Lim, Keiji Fukuda, Katz, Nancy J Cox and JM (1999) "Detection of antibody to avian influenza A/H5N1 virus in human serum by using a combination of serologic assays", J Clin Microbiol, 37 (4): 937-943 78 Tung Nguyen (2009) "Evolution of H5N1 viruses in Vietnam and vaccine efficacy against virus changes", Report, Hanoi 84 79 World Health Organization (1998) "Acute respiratory infections: a forgotten pandemic", Bull World Health Organization, 76: 101-103 80 World Health Organization (2003) "Influenza in the world", Weekly Epidemiological Rec., 78: 393-396 81 Y.Numazaki, Oshitani, H (1993) Laboratory manual of a microplate method for virus isolation 82 Yang L, Wong CM, Lau EH, Chan KP, Ou CQ, Peiris JS (2008) "Synchrony of clinical and laboratory surveillance for influenza in Hong Kong", PLoSONE 3(1): e1399 83 Yang P., Duan W., Lv M., Shi W., Peng X., Wang X., Lu Y., Liang H., Seale H., Pang X., Wang Q (10/2009) "Review of an influenza surveillance system, Beijing, People's Republic of China", Emerg.Infect.Dis, 15: 1603-1608 84 Yoshida LM., Suzuki M., Yamamoto T., Nguyen HA., Nguyen CD., Nguyen AT., Oishi K., Vu TD., Le TH., Le MQ., Yanai H., Kilgore PE., Dang DA., K, Ariyoshi (2010) "Viral pathogens associated with acute respiratory infections in central Vietnamese children", Pediatr Infect Dis J 2010 Jan, 29(1): 75-77 85 Yuanji G (2002) "Influenza activity in China: 1998-1999", Vaccine, 20(2855) 86 Leowski J Mortality from acute respiratory infections in children under years of age: global estimates World Health Stat Q 1986;39:138–44 85 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Chi tiết số quy trình thực nghiên cứu 1.Tách chiết vật liệu di truyền ARN Trộn 140µl mẫu (dịch phân lập thu hoạch được) với 560 µl đệm AVL Ủ nhiệt độ phịng 10 phút Thêm 560 µl Ethanol (100%) vào hỗn dịch trên, lắc máy vortex Đặt cột QIAamp spin vào tuýp ly tâm 2ml Chuyển 630µl hỗn dịch vào cột QIAamp spin Ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút Loại bỏ tuýp ly tâm Lặp lại bước (3) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp ly tâm 2ml sạch, rửa cột QIAamp spin 500µl dung dịch đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút Loại bỏ tuýp ly tâm Đặt cột QIAamp spin vào tuýp ly tâm 2ml sạch, tiếp tục rửa cột QIAamp spin 500µl dung dịch đệm AW2, ly tâm 14000 vòng/phút/3 phút Loại bỏ dung dịch tuýp ly tâm Đặt cột QIAamp spin vào tuýp ly tâm vừa loại bỏ dung dịch Ly tâm 14000 vòng/phút/1 phút Loại bỏ tuýp ly tâm Đặt cột QIAamp spin vào tuýp ly tâm 1,5ml Cho 60µl dung dịch đệm AVE, ủ nhiệt độ phòng phút, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút Loại bỏ cột QIAamp spin Phần dung dịch thu tuýp ly tâm ARN chủng virút thu thập 2.Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HAI Chủng vi rút cúm, kháng nguyên chuẩn A/H1N1 đại dịch, H3N2, B trước thực phản ứng HI phải chuẩn độ hiệu giá HA đơn vị, sử dụng kit HI WHO cung cấp,  Xử lý kháng huyết RDE Thêm RDE vào kháng huyết theo tỷ lệ 3:1, ủ 370C 20h 86 Bât hoạt RDE nhiệt độ 560C Bổ sung nước muối lần thể tích RDE để pha lỗng KHT  Hấp phụ hồng cầu Kháng huyết xử lý RDE hấp phụ hồng cầu đặc theo tỷ lệ 10:1 Ủ nhiệt độ phòng, ly tâm 2000 vòng/ phút 10 phút Loại bỏ hồng cầu  Phản ứng HAI Sử dụng phiến 96 giếng Thêm 25 µl PBS vào giếng từ hàng B đến hàng H (B1-B12, C1-C12, đến H1-H12) Nhỏ 50 µl kháng huyết A/H1N1 đại dịch, H3N2, B xử lý vào giếng đầu cột 1,2,3 (A1, A2, A3) Giếng đầu cột nhỏ 50 µl PBS (A4) Pha lỗng kháng huyết cách lấy 25 µl từ giếng đầu chuyển xuống hàng (A1-H1, A2-H2…) Bỏ 25 µl hàng H Nhỏ 25 µl kháng nguyên vào giếng, ủ nhiệt độ phòng giờ, nhỏ 50 µl hồng cầu vào tất giếng, ủ giờ, đọc kết HI Tổng hợp ADN bổ trợ Hỗn hợp Hỗn hợp Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl) Mồi Uni12 Đệm 5X dNTP DTT ARN 10 ARNse Inhibitor 1 Expand RT Tổng Tổng 16 87 Điều kiện nhiệt cho hỗn hợp 1: 650C / phút, chuyển lên đá / phút Hỗn hợp + hỗn hợp 2, ủ 430C / 45 phút, 700C / 15 phút PCR sản phẩm cDNA Thành phần phản ứng Thành phần Thể tích (ul) Đệm 5X 10 dNTP Mồi xuôi (100pmol) 0,5 Mồi ngược (100pmol) 0,5 Enzyme 0,3 cDNA Nước cất tinh 31,7 Tổng 50 Tinh sản phẩm PCR (1) Trộn thể tích đệm PB vào thể tích sản phẩm PCR có (2) Đặt cột Qiaquick vào tuýp 2ml (3) Dùng pipet chuyển toàn hỗn dịch trộn bước (1) vào cột Qiaquick, ly tâm 13000 vòng/phút/1 phút (4) Loại bỏ dung dịch tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp (5) Dùng pipet chuyển 750µl đệm PE vào cột Qiaquick để rửa ADN, ly tâm 13000 vòng/phút/1 phút (6) Loại bỏ nước tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp, ly tâm 13000 vòng/phút/1 phút (7) Chuyển cột Qiaquick sang tuýp 1,5ml (8) Cho 30µl đệm EB vào màng lọc cột Qiaquick để thu ADN, ủ nhiệt độ phòng phút, ly tâm 13000 vòng/phút/1phút ADN sau tinh giữ -200C đến -800C 88 Cycle Sequencing Thành phần phản ứng Thành phần Thể tích (µl) Terminator Ready Reaction Mix ADN Mồi (3,2 pmol) xuôi ngược Nước cất tinh Tổng 20 Ly tâm nhẹ hỗn hợp phản ứng trước cho vào máy PCR Phụ lục 2: Gây nhiễm vi rút cúm lên tế bào Tế bào MDCK lớp trước gây nhiễm 89 Tế bào MDCK sau ngày gây nhiễm virút cúm Phụ lục 3: Trình tự nucleotide Gen HA A/Vietnam/HP-SARI2095/2011 (H1N1pdm) Gen HA A/Vietnam/HP-SARI20216/2012 (H1N1pdm) Gen HA B/Vietnam/HP-SARI20201/2012 90 Gen HA B/Vietnam/HP-SARI20154/2012 91 ... cứu: ? ?Tìm hiểu nguyên vi rút gây vi? ?m đường hô hấp cấp số bệnh nhân điều trị bệnh vi? ??n đa khoa Vi? ??t Tiệp - Hải Phòng 2010- 2012? ?? Với mục tiêu: Xác định tác nhân vi rút gây vi? ?m đường hô hấp cấp bệnh. .. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN VŨ SƠN TÌM HIỂU CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY VI? ?M ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ Ở BỆNH VI? ??N ĐA KHOA VI? ??T TIỆP HẢI PHÒNG 2010 - 2012 Chuyên... động bệnh vi? ??n vi rút gây VĐHHC, tiến hành xây dựng nghiên cứu ? ?Tìm hiểu nguyên vi rút gây vi? ?m đường hô hấp cấp số bệnh nhân điều trị bệnh vi? ??n đa khoa Vi? ??t Tiệp Hải Phòng 2010- 2012? ?? 27 CHƢƠNG